201011298银耳多糖单糖组成分析的三种色谱方法比较

银耳多糖单糖组成分析的三种色谱方法比较
韩威1，姜瑞芝2，陈英红2，高阳3，高其品3*
（1．延边大学，吉林延吉133002；2．吉林省中医药科学院，吉林长春130012；3．长
春中医药大学，吉林长春130117）
摘要：为选择一种准确快捷的方法测定银耳多糖的单糖组成，对薄层色谱法（TLC）、气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）三种色谱方法进行比较。

结果表明，前两种方法的测定结果均不理想，而HPLC法，操作简便，灵敏度高，分离效果好，信息完整。

测定结果为由葡萄糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、木糖、岩藻糖组成，其摩尔比为0.24：1.00：0.06：0.29：0.25。

HPLC法对酸性杂多糖组成糖分析是一种比较理想的选择。

关键词：银耳多糖；单糖组成；TCL；GC；HPLC
Comparison of three kinds of chromatographic methods for monosaccharide composition analysis of Tremella polysaccharide
Han Wei1, Jiang Rui-zhi2, Chen Ying-hong2, Gao Yang3, G ao Qi-pin3*
(1. Yanbian University, Yanji 133002, China; 2. Academy of Traditional Chinese Medicine and Material Medical of Jilin Province, Changchun 130012, China; 3. Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China)
Abstract：To find an accurate and fast method to determine the monosaccharide composition of Tremella polysaccharide, thin layer chromatography (TLC), gas chromatography (GC) and high performance liquid chromatography (HPLC) was compared. The results of TLC and GC were not significant. However, HPLC was a simple method, showed high sensitivity, good resolution and integrity information. The result of HPLC analysis showed that the monosaccharide composition were Glc, Man, GlcA, Xyl and Fuc, with the mole percentage of 0.24:1.00:0.06:0.29:0.25. Consequently, HPLC is the most suitable method for monosaccharide composition analysis.
Key words：Tremella polysaccharide; monosaccharide composition; TLC; GC; HPLC 银耳（Tremella fuciformis Berk）是真菌类银耳科银耳属植物，也叫白木耳，
基金项目：十一五国家科技重大专项（No. 2009ZX09103-333）；国家自然科学基金（No. 30873370）
*通讯作者Tel：（0431）86172070；E-Mail：gaoqipin@
在我国有悠久的药食兼用历史，具有增强人体免疫力的作用。

近年来，对银耳多糖的化学及药理活性方面的研究很多，有提高机体免疫力、降血糖、降血脂、抗衰老、抗溃疡、增强肿瘤患者对放、化疗的耐受力及升高白细胞等作用[1-4]。

多糖研究中单糖组成分析是一项重要内容，随着科学仪器及研究手段地发展，目前已有多种方法应用于多糖的单糖组成分析中，但不同的分析方法报道的结果有一定差异[5-9]。

为进一步了解各分析方法的特点和差异，本文以银耳多糖为研究对象，分别采用薄层色谱法、糖醇乙酸酯衍生物、糖醇乙酸酯酰胺衍生物气相色谱法及柱前衍生高效液相色谱法进行了单糖组成分析，并对各方法的特点和测定结果进行了比较，为多糖组成糖分析提供科学参考依据。

1 材料与仪器
纤维素板（美国Sigma公司）；752紫外分光光度计（上海精密仪器科技有限公司）；9790型气相色谱仪（浙江温岭），色谱柱为1%OV-225不锈钢填充柱（2 m×0.3 cm）；LC-2010C高效液相色谱仪（日本岛津）；SPD-M10A
（Φ4.6 mm×150 mm）紫外检测器；色谱柱为XDB-C18分析柱（Agilent公司）
银耳子实体（产自福建省古田县）购自市场；牛血清白蛋白对照品（BSA），单糖标准品：岩藻糖（Fuc）、阿拉伯糖（Ara）、木糖（Xyl）、甘露糖(Man)、葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、甘露糖醛酸(ManA)、葡萄糖醛酸(GlcA)、半乳糖醛酸(GalA)均购自美国Sigma公司；衍生化试剂: 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）和三氟乙酸（TFA）购自国药集团化学试剂有限公司；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为国产分析纯。

