发光细菌毒性试验在水质监测与评价中的应用(精)

全国水体污染控制、治理技术与突发性水污染事故应急处理高级研讨会

发光细菌毒性试验在水质监测与评价中的应用

张绮王克波赵人王争

南京２１００２９南京医科大学公共卫生学院

摘要：发光细菌毒性试验已广泛应用于水质监测中。本文主要概述了发光细菌的分类、发光细菌毒性检测原理及其在工业废水、城市污水及河流等水域的水质综合毒性评价的应用。

关键词：发光细菌；水质监测；综述

随着工农业的不断发展，当今世界面临日益严重的环境污染问题，水污染尤为突出。水中污染物种类繁多，性质复杂，且污染物之间可发生协同、相加或拮抗等复杂作用。传统的水质检测虽能准确定量分析污染物中主要成分及含量，但不能检测水中各种污染物对环境和生物产生的综合毒性。发光细菌毒性试验因其独特的生理特性，与现代光电检测手段结合具快速、灵敏、简便等特点，检测结果可反映水中污染物的综合毒性，比测定单一组分污染物更具实际意义。

１．发光细菌的分类及其生物毒性检测用商品种类

发光细菌属革兰氏阴性、兼性厌氧菌，大小约０．４一１．Ｏ×１．０—２．５ｕｍ。无孢子、荚膜，有端生鞭毛一根或数根，最适温度２０—３０＂Ｃ，ｐＨ６～９，ＮａＣｌ浓度３％，０．３％的甘油对发光反应有利。其分类目前普遍采用美国学者ＥＢａｕｍａｎｎ的方法【ｌ’２１，见表１。

表１发光细菌的分类

大多用明亮发光杆菌、鲳鱼发光杆菌及费氏弧菌作有毒有害物急性毒性效应的检测。检测时测试体系中须加入较高浓度的盐以维持其正常生存，大量氯离子的存在会在相当程度上影响样品中一些污染物的生物可利用性和毒性顺序。由我国学者分离的淡水型发光青海弧菌则具有较广泛的酸碱和温度适应性，可在蒸馏水中正常发光，使测试体系得到简化【引。

发光菌除用于急性毒性效应检测外，其发光菌经过处理以后的暗变异株在接触致突变物后可恢复一定的发光能力，通常可使暗变株的发光强度增加１０００倍左右。因此利用暗变异株恢复发光的现象可对各种遗传毒物进行筛选、检测。这类菌株有鲳鱼发光杆菌暗变株ＳＤ．１８、ＲＣ．９３，费氏弧菌暗变异株Ｐｆ－１３，明亮发光菌暗变种＂１＂９１７１等。

目前发光细菌毒性检测有３种方法，即发光菌新鲜培养物测定、发光菌冷冻干燥制剂测定及发光菌与海藻混合测定的方法。新鲜培养的发光细菌其培养条件很难限制在同一水平上，这会造成发光细菌对１３０

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有毒物质的敏感性不一致，导致重复性差且操作麻烦。而发光细菌冷冻干燥制剂可以避免以上问题，将其贮存于冰箱中，使用相对方便。

２．发光细菌毒性试验检测原理

发光细菌的发光现象是其正常的代谢活动，不同种类的发光机理是相同的，其主要的过程概括如下：ＲＣＨＯ＋０２＋ＦＭＮＨ扣卫＞ＲＣＯＯＨ＋ＦＭＮ＋Ｈ２０＋ｈｖ（４９０ｎｍ）

茵细胞内由黄素单核苷酸（ＦＭＮＨ２）、长链脂肪醛（ＲＣＨＯ）及氧（０２）参与。在细菌荧光素酶（Ｅ）的催化下发生生化反应，产生波长多为４６５～４９０ｎｍ的磷光。外界条件和培养基成分以及温度、ｐＨ、氧浓度变化会影响细菌的发光。温度影响细胞内化学反应速率、生物吸收基质过程和发光细菌的生理状态。温度越高，抑制浓度越低，即响应越灵敏１４】。ｐＨ则影响发光细菌的代谢或造成化学品的水解，随着ｐＨ的变化，化学品毒性表现出增加或减弱［５１。有毒的化学物质、重金属离子、抗生素、化学治疗剂、农药等污染物质也会影响细菌发光。这类物质抑制细菌发光的途经有两个：一是直接抑制参与发光反应的酶类活性；另一方面是抑制细胞内与发光反应有关的代谢过程。因此能够干扰或破坏发光细菌呼吸、生长、新陈代谢等生理过程的任何有毒物质都可以根据发光程度的变化来测定。

