基因工程原理精品PPT课件
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基因工程专题1-1ppt课件
5.重组DNA体外表达实验 的成功（转基因细菌）----- 1973年，博耶和科恩用 含单一EcoRⅠ酶切位点的 载体质粒pSC101，使之与 非洲爪蟾核糖体蛋白基因 （外源基因）的DNA片段 重组，重组的DNA导入大 肠杆菌（受体细胞）中， 成功表达出mRNA（外源 基因导入、复制、表达， 实现物种间基因交流）， 基因工程正式问世。
P·伯格 ，美国生物化学家、 现代基因工程的创始人。1972 年，伯格把两种病毒的DNA用 同一种限制性内切酶切割后， 再用DNA连接酶把这两种 DNA分子连接起来，于是产生 了一种新的重组DNA分子，首 次实现两种不同生物的DNA体 外连接，获得了第一批重组 DNA分子，这标志着基因工程 技术的诞生。伯格因此获得了 1980年诺贝尔化学奖。
基因工程------梦想与理论、实验与技术、生产与专利、 伦理与安全
2000年超级杂交稻第一个阶段达到亩产700公斤。 第二个阶段亩产800公斤，在2004年实现了。我们 现在向第三期亩产900公斤攻关，计划2015年实现， 争取提前两到三年。
转基因抗虫稻（螟虫）
用除草剂Barstar处理的抗除草剂转基因水稻(中) 和非转基因水稻对照(两侧)
科恩和博耶
6.1980年 显微注射法获得第一个转基因小鼠（动物） 1983年农杆菌转化法第一例转基因烟草（植物） 基因 工程迅速发展。
7.1988年 穆里斯发明PCR仪，快速扩增所需基因
科学与技术的关系？
完
科恩和博 耶
1973年，美国斯坦福大学教授S·科 恩和加利福尼亚大学旧金山分校教 授H·W·博耶将两个不同的质粒（一 个是抗四环素质粒，另一个是抗链 霉素质粒）拼接在一起，组成嵌合 质粒，并将其导入大肠杆菌，当该 重组质粒进入大肠杆菌体内后，这 些大肠杆菌能抵抗两种药物，而且 这种大肠杆菌的后代都具有双重抗
基因工程-课件ppt
(7)用于载体的质粒 DNA 分子上至少含一个限制酶识别位点(√ )
(8)载体的作用是携带目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在
并表达
(√)
在日常生 活中， 随处都 可以看 到浪费 粮食的 现象。 也许你 并未意 识到自 己在浪 费，也 许你认 为浪费 这一点 点算不 了什么
2．载体需具备的条件及其作用(连线)
对点落实
返回
1．(2016·全国卷Ⅲ)图(a)中的三个 DNA 片段上依次表示出了
EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ和 Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列
与 切 割 位 点 ， 图 (b) 为 某 种 表 达 载 体 的 示 意 图 ( 载 体 上 的
EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。
↓
↓
↓
——GAATTC—— ——GGATCC—— ——GATC——
返回
(2)写出产生的末端的种类：①产生的是黏性末端；②产生的 是 平末端 。 (3)EcoRⅠ限制酶和 SmaⅠ限制酶识别的碱基序列 不同，切割 位点不同 (填“相同”或“不同”)，说明限制酶具有专一性 。
在日常生 活中， 随处都 可以看 到浪费 粮食的 现象。 也许你 并未意 识到自 己在浪 费，也 许你认 为浪费 这一点 点算不 了什么
图(b)
图(c)
(3)DNA 连接酶是将两个 DNA 片段连接起来的酶，常见的
有__E_·_c_o_l_i__D_NA_连__接__酶_和____T_4D_N_A_连___接__酶___，其中既能连接黏 性末端又能连接平末端的是__T_4D_N_A__连__接__酶___。
解析
在日常生 活中， 随处都 可以看 到浪费 粮食的 现象。 也许你 并未意 识到自 己在浪 费，也 许你认 为浪费 这一点 点算不 了什么
基因工程-PPT课件
干扰素 1200 升人血 2－3 万美元 / 病人
1 升发酵液 200－300 美元 / 病人
国外生物医药的发展
➢1976年第一家基因工程技术开发药物的公司建立。 ➢1982年第一个基因工程药物重组人胰岛素正式生产，推向市场。 ➢2019年全球生物技术公司总数已达4284家，美国占34％。 ➢2019年基因重组生物技术药物的年销售额已经突破400亿美元。 ➢2019年市场上的生物技术药物达到200种左右，而在研的药物为600种。 ➢全世界已有2.5亿人使用生物技术药物和疫苗。
