基因工程原理精品PPT课件
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
N=基因文库中所包含的克隆的数目 P=任意所需基因存在于基因文库中的概率，一般要求大于
99% F=所克隆的DNA片段大小（kb）占基因组大小的分数。
根据公式可以计算出各步应该达到的数量。
Principles of Gene Engineering
如某动物单倍体基因组含有3 X10 9bp，使用噬菌体为 克隆载体，所克隆的片段大小为20 kb左右，为了使目 的基因存在于基因组文库的概率大于99%，则文库中 的克隆数目为69X105。大肠杆菌基因组为 4.6X106， 那么大肠杆菌基因文库的克隆数是1100。
DNA的化学合成的方法刚开始是磷酸二酯 法，后来1960年Letsinger等又发明了磷酸 三酯法，后来又出现了亚磷酸三酯法。进 一步的发展出现了固相化，即将第一个核 苷酸的3’-OH 固定在可控孔径玻璃微球（ CPG）上，因此，冲洗十分的方便，由此 出现了DNA自动合成仪。目前的DNA自动 合成仪都使用亚磷酸三酯法。
Principles of Gene Engineering
人工合成基因的基本程序
a 利用化学方法合成基因DNA不同部位的两条链的寡聚核苷酸的 短片段，再退火成为两端活性末端的DNA双链片段；
b 将上述的DNA片段按照正确顺序进行退火，连接形成较长的 DNA片段，再用连接酶连接，形成具有完整编码序列的DNA ；
c 将完整编码的DNA与载体连接，导入合适的宿主细胞中，实现 分子克隆。
目前，还可以采用化学（连接）酶促相结合的方法合成 寡聚核苷酸，可以提高反应的专一性，减少副反应，提 高产率等。
Principles of Gene Engineering
短的寡核苷酸片段连接成长的基因的两种方式
小片段互 补粘接
cDNA文库（cDNA library）: 指细胞全部mRNA反转 录成cDNA并被克隆的总合。
Principles of Gene Engineering
基因组文库的构建
一个基因组文库中应该含有多少克隆数目，才能保证 所要求的基因以极高的频率出现在文库中？
ln (1-P ) 基因文库大小 N=
ln (1 - F)
定位和基因的专一性改变等。
Principles of Gene Engineering
人工合成基因的缺点
合成的基因容易出现重复结构、发卡结构或回文 结构，从而造成拼接效率下降或拼接错误；
小肽基因都比较短小，一般均采用化学合成的方 法获得其基因，如生长激素释放因子基因（14肽 ）、缓激肽、胸腺素-2、脑啡肽、加压素、β干 扰素、γ干扰素、人胰岛素等。
大片段部分 互补酶促
Principles of Gene Engineering
化学合成寡核苷酸的应用
（1）合成分子杂交的探针； （2）合成PCR引物和DNA测序使用的引物； （3）合成短小的或来之不易的基因，或改造天然基
因； （4）合成DNA末端改造中的接头； （5）制备cDNA，筛选文库，克隆基因；用于基因
第8章
基因工程原理
Principles of Gene Engineering
本章内容
1 基因工程的历史和发展 2 基因工程的基本内容和技术 3 基因工程相关酶学 4 基因工程中的载体和宿主系统 5 目的基因的获得和分离方法 6 外源基因导入宿主细胞 7 重组体的鉴定和分析 8 外源基因在大肠杆菌中的表达 9 外源基因在真核细胞中的表达 10 蛋白质工程 11 基因工程的应用和展望
Principles of Gene Engineering
5.2 基因文库的构建
Principles of Gene Engineering
基因文库包括两种：
基因组文库（genomic library）：指整套由基因组 DNA插入克隆载体所获得的分子克隆的总合， 其中应该包含有生物的全部遗传信息。
Principles of Gene Engineering
