共聚焦显微镜应用
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共聚焦显微镜应用
——细胞原位检测核酸
目录
▪ 概述
▪ PI的特性 ▪ PI的应用 ▪ PI标记细胞的方法
概述
激光扫描共聚焦显微术通过成像显示出细胞内核酸的分布特征
及含量，即实现定位、定性及定量检测核酸。该方法常用于细胞核 定位及其形态学观察、检测细胞内DNA的复制及断裂情况以及染色 体定位观察等。
荧光探针分子与核酸结合方式
▪ ①嵌入性结合方式
– 嵌入在DNA的两个碱基之间，每隔几个碱基嵌入一个荧光分子
▪ ②结构亲和方式
– 以静电力结合，正电荷荧光分子和带负电和的磷酸互相结合，极弱，常造成 荧光分子丢失
▪ ③共价键方式
– 使DNA链之间以原子结合的方式被打开，形成与荧光探针分子共价结合
碘化丙啶（PI）检测核酸
PI标记细胞的方法
▪ 样品为固定细胞
▪ 用含有PI 1~10μg/ml的PBS染色液（pH为7.2~7.4）标记，室温 标记5~15min，上机测定。若只要检测细胞内DNA时，则在上 述染色前还需要加人浓度为50 μg/ml的RNA酶，然后在37 ℃孵 育30分钟，以消化去除RNA,即可进行PI染色和DNA观察分析
PI标记细胞的方法
▪ 样品为活细胞
▪ 可直接向细胞外液中加人PI,使终浓度为1~15 μg/ml（根据细胞 种类及其密度而异），室温放置5~15min后，用激光扫描共聚焦 显微镜检测。 ▪ 细胞膜完好的正常活细胞，PI不能染色； ▪ 膜不完整的细胞及死细胞则可检测到PI的红色荧光，此时观察到 的是细胞内DNA和RNA的总量。该项检测最好在短时间内完成， ▪ 因PI也有一定的细胞毒性，长时间接触会损伤正常活细胞而进人 细胞内，造成实验假象
谢谢聆听
未完待续
楚河汉界
小鼠肠道及其中的人类肠道 微生物，63x
重影的林
小鼠耳部血管与神经网， 10x
无定形
拟南芥的幼芽，40x
谢谢欣赏
▪ PI的特性
– PI属于嵌入性荧光探针，可以嵌入到双 链DNA和RNA碱基对中与之结合，无
碱基特异性。这种结合方式紧密，稳
定。 – 通常，PI染色可以同时标记双链DNA 和RNA的总和；经过RNA酶处理除去 RNA的干扰后，可定性和定量DNA。 – PI另一特点是不能进入完整的细胞膜， 因此用于检测细胞的死活
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ PI应用
▪ PI标记可以是活细胞也可以是固定的细胞
▪ 当标记活细胞样品时，目的在于检查细胞的膜完整性及其坏死情 况，常应用于检测膜损伤、细胞凋亡；
▪ 标记固定细胞时，目的一般是进行细胞核定位、显示细胞核或染 色体的形态、定量测定核酸等，常应用于检测细胞周期、细胞凋 亡、RNA和DNA在细胞内的分布及其含量变化、以及用作核酸显 色剂
——细胞原位检测核酸
目录
▪ 概述
▪ PI的特性 ▪ PI的应用 ▪ PI标记细胞的方法
概述
激光扫描共聚焦显微术通过成像显示出细胞内核酸的分布特征
及含量，即实现定位、定性及定量检测核酸。该方法常用于细胞核 定位及其形态学观察、检测细胞内DNA的复制及断裂情况以及染色 体定位观察等。
荧光探针分子与核酸结合方式
▪ ①嵌入性结合方式
– 嵌入在DNA的两个碱基之间，每隔几个碱基嵌入一个荧光分子
▪ ②结构亲和方式
– 以静电力结合，正电荷荧光分子和带负电和的磷酸互相结合，极弱，常造成 荧光分子丢失
▪ ③共价键方式
– 使DNA链之间以原子结合的方式被打开，形成与荧光探针分子共价结合
碘化丙啶（PI）检测核酸
PI标记细胞的方法
▪ 样品为固定细胞
▪ 用含有PI 1~10μg/ml的PBS染色液（pH为7.2~7.4）标记，室温 标记5~15min，上机测定。若只要检测细胞内DNA时，则在上 述染色前还需要加人浓度为50 μg/ml的RNA酶，然后在37 ℃孵 育30分钟，以消化去除RNA,即可进行PI染色和DNA观察分析
PI标记细胞的方法
▪ 样品为活细胞
▪ 可直接向细胞外液中加人PI,使终浓度为1~15 μg/ml（根据细胞 种类及其密度而异），室温放置5~15min后，用激光扫描共聚焦 显微镜检测。 ▪ 细胞膜完好的正常活细胞，PI不能染色； ▪ 膜不完整的细胞及死细胞则可检测到PI的红色荧光，此时观察到 的是细胞内DNA和RNA的总量。该项检测最好在短时间内完成， ▪ 因PI也有一定的细胞毒性，长时间接触会损伤正常活细胞而进人 细胞内，造成实验假象
谢谢聆听
未完待续
楚河汉界
小鼠肠道及其中的人类肠道 微生物，63x
重影的林
小鼠耳部血管与神经网， 10x
无定形
拟南芥的幼芽，40x
谢谢欣赏
▪ PI的特性
– PI属于嵌入性荧光探针，可以嵌入到双 链DNA和RNA碱基对中与之结合，无
碱基特异性。这种结合方式紧密，稳
定。 – 通常，PI染色可以同时标记双链DNA 和RNA的总和；经过RNA酶处理除去 RNA的干扰后，可定性和定量DNA。 – PI另一特点是不能进入完整的细胞膜， 因此用于检测细胞的死活
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ PI应用
▪ PI标记可以是活细胞也可以是固定的细胞
▪ 当标记活细胞样品时，目的在于检查细胞的膜完整性及其坏死情 况，常应用于检测膜损伤、细胞凋亡；
▪ 标记固定细胞时，目的一般是进行细胞核定位、显示细胞核或染 色体的形态、定量测定核酸等，常应用于检测细胞周期、细胞凋 亡、RNA和DNA在细胞内的分布及其含量变化、以及用作核酸显 色剂