• 曼哈顿计划 • 阿波罗计划
20世纪科学史上3个里程碑
HGP的意义
• 了解生命的起源与进化 – 认识种属之间和个体之间存在差异的起因 – 五种“模式生物” 基因组的研究：大肠杆菌、酵母、 线虫、果蝇和小鼠
• 解码生命，认识自身 – 了解生命体生长发育的规律
• 认识疾病产生的机制，掌握生老病死规律 – 疾病的诊断和治疗
甜椒在栽培的过 程中，容易受病毒的 感染。我国科学工作 者，采用转基因技术， 培育出抗病毒的甜椒。
油菜是人们食用油的主要来源之一。一般油菜 籽的含油量约为40％左右。通过转基因技术，培育 出来的油菜籽，可以大大地提高它的出油率。而且 油的纯度质量更好。
玉米是主要粮食之一，又可以提炼油脂，也可以 用作食品和工业的原料以及作饲料，浑身是宝。人们称 它是含金的植物。如今培育出转基因玉米，品质更好， 产量更高。
淋巴细胞ADA酶恢复至正常水平的5%-10% 维持免疫系统功能,改善病人症状
遗传缺陷病人
腺病毒 adenovirus
修正基因
插入修正基因
感染病人細胞
取出病人細胞
修正基因转入到患者体内
注射修正基因
基因工程的基本原理和技术ppt课件
C、运载体必须具备的条件之一是：具有多 个限制酶切点，以便与外源基因连接
D、基因控制的性状都能在后代表现出来
48
⒉种类与命名：
现在已经从约300种微生物中分离出了约4000 种限制性内切酶(限制酶)。
粘质沙雷氏杆菌 SmaⅠ（Serratia marcesens）
大肠杆菌 EcoRⅠ （Escherichia coli R）
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T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合” 起来，但效率较低
T4DNA连接酶
37
③类型：
类型
来源
相同点
功能 差别
E·coliDNA连接酶 大肠杆菌 恢复 只能连接黏性末端
磷酸
T4DNA连接酶
T4噬菌体 二酯键
能连接黏性末端和 平末端(效率较低)
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寻根问底
• DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?
科技探索之路
早 期 基 础 理 论
摩尔根证明基因在染色体上，并提出基
因的连锁互换定律。
11
科技探索之路
后 期 基 础 理 论
艾弗里证明DNA是遗传物质，DNA可从
一种生物个体转移到另一种生物个体。
12
科技探索之路
后 期 基 础 理 论
沃森、克里克提出DNA的双螺旋结构模型。13
科技探索之路 基础理论和技术发展催生了基因工程
A. 同种限制酶 B. 两种限制酶 C. 同种连接酶 D. 两种连接酶
46
课堂练习
2.不属于质粒被选为基因运载体的理由是
A、能复制
（ D）
B、有多个限制酶切点
C、具有标记基因
D、它是环状DNA
47C）
A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷 酸序列
《基因工程的原理》PPT课件
是
。
⑸由于转基因表达产物存在于山羊的乳汁中，检测其体内是
否出现进药行用抗蛋原白—，抗在体分杂子交水如平果上出的现检杂测交方带法，及表结明果奶是牛什中出现了 么? 抗原蛋白；不出现杂交带，表明奶牛中未出现抗原蛋白
。 ⑹要确定目的让的害基虫因吞（食抗棉虫花基叶因，）观导察入害棉虫花是细否胞具后有，抗是虫否性能状
一、 目的基因的获得
1、目的基因：
在基因操作中使用的外源基因。它是编 码蛋白质的结构基因，如胰岛素基因、 干扰素基因。
2、获得目的基因的方法：
（1）直接分离法—— a.鸟枪法
（2）人工合成法 b.反转录法 c.化射击法）
①分离程序：用限制性内切酶将完 整的DNA分子切成适当长度的片段， 然后通过检测的方法挑选出所需要 的基因。
B、具有多个限制酶切点，以便于目的基 因的表达
C．具有某些标记基因，以便为目的基因 的表达提供条件
D、能够在宿主细胞中复制并稳定保存， 以便于进行筛选
4、质粒是基因工程最常见的载体，它的 主要特点是( )
①能自主复制 ②不能自主复制 ③结构很小 ④是蛋白质 ⑤是环状RNA ⑥是环状DNA ⑦能“友好”地“借居”
