第十章 植物愈伤组织

不同外植体胚性愈伤组织发生
基因型 genotype
愈伤组织类型
7742
新克旱9 XinKehan
callus type
胚性愈伤组织 embryogenic callus
成熟胚 mature embryo
幼穗 immatur e spike
成熟胚 mature embry
o
幼穗 immatu re spike
**低盐浓度的培养基，如White培养基（1943），WS（Wolter和Skoog，1966） 和HE培养基（Heller，1953）。
以上4种类培养基中，前两种培养基较适合愈伤 组织诱导和细胞培养，但选用那类培养基，还应依 植物种类、基因型、外植体等而定；后两类培养基 则有利于根的形成。诱导愈伤组织常用的培养基为 MS和B5。高盐浓度的培养基可能对培养过程中愈 伤组织数量及鲜重增加有益。
第二节 愈伤组织形态建成
一 愈伤组织形态建成的方式
1、通过产生单极性的不定芽，再在不定芽的下方长出 不定根，同时在二者之间形成微管束组织，进而形成 完整植株，多数植物属这种类型。 2、产生单极性的不定根，再在不定根的上方产生不定芽，并在二者之 间分化出微管束组织，形成完整植株，这种类型在双子叶植物中较常见， 而单子叶植物则少有。 3、愈伤组织仅分化出不定根或不定芽，而形成无根苗或无苗根。 4、在愈伤组织临近部位分化出不定根和不定芽，然后两者再结合起来， 再形成完整植株，此时根和芽的微管束一定要相连，否则植株不能成活 （丛生苗）。 5、通过体细胞胚胎途径再生植株，也是一种较为常见类型。
三 Callus诱导、增殖及形态建成调控
颜色 表面 质地 胚性细胞的多少 细胞形态 细胞质 内含物 细胞核及核仁
胚性愈伤组织 淡黄 光滑
坚硬但易碎 大量
小，圆球形 浓厚，染色深
多 核明显，大，核仁多
非胚性愈伤组织 白色 粗糙
松散，水渍状 极少或无
管状或不规则形 稀薄，染色浅
少 核小，核仁少，或无核
a.Shoot and formation on N6 modified media.
b.Rooting of callus on N6 modified media
ration of Local Rice Varieties
5、培养基成分
（1）生长调节物质
培养基中生长调节物质对愈伤组织的诱导及增殖起着重 要的调节作用。 A、生长素和细胞分裂素
愈伤组织生长周期
愈伤组织生长周期为2－3周。一般2－3周继代一次。
继代时应注意愈伤组织分割。 继代时间与植株再生能力及变异
以往研究认为继代时间长再生能力减弱甚至丧失，但 目前多数研究认为长期继代培养的愈伤组织仍有再生 能力。
继代时间与变异
愈伤组织在培养基上保持的时间 愈伤组织经长期继代培养，大多数物种基因型的
1 基因型—重要影响因素
**基因型对离体培养条件反应的差异在以往报道中也多有提 及，表明离体培养过程，对起始材料的选择是十分重要的。 **基因型是控制愈伤组织形态建成的关键。不同物种的外植 体诱导的愈伤组织器官分化明显不同，如烟草、胡萝卜、苜 蓿等较易发生器官分化，而禾本科（禾谷类）、豆类、棉花 等的愈伤组织形态建成相对较难。 **同属不同种，甚至同一物种不同品种的愈伤组织器官分化 的能力也不同。
2,4-D浓度对如意叶片愈伤组织诱导的效应
不同激素配比对如意叶片愈伤组织诱导与分化的影响
NAA对如意愈伤组织根分化的影响
各种生长素对黄瓜各外植体愈伤组织诱导的效应 （各种生长素浓度为10μmol/L）
生长素
IBA
NAA
2,4-D
NOA （萘氧乙酸 ） NOP （萘氧丙酸 ）
种子
无愈伤组织形 成
Callus establishement
Cell division: Active cell division, cells revert to a meristematic (dedifferentiated) state.
Callus establishement
Differentiation: Appearance of cellular differentiation and the expression of secondary metabolic pathways.