核酸化学合成的指导思想就是，将核苷酸所有的 活性基团都用保护剂加以封闭，只留下需要反应 的基团，用活化剂使反应基团激活；用缩合剂使 一核苷酸羟基与另一个核苷酸磷酸基团之间形成 磷酸二酯键，从而定向发生聚合。
Leabharlann Baidu
Principles of Gene Engineering
第一步：脱去保护基: 用酸处理，使核苷酸5‘-OH上面 的保护基DMT脱落。
第二步：偶联反应：使用二异丙基氨基亚磷酰氯甲酯 作为活化剂和缩合剂，在弱碱化合物四唑催 化下，了、偶联形成亚磷酸三酯。
第三步：封端反应：加入乙酸酐使没有参与偶联反应 的5’-OH被乙酰化，以免参与反应，出现错误 序列。
第四步：氧化作用：合成亚磷酸三酯后用碘氧化，形 成较为稳定的磷酸三酯。
Principles of Gene Engineering
5 目的基因的获得和分离方法
常见的目的基因的获得方法
5.1 基因的人工化学合成 5.2 基因文库的构建
基因组文库，cDNA文库 5.3 PCR法
Principles of Gene Engineering
5.1 基因的人工化学合成
20世纪50年代，Khorana H G 就开始了寡核苷酸 的化学合成，并于1956年首次成功合成了二核苷 酸。从此开始了核酸的人工化学合成，他获得 1968年诺贝尔生理学核医学奖（与他人共享）。 他合成了酵母丙氨酸tRNA基因，并在1979年首次 合成出具有生物活性的126bp长度的大肠杆菌酪氨 酸tRNA基因。
Principles of Gene Engineering
腺嘌呤、胞嘧啶碱基上的氨基用苯甲酰基（bz） 保护，鸟嘌呤碱基上的氨基用异丁酰基（Ib）保 护，5‘-OH用二甲氧三苯甲基（DMT）保护。合 成的每个循环周期分为4个步骤：脱去保护基、偶 联反应、封端反应和氧化反应。
Principles of Gene Engineering
Principles of Gene Engineering
按照事先设计好的顺序逐个加入核苷酸， 合成结束后，使用硫酚核三乙胺脱掉保护 基，并用氨水水解合成的寡核苷酸，再用 HPLC和凝胶电泳纯化鉴定。每个核苷酸 的合成循环需要7-10分钟，50个核苷酸的 DNA片段需要6-8小时，十分迅速方便。
99% F=所克隆的DNA片段大小（kb）占基因组大小的分数。
根据公式可以计算出各步应该达到的数量。
Principles of Gene Engineering
如某动物单倍体基因组含有3 X10 9bp，使用噬菌体为 克隆载体，所克隆的片段大小为20 kb左右，为了使目 的基因存在于基因组文库的概率大于99%，则文库中 的克隆数目为69X105。大肠杆菌基因组为 4.6X106， 那么大肠杆菌基因文库的克隆数是1100。
DNA的化学合成的方法刚开始是磷酸二酯 法，后来1960年Letsinger等又发明了磷酸 三酯法，后来又出现了亚磷酸三酯法。进 一步的发展出现了固相化，即将第一个核 苷酸的3’-OH 固定在可控孔径玻璃微球（ CPG）上，因此，冲洗十分的方便，由此 出现了DNA自动合成仪。目前的DNA自动 合成仪都使用亚磷酸三酯法。
Principles of Gene Engineering
人工合成基因的基本程序
a 利用化学方法合成基因DNA不同部位的两条链的寡聚核苷酸的 短片段，再退火成为两端活性末端的DNA双链片段；
b 将上述的DNA片段按照正确顺序进行退火，连接形成较长的 DNA片段，再用连接酶连接，形成具有完整编码序列的DNA ；
c 将完整编码的DNA与载体连接，导入合适的宿主细胞中，实现 分子克隆。
目前，还可以采用化学（连接）酶促相结合的方法合成 寡聚核苷酸，可以提高反应的专一性，减少副反应，提 高产率等。
Principles of Gene Engineering
短的寡核苷酸片段连接成长的基因的两种方式
小片段互 补粘接
cDNA文库（cDNA library）: 指细胞全部mRNA反转 录成cDNA并被克隆的总合。
Principles of Gene Engineering
基因组文库的构建
一个基因组文库中应该含有多少克隆数目，才能保证 所要求的基因以极高的频率出现在文库中？
