基因功能研究方法.ppt

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2>.腺病毒(adenovirus, Adv): 为近年肝细胞肝癌基因 治疗中报告最多的一种病毒载体。装载外源基因容量 最大达35kb，不整合入宿主细胞基因组因而避免插入 突变的危险，能感染分裂细胞和非分裂细胞。但易引 起宿主免疫反应而使转染效率下降。
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3. 反义技术
反义技术是根据碱基互补原理,利用人工或生物合 成的特异互补的DNA 或RNA 片段(或其修饰产物) 来抑 制或封闭目的基因的表达。包括反义寡核苷酸技术(An tisense oligonuclerotides , ASON)、反义RNA技术 和核酶(Ribozyme)技术。
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最常用的为反义寡脱氧核苷酸（反义寡核 苷酸），其优点在于其理论上的高度靶特异性 （碱基互补）、设计容易、多样且合成简单及 高度的局部性和针对性。
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反义技术的两种技术路线
• 将表达与体内基因或mRNA互补序列的基因转入 体内，使细胞表达与目标基因互补的mRNA失活， 从而阻断目标基因的表达
• 体外合成mRNA互补的核苷酸类似物，通过静脉 注射等途径进入细胞，特异性的与目标mRNA作 用
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• 反义寡聚 核苷酸
• 与mRNA特 异性结合， 阻断翻译 过程
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4.基因敲除和敲入
4.1 基因敲除( Gene knockout ) 又称基因打靶 (genetargeting) ,是同源重组技术的形象说法。通过 一定的途径使特定的基因失活或缺失的技术。它是指用 外源DNA 与受体细胞基因组中顺序相同或者非常相近的 基因发生同源重组,整合到受体细胞基因组中并得到表 达的一种外源DNA 导入技术。
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优点：此技术整合位点确定、精确,转移基因频率较高, 既可以用正常基因敲除突变的基因,以进行性状的改良 和遗传病的治疗;又可以用突变的基因敲除正常的基因, 以研究此基因在发育和调控方面的作用。
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目前利用基因敲除得到转基因动物的程序可简述如下: (1) 克隆基因组中某一基因的全部或部分DNA 序列, 用 插入、删除、置换、修饰等手段重建DNA 序列,使之成 为靶载体; (2) 将靶载体导入小鼠的胚胎干细胞中,使外源DNA 与 胚胎干细胞基因组相应部分发生同源重组,将靶载体的 DNA 序列整合到内源基因组中;
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人工酵母染色体就是把酵母染色体上与基因复制 和表达有关的主要组件都组装在质粒上，令质粒行使 酵母的转录功能和复制功能。
YAC DNA 转导的方法主要有核注射、脂质体介导 和酵母原生质体融合等。采用YAC 转导基因的方式可 使导入基因的水平与内源基因相当,并且具有类似于天 然的剪接机理,适用于复杂的基因功能分析。
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基因敲入的设计,是一个类似于普通基因敲除法的 一步同源重组过程。不同之处在于,设计打靶载体时需 将靶基因第一个外显子的N-端序列缺失,并将新的替换 基因置于靶基因的调控序列之下,使其能精确地按照靶 基因的调控模式表达。此方法不仅能用一种基因置换 另一种基因,且可以系统地改变基因的结构,分析其蛋 白产物各功能区的作用。
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3.2 反义RNA技术 反义RNA 技术是利用基因重组技术,构建人工表达载 体,使其离体或体内表达反义RNA ,反义RNA 能与靶mRN A形成较稳定的二聚体,从而抑制靶基因的表达。其作 用机理可能在DNA 复制、转录及翻译多水平上抑制靶 基因的表达。
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3.3 核酶技术
核酶(Ribozyme) 技术是一类具催化活性的特殊RNA 分 子,通过碱基配对原则特异性灭活靶RNA 分子。可裂解 与其互补的mRNA及在DNA内插入DNA片段构成三链结构， 单个核酶分子可以结合多个mRNA 分子并使之在特定部 位断裂,而其本身具有较稳定的空间结构,不易受RNase 攻击,因而催化效率比反义RNA 高。常见的核酶有锤头 状、发夹状和斧头状三种,应用最多的是锤头状核酶。
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微阵列法分析过程 首先用来自不同生理状态和发育阶段的mRNA 作为
模板,以放射性同位素或荧光标记的dNTP为底物反转录 合成cDNA。再用所得cDNA与微阵列或DNA芯片进行杂交, 然后通过计算机对结果进行判读和处理,这样就可以知 道芯片中哪些基因在细胞里表达,哪些基因不表达;同 样也可以测知哪些基因的表达水平高,哪些基因的表达 水平低。
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发现精氨酸和一些疏水氨基酸的含量与编码序列 的( G + C) %表现出明显的正相关性,这个发现揭示了 蛋白热稳定性与DNA 热稳定性相一致的内在规律,阐明 了高( G+ C) %的生物适合于高温环境的机制。
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9 基因编码产物相互作用蛋白的研究
细胞各种基本功能的完成离不开蛋白质之间的相 互作用以及通过相互作用而形成的蛋白质复合物。 因 此，确定能够与新基因编码的蛋白质表达终产物相互 作用的上下游蛋白质分子，也是研究新基因功能的一 个十分重要的方面。
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生物学方法 (主要通过构建病毒载体来完成) 病毒表达载体:以病毒为载体介导的基因转移技术因其转
