【VIP专享】各类型胶原的分离方法

　综述评论　

各类型胶原的分离方法

郭　云

北京奥弛坦登新技术公司,北京,100084

张景锡

北京科技大学材料学院,北京,100084

彭必先

中国科学院理化技术研究所,北京,100101

1　Ⅰ型胶原

1.1　从成年家兔提取[1]

由耳静脉注入空气致死,迅速剥下兔皮,去毛及皮下脂肪,称重,然后将皮肤放入冰中(下述各步骤除特殊说明外,均在4℃下进行)切碎,用绞肉机将其绞成肉泥状,置入烧杯中,加入2.5倍量的中性盐提取液(0.1M T ris ,0.2M NaCl ,0.1m M E DT A ,pH 7.6)。搅拌2～3h 后,以12,000g (g -重力加速度)离心30min ,弃上清液,沉淀部分加入2.5倍量的3%冰醋酸(H Ac )溶液,抽取搅拌过夜;以20,000g 离心90min 。所得胶原经盐析沉淀、

低离子强度沉淀、加热致凝胶化、超速离心、三氯醋酸-乙醇沉淀5个步骤进行胶原纯化。Ⅰ型胶原的纯化:由于各型胶原可被不同浓度NaCl 所沉淀,将胶原溶液对pH 7.3,

0.1M T ris 缓冲液透析,更换透析液直至平衡,

液体的pH 仍维持中性;加入5.1M NaCl 至终浓度为1.7M ,搅拌过夜;以18,000g 离心30min ,弃沉淀(此部分为Ⅲ型胶原)。上清液

加入4.0M NaCl 至最终浓度为2.5M ,搅拌过夜。以22,000g 离心30min ,沉淀溶解于1%H Ac 溶液中,对1%H Ac 透析,然后反复此过程。最后所得胶原溶解于1%H Ac 溶液中。对1%H Ac 反复透析,真空冷冻干燥,称重,保存于-20℃冰箱中。

1.2　从人胎盘提取[2]

取新鲜正常人胎盘2只,胎盘去脐带和羊膜、捣碎、匀浆;4℃下胃蛋白酶消化20h (每

20g 湿重组织加入0.05%胃蛋白酶、0.5m ol/L 醋酸100m L );清化上清液(酸性)中加入NaCl 至1.0m ol/L ,沉淀为胶原混合物;随后在中性条件下分别以1.5m ol/L 、2.5m ol/L NaCl 盐析,反复数次分别得Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的初纯品;用DE -52柱层析去除酸性大分子,得到纯化的Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原。1.3　从人胚胎骨提取[3]

将脱钙骨粉浸入0.5m ol/L H Ac 24～48h ,取上清液缓慢加入研磨精细的NaCl (终浓度为4m ol/L ),搅拌过夜。以35,000g 离心20min

(下同),去上清液,其沉淀物加入0.5m ol/L H Ac 透析溶解,离心,取上清液依次加入0.1m ol/L T ris -HCl (终浓度为0.01m ol/L ),

5m ol/L NaOH (调pH 至7.4),NaOH (终浓度为4m ol/L ),搅拌过夜,离心,去上清液。沉淀以4m ol/L NaCl -0.05m ol/L T ri -HCl 洗一次,再

加0.05m ol/L H Ac 透析溶解,离心去沉淀,上清液装入透析袋内,对NaCl 溶液透析(平衡后NaCl 浓度为10%),离心去上清液,沉淀物用

0.5m ol/L H Ac 透析去盐溶解,离心去沉淀,上清液浓缩冻干。以上所有液体及操作均在4℃下进行。

第25卷第3期2005年9月明　胶　科　学　与　技　术The Science and T echnology of G elatin V ol.25.N o.3Sept.2005.

2　Ⅱ型胶原

根据Smith et.al [4]

方法从SCS (S warm chondrosarcoma )组织分离出Ⅱ型胶原。首先用200m M NaCl 提取,pH 7.6下用20%NaCl 盐析

两次并用二乙氨乙基纤维素色谱进一步纯化。2.1　从牛软骨提取[5]新鲜牛软骨剥去骨膜,在液氮冷冻下磨成粉,称重。用10倍体积的4m ol/L 盐酸胍-0.05m m ol/L T ris -HCl (pH 7.5)混悬后,于4℃下搅拌24h 。以12,000g 离心20min ,弃上清液。用0.5m m ol/L 乙酸充分洗涤。沉淀用4倍的0.5m m ol/L 乙酸(内含1g/L 胃蛋白酶)混悬,4℃下搅拌48h ,以20,000g 离心20min ,取上清液。然后用3m m ol/L 的NaCl 沉淀过

液。离心,沉淀用0.1m m ol/L 乙酸溶解,此即为粗制的

Ⅱ型胶原蛋白。DE 52离子交换柱经0.05m m ol/L T ris -HCl -0.02m m ol/L NaCl

(pH 7.4)平衡后,装入高度为20cm 、体积为

120m L 的交换柱内,缓缓加入经平衡液透析后之粗制Ⅱ型胶原蛋白。在核酸蛋白检测仪检测下(λ=280nm ),调节流速约5m L/min ,收集第一峰(Ⅱ型胶原)。然后用3m m ol/L NaCl 于4℃下沉淀过夜。离心,取沉淀用0.5m m ol/L 乙酸重新溶解,透析,此即为纯化的Ⅱ型胶原。

Ⅱ型胶原的鉴定:①采用S DS -聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE ),采用50g/L 浓缩胶和120g/L 分离胶,样品为低分子标准蛋白,Mr 分别为97.4,66.2,43.0,31.0,20.1和14.4(×103),标准Ⅱ型胶原和不同批次的自产的纯化Ⅱ型胶原按常规电泳;②凝胶采用CS -900薄层扫描仪扫描,λ=580nm 。2.2　从兔关节软骨提取[6]

图1　兔关节软骨Ⅱ型胶原提取步骤

3　Ⅲ型胶原3.1　从牛皮提取[7]从新鲜屠宰后的牛中获得皮肤中层,在肉研磨机中与冰混合,磨碎并用冰水淋洗。碎末用5M 乙酸钠处理并再次用水淋洗。酸溶性胶原用10倍体积0.5M 柠檬酸缓冲液(pH

3.7)提取两次,剩余部分冷冻储藏。融化后,

皮肤碎末对0.1%醋酸,4℃下渗析去除柠檬酸缓冲溶液,用1N HCl 使悬浮物pH 降至2.0(胶原浓度约为2mg/m L )。加入胃蛋白酶(重

·411·明　胶　科　学　与　技　术2005年9月