2 实验方法
2.1 银耳多糖的制备
取银耳子实体10 g，除去托盘，加20倍量的水，煎煮两次，每次6 h，合并滤液，浓缩至一定体积，加乙醇沉淀，静置过夜，离心，沉淀冷冻干燥，即得。

2.2 银耳多糖理化性质的测定
采用苯酚-硫酸法[10]，以Man为对照品测定中性糖含量；采用间羟基联苯法[11]，以GlcA为对照品测定糖醛酸含量；采用Lowry法[12]，以BSA为对照品测定蛋白质含量。

结果表明银耳多糖由酸性杂多糖组成。

2.3 银耳多糖组成糖分析
2.3.1 薄层色谱法[8]
银耳多糖10 mg，TFA水解，NaOH中和，蒸干，残渣加水溶解，为供试品溶液。

另取岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖对照品配成对照品溶液，点于同一纤维素薄层板上，以正丁醇-吡啶-冰醋酸-水（10：6：1：3）为展开剂，苯胺-邻苯二甲酸显色。

2.3.2 气相色谱法
2.3.2.1 糖醇乙酸酯衍生物气相色谱法[13]
精称样品20 mg，TFA水解，蒸干。

残渣加甲醇吹干，反复三次。

其水溶液加0.3 g Dowex1树脂搅拌1 h，离心，上清液蒸干为中性糖部分。

树脂用0.1 mol/L HCl洗脱，洗脱液蒸干得酸性糖部分。

该部分经硼氢化钠还原后，分别进行乙酸酯衍生化。

另取岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖标准品按供试品制备方法操作，制成对照品溶液。

分别取1 μL注入气相色谱仪，以1%OV-225为固定液，柱温为195 ℃。

2.3.2.2 糖醇乙酸酯酰胺衍生物气相色谱法[14]
精称样品20 mg，TFA水解，吹干。

残渣加甲醇吹干，反复三次。

残渣进行乙酸酯酰胺衍生化处理。

另取岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖醛酸、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸对照品按供试品制备方法操作，制成对照品溶液。

分别取1 μL注入气相色谱仪，以3%SP-2340为固定液，柱温为程序升温：190 ℃→260 ℃，5 ℃/min。

2.3.3 PMP柱前衍生高效液相色谱法
取各单糖对照品适量，加蒸馏水配成2×10-3mol/L的溶液；精确称取银耳多糖样品20 mg于具塞试管中，加入2 mol/L TFA 2 mL，100 ℃水解8 h，蒸干加甲醇溶解，再蒸干，重复4-5次，除尽TFA。

取配好的2×10-3mol/L 标准单糖溶液以及多糖样品溶液置于不同试管中，依次加入6 mL 0.5 mol/L 的PMP甲醇溶液和5 mL 0.3 mol/L NaOH溶液，混匀；70 ℃水浴反应30 min，取出，冷却10 min，用5 mL 0.3 mol/L HCl中和，加入等体积氯仿萃取，取水层，重复3次，取上层静置，待用。

色谱条件为：色谱柱：Agilent XDB-C18分析柱；柱温：40 ℃；流动相：A：磷酸盐缓冲液（pH 6.8）：乙腈（85：15，V/V）；B：磷酸盐缓冲液（pH
6.8）：乙腈（60：40，V/V）；流速：0.9 mL/min；检测波长：250 nm。

梯度洗脱，时间梯度0 min→10 min→30 min，相应的浓度梯度为0→8%→20%；进样体积10 μL。

3 结果与讨论
3.1 理化性质测定结果
按2.2方法测定，银耳多糖中性糖含量占73.3%，酸性糖含量占25.7%，蛋白质含量为2%。

3.2 组成糖测定结果
3.2.1 薄层色谱法测定结果分析
TLC法分析结果见图1。

此法操作简单，快速，但由于多糖水解成单糖后其极性相近，达不到理想的分离效果，又由于TLC法灵敏度低，样品中含量少的斑点模糊不清，所以，此法不能准确确定银耳多糖单糖组成。