发光细菌法【６】就是利用灵敏的光电测量系统测定毒物对发光细菌发光强度的影响。毒物的毒性可以用ＥＣ５０表示，即发光细菌发光强度降低５０％时毒物的浓度。一般情况下有毒物质和与发光菌接触时，发光强度立即发生变化。并随着毒物浓度的增加而发光减弱，即发光抑制。因而可以根据发光强度判断毒物毒性大小。

３．发光细菌水质检测方法

３．１样品采集及处理

自美国上世纪７０年代首次分离到ＰｈｏｔａｂａｃｔｅｒｉｕｍＰｈｓｐｈｏｒｅｕｍ细菌并用于污水监测获得成功以来，３０多年中，成功用于多种类型污染物监测【７１尤其是各类水质毒性检测。如工业废水、城市污水、河流海洋水质等。试验中样品的采集及处理有直接采样和半渗膜被动式采样（ＳＰＭ）两种方式。直接采样一般用四氟乙烯衬垫的塑料瓶采样。采集一定水样量后，根据需要对水样进行预处理。如要可用ＮａＯＨ和ＨＣＩ调节水样ｐＨ值在６．０～８．０之间，实验前将样品稀成不同浓度直接测定。半渗膜被动式采样是用ＳＰＭＤ采样器采样。将ＳＰＭＤ采样器固定于水面下ｌｍ处，暴露２８天，收回ＳＰＭＤ样品，将水样经０．４５ｕｍ膜后，用二氯甲烷萃取，净化和浓缩后用高纯氮气干后用ＤＭＳＯ溶解，低温保存样品。这种采样技术可以富集到水样中的

有机有毒污染物，从而评价样品中有毒有机物含量及急性毒性的变化规律【８１。

３．２发光检测仪器

２０世纪８０年代初美国Ｂｅｃｋｍａｎ公司推出功能完备的生物毒性测试仪，它具有应用范围广，灵敏度高，相关性好，反应速度快等优点，在世界范围内广泛使用。我国于１９９５年将发光细菌法列为环境检测的标准方法（ＧＢ／Ｔ１５４４１．１９９５），使用国产的ＤＸＹ．２型生物毒性测试仪，或ＳＨＧ．１型生物发光测量仪。美国ＭＩＣＲＯＢＩＣＳＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ也推出Ｍｉｃｒｏｔｏｘ２０５５型毒物分析系统１９１。为克服细菌发光强度本底差异较大、检测期间发光自然变化幅度宽、操作繁琐、重现性不佳、误差较大等不足，我国学者也研究细菌发光传感器进行污染物急性毒性快速检测，将细胞固定化技术、生物传感器技术与发光细菌毒性测试技术有机结合起来，改善了细菌发光的稳定性，实现急性毒性的快速检测ｌｌｏ】。

３．３发光细菌毒性试验结果表达

往往以相对发光率、相对抑光率、ＥＣ如表达发光细菌毒性试验结果。相对发光率＝样品光强度，对照光强度×１００％，相对抑光率＝（对照光强度．样品光强度）／对照光强度×１００％。ＥＣｓｏ为相对抑光率达到５０％的样品浓度（或稀释度）。根据测定结果判定毒性待测样品急性毒性的大小。其判定标准有三种方式：①有毒，无毒；②百分数等级；③对数等级。国内多数采用百分数等级，百分数等级可根据相对发光率的大小及等当ＨｇＣｌ２溶液浓度来判定待测样品的毒性大小，也可以用ＥＣｓｏ判定待测样品的毒性大小，具体见表２、表３。１３１

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表２发光细菌试验相对发光率毒性百分数等级

等级

Ｉ

ＩＩ

ＩＩＩ

ＩＶ

Ｖ相对发光率（Ｌ）（％）Ｌ＞７０等当的ＨｇＣｌ２溶液浓度Ｃ（ｍｇ／Ｌ）ＣＨｇ＜０．０７毒性级别低毒中毒重毒高毒剧毒５ｔＹ＜Ｌ≤７０３０＜Ｌ≤５００＜Ｌ≤３００．０７、＜ＣＨｇ＜０．０９０．０９≤ＣＨｇ＜０．１２０．１２≤ＣＨｇ＜０．１６ＣＨｇ＞０．１６Ｌ卸

表３发光细菌试验ＥＣ５０或ＬＣｓｏ毒性百分数等级

４．发光细菌毒性在水质监测及评价中的具体运用

４．１工业废水综合毒性测定