想一想需要哪些工具呢？
普通棉花
抗虫棉
探究1：基因工程的基本工具是什么？
一、 基因手术刀：限制性内切酶 二、基因缝纫针：DNA连接酶 三、基因运输车：载体
一、 基因手术刀：限制性内切酶
1、来源： 主要从原核生物中分离纯化 2、功能：（1）识别特定的脱氧核苷酸序列（回文
序列）；（2）并在特异性位点把双链 DNA分子“切割”开。
第一节 基因工程的原理
乳汁中含有人生长激素的 转基因牛(阿根廷)
基因工程DNA的重组概技术念或基因拼接技术
基因工程技术ppt课件
是指目的基因在受体细胞内表达，研究功能。
3
病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程
应用：
• 克隆感兴趣基因进行序列分析，研究其组织结构。 • 转入原核表达载体，进行大规模蛋白质合成,生产多肽
产品。 • 转入真核表达载体，导入细胞，研究其功能，表达调
载体：
• 载体(Vector)是目的基因的运载工具，其作用是将目 的基因带入受体细胞中，并使目的基因扩增和表达。
• 种类： 按来源分： 质粒载体(plasmid vector)、噬菌体载体(phage vector)、 柯氏质粒载体(cosmid vector)、病毒载体(virus vector ). 按作用分： 克隆载体(cloning vector )、表达载体(expression vector)、 穿梭载体(shuttle vector)
四环素选择标记上，4种位于Amp抗性基因上。外源基因的插入将破坏 抗性基因的完整性，导致抗性基因插入失活，这种特性可用于区分重组 和非重组分子。 • 松弛性质粒，在大肠杆菌细胞内有较高的拷贝数，当细菌蛋白质合成停 止时，它仍能继续复制。
16
病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程
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病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程
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病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程TA 源自隆AA19
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病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程
应用：
• 克隆感兴趣基因进行序列分析，研究其组织结构。 • 转入原核表达载体，进行大规模蛋白质合成,生产多肽
产品。 • 转入真核表达载体，导入细胞，研究其功能，表达调
载体：
• 载体(Vector)是目的基因的运载工具，其作用是将目 的基因带入受体细胞中，并使目的基因扩增和表达。
• 种类： 按来源分： 质粒载体(plasmid vector)、噬菌体载体(phage vector)、 柯氏质粒载体(cosmid vector)、病毒载体(virus vector ). 按作用分： 克隆载体(cloning vector )、表达载体(expression vector)、 穿梭载体(shuttle vector)
四环素选择标记上，4种位于Amp抗性基因上。外源基因的插入将破坏 抗性基因的完整性，导致抗性基因插入失活，这种特性可用于区分重组 和非重组分子。 • 松弛性质粒，在大肠杆菌细胞内有较高的拷贝数，当细菌蛋白质合成停 止时，它仍能继续复制。
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病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程
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病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程
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病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程TA 源自隆AA19
分子生物学原理--基因工程ppt课件
分子生物学原理