图1薄层色谱法测定结果
Fig 1 The results of thin layer chromatography
1 Fuc;
2 Ara;
3 Xyl;
4 Man;
5 Gal;
6 Glc; 7－9 样品
3.2.2 气相色谱法测定结果分析
3.2.2.1 糖醇乙酸酯衍生气相色谱法测定结果分析
采用糖醇乙酸酯衍生物气相色谱法分析结果见图2。

该法具有较高的灵敏度，组成糖分析结果表明，银耳多糖中性糖由Fuc、Xyl、Man和Glc组成，酸性糖由GlcA组成，中性糖和酸性糖各组份均可达到基线分离。

但是，此方法必须对中性糖和酸性糖分离后分别制备衍生物测定，使实验量增大。

图2 糖醇乙酸酯衍生物气相色谱法测定结果
Fig 2 The results of alditol acetates precolumn-derivatization gas chromatography
A: 1 Fuc; 2 Xyl; 3 Man; 4 Glc; 5 未知物B: 6 GlcA
3.2.2.1 糖醇乙酸酯酰胺衍生物气相色谱法测定结果分析
采用糖醇乙酸酯酰胺衍生物气相色谱法分析，尽管中性糖和酸性糖两部分的信息可在同一张图谱中出现，但从灵敏度看对含量少的组分检测不出来。

从标准糖图谱的分离效果看五碳糖的分离效果理想，而六碳糖和糖醛酸均达不到基线分离。

此方法可应用于单糖组分较少的多糖组成分析。

结果见图3。

图3 糖醇乙酸酯酰胺衍生物样品气相色谱法测定结果
Fig 3The results of alditol acetates amide precolumn-derivatization gas chromatography
1 Fuc;
2 Xyl;
3 Man;
4 Glc;
5 未知物;
6 GlcA
3.2.3 PMP柱前衍生高效液相色谱法测定结果
利用PMP衍生物在紫外250 nm处有较强的吸收，本实验考察了不同衍生化温度（60 ℃、70 ℃、80 ℃）、衍生化时间（30 min、45 min、60 min）对测定结果的影响，得出最佳反应条件为：反应温度70 ℃，反应时间30 min。

在此条件下，对银耳多糖衍生物进行液相色谱分析均具有良好的分离度。

采用PMP-HPLC法分析结果如图4。

其中峰1-6依次为PMP、Man、GlcA、Glc、Xyl和Fuc，其中各单糖的摩尔比为Glc: Man: GlcA: Xyl: Fuc= 0.24:1.00:0.06:0.29:0.25。

这与文献[6]报道的结果有所不同，原因可能是不同的提取分离方法得到的多糖组分不同。

图４银耳多糖的PMP柱前衍生液相色谱法测定结果
Fig 4 The results of PMP precolumn-derivatization HPLC
1 PMP;
2 未知物;
3 Man;
4 GlcA;
5 Glc;
6 Xyl;
7 Fuc
4 结论
TLC法虽无需衍生化处理，操作简单，但各单糖之间的分离效果差，适合于单糖组成较为简单的多糖的定性分析。

应用糖醇乙酸酯、糖醇乙酸酯酰胺衍生物气相色谱法和PMP柱前衍生高效液相色谱法，样品均需要衍生化处理，但前两者衍生化处理步骤十分繁琐，而且糖醇乙酸酯酰胺衍生气相色谱法的分离效果也不好，而PMP-HPLC法最适合对单糖组成比较复杂的酸性杂多糖的分析，该方法操作简便, 分离效果，重现性，稳定性及信息的完整性都好于其它方法。

此方法可作为多糖的单糖组成分析的最佳测定方法。

参考文献
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