染效率高、目的基因可稳定表达等优势被广泛应用。 1>.逆转录病毒(retrovirus，Rv):构建简单，装载外源基因
容量最大达8kb，整合入宿主细胞基因组而无病毒蛋白 表达。但仅能感染分裂期细胞，体外制备滴度较低， 且其随机整合有引起“插入性突变”的可能。
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原理: 将成千上万条DNA片段(cDNA、表达序列标 签(expressed sequence tag ,EST) 或特异的寡核苷 酸片段) 按横行纵列方式有序点样在固相支持物上。 固相支持物为硝基纤维膜或尼龙膜时称为微阵列。固 相支持物改为指甲盖大小的玻片或硅片时所形成的微 阵列就称为DNA芯片。
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物理方法 1>. DNA直接注射法: 是目的基因导入的最简单方法, 但
注入量有限, 能够接触到的细胞有限,故获得的细胞转 化率很低, 多通过肿瘤局部多点注射给药。
2>. 颗粒轰击技术:将目的基因包被金属以后,利用高压 发射装置, 加速包裹目的基因的金属颗粒进入细胞,从 而提高肿瘤细胞的转化率。
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6.人工染色体的转导
转基因技术是进行蛋白功能分析和基因表达调控 的有力手段,但使用小的质粒重组体存在表达水平低、 缺乏组织特异性等缺点,若将大的DNA片段克隆入酵母 人工染色体( YACs)或细菌染色体，可产生较好的表达 水平和组织特异性,并可精确地调节同源重组。
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• 酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC) 是一类酵母穿梭载体。YAC具有自主复制序列、克隆位 点以及可在细菌和酵母菌中选择的标记基因。此外，Y AC还具有酵母菌染色体的一些特点。可以接受100-100 0kb的外源DNA片段。
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• 原位合成法：主要是美国Affymetrix公司开发的寡聚核苷 酸原位光刻DNA合成技术。
• 采用的技术原理是在合成碱基单体的5’羟基末端连上一个 光敏保护基，利用光照射使羟基端脱保护，然后逐个将5’ 端保护的核苷酸单体连接上去，这个过程反复进行直至合 成完毕。此方法的优点是合成循环中探针数目呈指数增长， 在1.6cm2面积上合成40万组寡核苷酸。
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8.新的晶体解析方法
结合已建立的大规模蛋白原核分泌表达与纯化技 术系统,将对大量新基因编码蛋白进行晶体培养，通过 计算机分析,以研究蛋白质结构和基因功能的方法。
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目前已成功制备了耐热邻苯二酚2 ,3-双加氧酶、 耐热碱性磷酸酯酶的蛋白质晶体,并收集了X-衍射数据. 在国内首次获得了硒化耐热邻苯二酚2 ,3-双加氧酶的 晶体,在日本的同步辐射光源上收集了3 个波长的分辨 率为2. 0 的衍射数据。另外,耐热碱性磷酸酯酶的多 对同晶置换法的结构解析也在进行之中.通过计算机分 析,对不同来源的木糖异构酶的( G+ C) %与蛋白质耐 热性之间的关系进行了研究。
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3.1 反义寡核苷酸技术 反义核苷酸是一类经人工合成或构建的反义表达载体 表达的寡核苷酸片段，长度多为15-30个核苷酸，通过 碱基互补原理，干扰基因的解旋、复制、转录、mRNA 的剪接加工乃至输出和翻译等各个环节，从而调节细 胞的生长、分化等。根据结合部位的不同分为反义DNA （asDNA）、反义RNA（asRNA）、自催化性核酶（ribo zyme）。
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化学方法 1>.脂质体载体：方法具有安全、简单、低毒、无免疫原
性等优点，适用于注射方法进行器官靶向性转移并有 一定的转移效率。是除病毒载体转移方法之外的另一 种有价值的体内基因转移方法。
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2>.受体介导法：利用肝细胞上富含转移因子和糖蛋白受 体的特点，人工合成多聚阳离子氨基酸，进而连接转 移因子(或糖蛋白)和目的基因构成复合物，通过与肝 细胞表面的受体结合来实现目的基因的转移。 优点:靶向性好，但受体介导的内吞小泡会被转运到溶 酶体，易被溶酶体降解而造成目的基因表达时间短暂， 表达效率低下。利用腺病毒与内吞小泡相融合而将其 破坏释放出外源DNA，可提高转化效率。
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酵母人工染色体(适用于克隆大片段DNA，0.2～2Mb。)
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YAC 要具备的主要功能成份
• 1）着丝粒：mitosis姊妹染色单体和减I同源染色 体分离之必需。
• 2）端粒：保护染色体末端免受核酸酶的侵袭。 • 3）自主复制序列（ARS）元件：是染色体自主复制
的复制起点。 • 构建YAC需要4个短序列：2个端粒，着丝粒，ARS元
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(3) 将胚胎干细胞受体细胞注入小鼠的囊胚,将这些囊 胚导入假孕母鼠子宫中,产生的雄性嵌合鼠子代与正常 的雌鼠交配即可获得生殖系统携带该基因的纯合鼠,进 而分析被剔除基因的功能。
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4.2 基因敲入 基因敲除技术已经成为研究基因功能的强
有力手段,但对于许多基因来说,简单的失活常导致令 人费解的无改变的表型。最常见的解释是某些其它基 因取代了靶基因的功能,但要在普通基因敲除小鼠中证 明这一点十分困难。基因敲入即通过基因打靶用一种 基因替换另一种基因以确定它们是否具有相同功能。