整合
• 整合： 噬菌体感染大肠杆菌的第一步
噬菌体粘附于细胞壁上，将自身的 DNA注入菌体中。 此 DNA可与细菌染色 体重组，成为细菌染色体的一部分。
• 溶原菌：整合了噬菌体基因组的细菌。
• 裂解： 噬菌体感染大肠杆菌的第二步
DNA利用菌体的酶系统，复制自身及 外壳蛋白，组装成大量新 噬菌体，并将 细菌涨破。
第十四章 基因重组与基因工程
10/28/2024
分子生物学原理
基因重组：genomic recombination 重组DNA：recombinant DNA
10/28/2024
分子生物学原理
第一节、自然界的基因重组
• 转化：transformation • 整合：integration • 转导：transduction • 转位：transposition
10/28/2024
分子生物学原理
转位
• 转位：一个或一组基因从一处转到基因 组的另一个位置。
• 这些游动的基因称为转位子(transposon)。
10/28/2024
分子生物学原理
转 位
10/28/2024
分子生物学原理
第二节、基因工程
• 基因工程：是用分离纯化或人工合成的 DNA在体外与载体DNA结合，成为重组 DNA，用以转化宿主，筛选出能表达重 组DNA的活细胞，加以纯化、传代、扩 增，成为克隆。也叫基因克隆或重组 DNA技术。
切割后与原来载体比较。
• 利用核酸杂交和放射自显影进行鉴定：用目 的基因作探针监测宿主DNA是否重组体。
10/28/2024
分子生物学原理
DNA重组体的筛选与鉴定
•灭 活法筛 选重组 体。
基因工程的原理和技术PPT课件
（1）将重组DNA导入植物细胞 农杆菌转化法 基因枪法
（2）将重组DNA导入动物细胞
显微注射技术
提纯基因表达载体 体外显微注射入受精卵
受精卵移植
（3）如果是导入微生物（如细菌）
目的基因
重组质粒
氨苄青霉素抗性基因
（标记基因）
将细菌用CaCl2处理，使 细胞处于感受态，可促 进细胞吸收DNA分子
大肠杆菌的拟核
用限制酶 切成许多
片断
②利用PCR技术扩增目的基因
聚合酶链式反应，在生物体外复制特定DNA 片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基 因。
聚合酶链式反应（PCR技术）
变性：双链DNA解链 成为单链DNA
复性（退火）：部 分引物与模板的单 链DNA的特定互补部 位相配对和结合
延伸：以目的基因 为模板，合成互补 的新DNA链
1.第一步：目的CR)技术扩增目的 基因（目的基因的序列已知） ③化学方法合成目的基因基 因的许多DNA片断，导入受 体菌的群体储存，各个受体 菌体
小片段DNA
重组DNA分抗虫蛋 白的菌落
该菌落所携带 形成重组DNA分子（构建基因表达载体)
通常用同一种限制酶切割目的基因和载体(质粒)，形成相同的 粘性末端，再用DNA连接酶将二者连接,形成重组DNA分子 （基因表达载体）。
用荧光分子或放射性 同位素标记
看能否形 成杂合的
双链区
①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因
检测—
方法: DNA分子杂交
过程:A.首先取出转基因生物的基因组DNA B.用含目的基因的DNA片段( 单链)用放射性同位素等作标 以此做探针 C.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带, 表明目的基因已插入染色体DNA中
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第一步：脱去保护基: 用酸处理，使核苷酸5‘-OH上面 的保护基DMT脱落。
第二步：偶联反应：使用二异丙基氨基亚磷酰氯甲酯 作为活化剂和缩合剂，在弱碱化合物四唑催 化下，了、偶联形成亚磷酸三酯。
第三步：封端反应：加入乙酸酐使没有参与偶联反应 的5’-OH被乙酰化，以免参与反应，出现错误 序列。
第四步：氧化作用：合成亚磷酸三酯后用碘氧化，形 成较为稳定的磷inciples of Gene Engineering
化学合成寡核苷酸的应用
（1）合成分子杂交的探针； （2）合成PCR引物和DNA测序使用的引物； （3）合成短小的或来之不易的基因，或改造天然基
因； （4）合成DNA末端ples of Gene Engineering
5 目的基因的获得和分离方法
常见的目的基因的获得方法
5.3 PCR法
Principles of Gene Engineering