ln (1-P ) 基因文库大小 N=
ln (1 - F)
定位和基因的专一性改变等。
Principles of Gene Engineering
人工合成基因的缺点
合成的基因容易出现重复结构、发卡结构或回文 结构，从而造成拼接效率下降或拼接错误；
小肽基因都比较短小，一般均采用化学合成的方 法获得其基因，如生长激素释放因子基因（14肽 ）、缓激肽、胸腺素-2、脑啡肽、加压素、β干 扰素、γ干扰素、人胰岛素等。
大片段部分 互补酶促
Principles of Gene Engineering
化学合成寡核苷酸的应用
（1）合成分子杂交的探针； （2）合成PCR引物和DNA测序使用的引物； （3）合成短小的或来之不易的基因，或改造天然基
因； （4）合成DNA末端改造中的接头； （5）制备cDNA，筛选文库，克隆基因；用于基因
第8章
基因工程原理
Principles of Gene Engineering
本章内容
1 基因工程的历史和发展 2 基因工程的基本内容和技术 3 基因工程相关酶学 4 基因工程中的载体和宿主系统 5 目的基因的获得和分离方法 6 外源基因导入宿主细胞 7 重组体的鉴定和分析 8 外源基因在大肠杆菌中的表达 9 外源基因在真核细胞中的表达 10 蛋白质工程 11 基因工程的应用和展望
Principles of Gene Engineering
5.2 基因文库的构建
Principles of Gene Engineering
基因文库包括两种：
基因组文库（genomic library）：指整套由基因组 DNA插入克隆载体所获得的分子克隆的总合， 其中应该包含有生物的全部遗传信息。
Principles of Gene Engineering
核酸化学合成的指导思想就是，将核苷酸所有的 活性基团都用保护剂加以封闭，只留下需要反应 的基团，用活化剂使反应基团激活；用缩合剂使 一核苷酸羟基与另一个核苷酸磷酸基团之间形成 磷酸二酯键，从而定向发生聚合。
Leabharlann Baidu
Principles of Gene Engineering
第一步：脱去保护基: 用酸处理，使核苷酸5‘-OH上面 的保护基DMT脱落。
第二步：偶联反应：使用二异丙基氨基亚磷酰氯甲酯 作为活化剂和缩合剂，在弱碱化合物四唑催 化下，了、偶联形成亚磷酸三酯。
第三步：封端反应：加入乙酸酐使没有参与偶联反应 的5’-OH被乙酰化，以免参与反应，出现错误 序列。
第四步：氧化作用：合成亚磷酸三酯后用碘氧化，形 成较为稳定的磷酸三酯。
Principles of Gene Engineering
5 目的基因的获得和分离方法
常见的目的基因的获得方法
5.1 基因的人工化学合成 5.2 基因文库的构建
基因组文库，cDNA文库 5.3 PCR法
Principles of Gene Engineering
5.1 基因的人工化学合成
20世纪50年代，Khorana H G 就开始了寡核苷酸 的化学合成，并于1956年首次成功合成了二核苷 酸。从此开始了核酸的人工化学合成，他获得 1968年诺贝尔生理学核医学奖（与他人共享）。 他合成了酵母丙氨酸tRNA基因，并在1979年首次 合成出具有生物活性的126bp长度的大肠杆菌酪氨 酸tRNA基因。
Principles of Gene Engineering
腺嘌呤、胞嘧啶碱基上的氨基用苯甲酰基（bz） 保护，鸟嘌呤碱基上的氨基用异丁酰基（Ib）保 护，5‘-OH用二甲氧三苯甲基（DMT）保护。合 成的每个循环周期分为4个步骤：脱去保护基、偶 联反应、封端反应和氧化反应。
Principles of Gene Engineering
Principles of Gene Engineering
按照事先设计好的顺序逐个加入核苷酸， 合成结束后，使用硫酚核三乙胺脱掉保护 基，并用氨水水解合成的寡核苷酸，再用 HPLC和凝胶电泳纯化鉴定。每个核苷酸 的合成循环需要7-10分钟，50个核苷酸的 DNA片段需要6-8小时，十分迅速方便。