超滤膜的选择-美国颇尔公司

利用离心装置简化样本超滤

借助Pall公司离心装置，许多常用的核酸和蛋白质处理程序得以简化。对于体积在50µL到60mL之间的样本，这些离心装置能在短短几分钟时间内高效完成浓缩与脱盐处理。为确保非特异性低生物分子结合，并连续、高效（回收率通常应当高于90%）地回收目标分子，应选择适当的滤膜。

超滤方法

作为一种滤膜分离技术，超滤用于分离流体中极其细小的微粒以及溶解的分子。分离的主要依据在于分子大小，尽管其它因素（譬如分子形状以及所带电荷）也起着一定的作用。大于滤膜孔径的分子将被滞留在滤膜表面（而非被多微孔滤膜截留的聚合物基质中），并在超滤进程中被浓缩。

对比膜处理之外的其它技术（层析、透析、溶剂提取或者离心分离），超滤技术优势如下：

y对于分子的处理远比其它方法温和

y无需有机萃取，从而避免不稳定蛋白质的变性可能

y维持离子及pH环境不变

y快捷，成本相对低廉

y可在低温下进行处理（譬如在冷藏室中），而且

y效率很高，能够同时进行分子的浓缩和纯化处理

超滤滤膜的截留性质表现为截留分子量大小，其数值为：滤膜截留率为90％的稀释球形溶质（即：典型蛋白质）的近似分子量。然而，分子的形状能够直接影响滤膜对于此分子的截留。譬如，同样的滤膜孔隙，线性分子（例如DNA）可以通过，分子量相同的球形分子却将被截留。

超滤的三种常见应用：

1. 浓缩利用超滤技术，能够非常方便地进行稀释蛋白质或

DNA/RNA样本的浓缩处理，此浓缩处理非常温和（不会对DNA造成高达100千碱基对的剪切，也不会造成蛋白质中酶活性的损失），且非常高效（回收率常常高于90％）。

2. 脱盐及缓冲液置换（渗滤）利用超滤技术，能够非常方便、

高效地去除/置换盐分、去除清洁剂、分离游离分子和结合分子、去除低分子量材料或者快速地改变离子或pH环境。

3. 分馏对于分子量相近的两种分子，利用超滤技术不能将其

彻底分开。待分离的分子之间，必须在分子大小上相差至少一个数量级（10X），方能达成有效分离。在分馏中利用超滤技术，在诸多应用中效果很好，譬如：无游离蛋白质滤出液的制备，从DNA和蛋白质样本中分离未结合或游离的标记物，以及合成反应中PCR产物的纯化。

基于样本体积选择装置

表1

基于样本体积选择装置

装置样本体积

AcroPrep™ 384孔过滤板＜100 µL

AcroPrep 96孔过滤板＜350 µL

Nanosep®装置＜0.5 mL

Microsep™装置0.5 – 3.5 mL

Macrosep®装置 3 – 15 mL

Jumbosep™装置15 – 60 mL

基于应用选择滤膜

在各种广泛的应用挑战中，这些滤膜均表现出卓越的性能和稳定性：

y Omega™聚醚砜超滤滤膜－快捷的浓缩及脱盐处理

y Bio-Inert®改性尼龙及亲水性GHP （Pall公司专利所有）微细过滤滤膜－去除微粒物质（譬如凝胶碎片）

选择适当的截留分子量

一旦选定样本体积，接下来就是选择适当的截留分子量（对于超滤而言）或孔径（对于微细过滤而言）。作为额定值，截留分子量基于：对于分子量（以千道尔顿为单位）已知溶质90%以上的截留能力。表2中，列举了各种滤膜（不同截留分子量）对于一些溶质的截留性质。就蛋白质而言，建议选用的截留分子量，应小于欲截留溶质的分子量3到6倍。如果需要考虑流速，滤膜截留分子量的选择应当小于欲截留溶质的分子量3倍；如果重点关注截留，可以选择更加紧密的滤膜，即小于欲截留溶质的分子量6倍。

有必要认识到：多种因素决定了超滤滤膜对于分子的截留，其中，分子量只能作为一项概括的指标。因此，为特定应用选择适当的的截留分子量，需要综合考虑众多因素（包括：分子形状、分子所带电荷、样本浓度、样本成分以及操作条件）。

确定滤膜的截留分子量时，不同的滤膜制造商会使用不同的分子，由此，在特定应用中，有必要进行测试性试验，验证滤膜的性能。

提升分子通过率的常见参数：

y样本浓度低于1mg/mL

y线性（相对球形分子而言）

y离心浓缩器中离心加速度导致较高跨膜压（对于DNA片断之类线性分子而言特别重要。降低离心加速度，能够提高

滤膜对于分子的截留效率）

y有利于分子断裂的缓冲液组成

y改变分子的pH和离子环境（譬如：导致其构造改变或聚集）

降低分子通过率的常见参数：

y样本浓度高于1mg/mL

y允许分子聚集的缓冲液条件

y存在增加样本浓度的其它分子

y较低的跨膜压（就离心浓缩器而论，降低离心加速度）

y到滤膜或装置的吸附

y低温（相对于24℃而言的4℃）

对应各种不同的截留分子量，Pall Life Sciences离心装置备有各种颜色的编码，以方便选择。

表2

蛋白质应用中的截留分子量选择

截留分子量滤膜标称孔

径*

生物分子大小生物分子，分子量

1K 3K - 10K 3K 10K - 20K 5K 15K - 30K

10K 30K - 90K

30K 9K - 180K

50K 5 nm 15 – 30 nm 150K - 300K 100K 10 nm 30 – 90 nm 300K - 900K 300K 35 nm 90 – 200 nm 900K – 1,800K 1000K100 nm 300 – 600 nm ＞3000K

核酸应用中的截留分子量选择

截留分子量碱基对（DS）碱基（SS）

1K 5 – 16 Bp 9 – 32 Bs

3K 16 – 32 Bp 32 – 65 Bs

5K 25 – 50 Bp 50 – 95 Bs

10K 50 – 145 Bp 95 – 285 Bs

30K 145 – 285 Bp 285 – 570 Bs

50K 240 – 475 Bp 475 – 950 Bs

100K 475– 1,450 Bp 950 – 2,900 Bs 300K 1,450 – 2,900 Bp 2,900 – 5,700 Bs 1000K 4,800 – 9,500 Bp ＞9,500 Bs

病毒应用中的截留分子量选择

截留分子量滤膜标称孔径* 病毒或微粒的直径50K 5 nm 15 – 30 nm

100K 10 nm 30 – 90 nm

300K 35 nm 90 – 200 nm

1000K 100 nm 300 – 600 nm

*标称孔径应为电子显微镜下的具体测量结果（50K仅为估计值）

用于工艺放大的产品

y 96

孔或384孔的AcroPrep™过滤板，

适用于多路并行处理

y超滤滤膜片，提供更快流速和更高回

收率；并可用于常规的stirred cells搅

拌式超滤装置中（请参阅第62 - 63页）

y组装轻松的自主式Stirred Cell搅拌式超滤系统，处理样本体积从2毫升到150毫升（请参阅第60-61页）

y Minimate™及Ultrasette™ 切向流过滤器，快速处理从50毫升到5升体积的样本（请参阅第138和148页）

y Minimate及Ultralab™泵系统（请参阅第140和149页）

欲了解超滤更多相关信息，请参考第130-135页（“实验室生物制程”章节中）