5.1 基因的人工化学合成
20世纪50年代，Khorana H G 就开始了寡核苷酸 的化学合成，并于1956年首次成功合成了二核苷 酸。从此开始了核酸的人工化学合成，他获得 1968年诺贝尔生理学核医学奖（与他人共享）。 他合成了酵母丙氨酸tRNA基因，并在1979年首次 合成出具有生物活性的126bp长度的大肠杆菌酪氨 酸tRNA基因。
DNA的化学合成的方法刚开始是磷酸二酯 法，后来1960年Letsinger等又发明了磷酸 三酯法，后来又出现了亚磷酸三酯法。进 一步的发展出现了固相化，即将第一个核 苷酸的3’-OH 固定在可控孔径玻璃微球（ CPG）上，因此，冲洗十分的方便，由此 出现了DNA自动合成仪。目前的DNA自动 合成仪都使用亚磷酸三酯法。
Principles of Gene Engineering
按照事先设计好的顺序逐个加入核苷酸， 合成结束后，使用硫酚核三乙胺脱掉保护 基，并用氨水水解合成的寡核苷酸，再用 HPLC和凝胶电泳纯化鉴定。每个核苷酸 的合成循环需要7-10分钟，50个核苷酸的 DNA片段需要6部mRNA反转 录成cDNA并被克隆的总合。
Principles of Gen少克隆数目，大小 N=
ln (1 - F)
第8章
基因工程原理
Principles of Gene Engineering
本章内容
1 基因工程的历史和发展 2 基因工程的基本内容和技术 3 基因工程相关酶学 4 基因工程中的载体和宿主系统 5 目的基因的获得和分离方法 6 外源基因导入宿主细胞 7 重组体的鉴定和分析 8 外源基因在大肠杆菌中的表达 9 外源基因在真核细胞中的表达 10 蛋白质工程 11 基因工程的应用和展望
定位和基因的专一性改变等。
Principles of Gene Engineering
人工合成基因的缺点
合成的基因容易出现重复结构、发卡结构或回文 结构，从而造成拼接效率下降或拼接错误；
小肽基因都比较短小，一般均采用化学合成的方 法获得其基因，如生长激素释放因子基因（14肽 ）、缓激肽、胸腺素-2、脑啡肽、加压素、β干 扰素、γ干扰素、人胰岛素等。
Principles of Gene E Geic library）：指整套由基因组 DNA插入克隆载体所获得的分子克隆的总合， 其中应该包=所克隆的DNA片段大小（kb）占基因组大小的分数。
根据公式可以计算出各步应该达到的数量。
Principles of Gene Engineering
如某动物单倍体基因组含有3 X10 9bp，使用噬菌体为 克隆载体，所克隆的片段大小为2069X105。大肠杆菌基因ples of Gene Engineering
核酸化学合成的指导思想就是，将核苷酸所有的 活性基团都用保护剂加以封闭，只留下需要反应 的基团，用活化剂使反应基团激活；用缩合剂使 一核苷酸羟基与另一个核苷酸磷酸基团之间形成 磷酸二酯键，从而定向发生聚合。
Principles of Gene Engineering
Principles of Gene Engineering
人工合成基因的基本程序
a 利用化学方法合成基因DNA不同部位的两条链的寡聚核苷酸的 短片段，再退火成为两端活性末端的DNA双链片段；
b 将上述的DNA片段按照正确顺序进行退火，连接形成较长的 DNA片段，再用连接酶连接，形成具有完整编码序列的DNA ；
Principles of Gene Engineering
腺嘌呤、胞嘧啶碱基上的氨基用苯甲酰基（bz） 保护，鸟嘌呤碱基上的氨基用异丁酰基（Ib）保 护，5‘-OH用二甲氧三苯甲基（DMT）保护。合 成的每个循环周期分为4个步骤：脱去保护基、偶 联反应、封端反应和氧化反应。
Principles of Gene Engineering
c 将完整编码的DNA与载体连接，导入合适的宿主细胞中，实现 分子克隆。
目前，还可以采用化学（连接）酶促相结合的方法合成 寡聚核苷酸，可以提高反应的专一性，减少副反应，提 高产率等。
Principles of Gene Engineering
短的寡核苷酸片段连接成长的基因的两种方式
小片段互 补粘接
第二步：偶联反应：使用二异丙基氨基亚磷酰氯甲酯 作为活化剂和缩合剂，在弱碱化合物四唑催 化下，了、偶联形成亚磷酸三酯。
第三步：封端反应：加入乙酸酐使没有参与偶联反应 的5’-OH被乙酰化，以免参与反应，出现错误 序列。
第四步：氧化作用：合成亚磷酸三酯后用碘氧化，形 成较为稳定的磷inciples of Gene Engineering
化学合成寡核苷酸的应用
（1）合成分子杂交的探针； （2）合成PCR引物和DNA测序使用的引物； （3）合成短小的或来之不易的基因，或改造天然基
因； （4）合成DNA末端ples of Gene Engineering
5 目的基因的获得和分离方法
常见的目的基因的获得方法
5.3 PCR法
Principles of Gene Engineering
5.1 基因的人工化学合成
20世纪50年代，Khorana H G 就开始了寡核苷酸 的化学合成，并于1956年首次成功合成了二核苷 酸。从此开始了核酸的人工化学合成，他获得 1968年诺贝尔生理学核医学奖（与他人共享）。 他合成了酵母丙氨酸tRNA基因，并在1979年首次 合成出具有生物活性的126bp长度的大肠杆菌酪氨 酸tRNA基因。
DNA的化学合成的方法刚开始是磷酸二酯 法，后来1960年Letsinger等又发明了磷酸 三酯法，后来又出现了亚磷酸三酯法。进 一步的发展出现了固相化，即将第一个核 苷酸的3’-OH 固定在可控孔径玻璃微球（ CPG）上，因此，冲洗十分的方便，由此 出现了DNA自动合成仪。目前的DNA自动 合成仪都使用亚磷酸三酯法。
Principles of Gene Engineering
按照事先设计好的顺序逐个加入核苷酸， 合成结束后，使用硫酚核三乙胺脱掉保护 基，并用氨水水解合成的寡核苷酸，再用 HPLC和凝胶电泳纯化鉴定。每个核苷酸 的合成循环需要7-10分钟，50个核苷酸的 DNA片段需要6部mRNA反转 录成cDNA并被克隆的总合。
Principles of Gen少克隆数目，大小 N=
ln (1 - F)
第8章
基因工程原理
Principles of Gene Engineering
本章内容
1 基因工程的历史和发展 2 基因工程的基本内容和技术 3 基因工程相关酶学 4 基因工程中的载体和宿主系统 5 目的基因的获得和分离方法 6 外源基因导入宿主细胞 7 重组体的鉴定和分析 8 外源基因在大肠杆菌中的表达 9 外源基因在真核细胞中的表达 10 蛋白质工程 11 基因工程的应用和展望
定位和基因的专一性改变等。
Principles of Gene Engineering
人工合成基因的缺点
合成的基因容易出现重复结构、发卡结构或回文 结构，从而造成拼接效率下降或拼接错误；
小肽基因都比较短小，一般均采用化学合成的方 法获得其基因，如生长激素释放因子基因（14肽 ）、缓激肽、胸腺素-2、脑啡肽、加压素、β干 扰素、γ干扰素、人胰岛素等。
Principles of Gene E Geic library）：指整套由基因组 DNA插入克隆载体所获得的分子克隆的总合， 其中应该包=所克隆的DNA片段大小（kb）占基因组大小的分数。
根据公式可以计算出各步应该达到的数量。
Principles of Gene Engineering
如某动物单倍体基因组含有3 X10 9bp，使用噬菌体为 克隆载体，所克隆的片段大小为2069X105。大肠杆菌基因ples of Gene Engineering
核酸化学合成的指导思想就是，将核苷酸所有的 活性基团都用保护剂加以封闭，只留下需要反应 的基团，用活化剂使反应基团激活；用缩合剂使 一核苷酸羟基与另一个核苷酸磷酸基团之间形成 磷酸二酯键，从而定向发生聚合。
Principles of Gene Engineering
Principles of Gene Engineering
人工合成基因的基本程序
a 利用化学方法合成基因DNA不同部位的两条链的寡聚核苷酸的 短片段，再退火成为两端活性末端的DNA双链片段；
b 将上述的DNA片段按照正确顺序进行退火，连接形成较长的 DNA片段，再用连接酶连接，形成具有完整编码序列的DNA ；
Principles of Gene Engineering
腺嘌呤、胞嘧啶碱基上的氨基用苯甲酰基（bz） 保护，鸟嘌呤碱基上的氨基用异丁酰基（Ib）保 护，5‘-OH用二甲氧三苯甲基（DMT）保护。合 成的每个循环周期分为4个步骤：脱去保护基、偶 联反应、封端反应和氧化反应。
Principles of Gene Engineering
c 将完整编码的DNA与载体连接，导入合适的宿主细胞中，实现 分子克隆。
目前，还可以采用化学（连接）酶促相结合的方法合成 寡聚核苷酸，可以提高反应的专一性，减少副反应，提 高产率等。
Principles of Gene Engineering
短的寡核苷酸片段连接成长的基因的两种方式
小片段互 补粘接