小麦幼胚
诱导期
分裂期
分裂期
分化期
愈伤组织诱导形成过程
分化期
** 愈伤组织保持与继代培养
愈伤组织颜色
Callus无任何形态结构，新鲜愈伤组织颜色为奶黄色 或白色有光泽，少数也有淡绿色或绿色；老化的愈伤 组织则转变为黄色至褐色。
愈伤组织保持时间 已诱导并建立起来的愈伤组织可以长期保存，如有报 道大豆细胞系的愈伤组织在24℃和弱光下已保持15 年。
在愈伤组织诱导、增殖和形态建成过程中，对其调控幅 度最大的是植物生长调节物质，主要调节生长调节物质的 种类、浓度和比例，其中生长素和细胞激动素的浓度和配 比对大多数植物材料愈伤组织的诱导、增殖和形态建成的 调控起重要作用。对绝大多数植物材料而言，2,4-D 是诱 导愈伤组织和细胞悬浮培养的最有效物质，常用浓度为 0.2～2mg/L，为促进细胞和组织的生长还要加入0.5～ 2mg/L的细胞激动素（KT）。
①
②
③
④
⑤
无根苗
形成有根苗
Development of organs(roots, shoots, etc.) or embryos (embryo-like structures)
二、具形态建成和不具形态建成能力的愈伤组织
**外植体细胞经离体诱导所形成的愈伤组织并不完全都 具有形态建成的能力。 **具有形态建成能力的愈伤组织都具有一定的形态结构 特点。 **具形态建成和不具形态建成能力的愈伤组织之间的差 异是相对的，有时通过控制培养条件，尤其是生长调节 物质和继代的方式可以调控其进行形态建成。
无愈伤组织形 成
所有外植体均 产生 愈伤组织
无愈伤组织形 成
无愈伤组织形 成
愈伤组织形成 下胚轴 愈伤组织增殖强
所有外植体均产生 愈伤组织 2,4-D浓度为1μmol/L时 愈伤组织生长良好
果皮 IBA浓度为1μmol/L时 愈伤组织生长良好 愈伤组织增殖强
愈伤组织增殖强
愈伤组织增殖中等
愈伤组织增殖中等
**硝酸钾含量较高的培养基，如B5（Gamborg等，1968）、N6（朱至清等， 1975）、SH（Schenk 和 Hildebrandt，1972），这类培养基的盐浓度也很高， 其中NH+4和PO-34是由NH4H2PO4提供。
**含盐量中等的培养基，如H（Bourgin 和 Nitsch，1979）培养基，这类培养基中 大量元素为MS的1/2，微量元素种类减少，但含量增加，维生素种类比MS的多， 在Nitsch培养基中生物素提高了10倍。
+
+
-
-
非胚性愈伤组织
non-embryogenic
+
+
+
+
callus
胚性愈伤组织发生率
embryogenic callus
78
1
0
0
generating rate(%)
马铃薯不同基因型对愈伤组织诱导的影响
2 外植体
①一般而言，分化水平较低的薄壁细胞和处于分裂的分生组织细胞 较易诱导出愈伤组织。薄壁细胞分化水平较低，有较大发育的可塑性， 其进行分裂的潜力可保持很多年，如25年树龄的椴属茎的薄壁细胞还 可以诱导形成愈伤组织。
②分生组织细胞分裂潜能强，细胞分裂是脱分化形成愈伤组织的前 提，因此是诱导愈伤组织适合的外植体。
③不同器官作为外植体所诱导的愈伤组织，其器官发生能力，有的 植物差别不大，如烟草和水稻；而有的则明显不同，如翅鞘莎，以根、 茎和叶为外植体时，愈伤组织的分化带有器官来源的特征，如根外植 体的愈伤组织易分化出根。
3 外植体的生理年龄
外植体的生理年龄也影响愈伤组织器官发生的能力， 如油菜植株的茎段自下而上进行培养的效果不同，下 部器官形成率较低，而上部形成愈伤组织的苗分化率 则较高（下表）
表4 油菜茎的不同节位与苗分化的关系（品种23）
部位（由上而下） 1 2 3 4 5 6 7
分化苗频率％ 73.3 53.9 22.2 7.1 0.0 0.0 0.0
愈伤组织增殖中等愈伤组 愈伤组织增殖强 织增殖强
不同激素组合对蚕豆愈伤组织细胞染色体数目的影响
不同激素组合和浓度对蚕豆愈伤组织细胞倍性及染色 体畸变的影响
B、乙烯 愈伤组织在培养过程中可产生大量乙烯，而且受培
养基中的生长调节物质的调节，而且生长素和细胞分裂 素对愈伤组织的某些生理作用可能通过乙烯而起作用。 外加乙烯对愈伤组织的形态结构和形态建成具有调节作 用。
**如烟草、胡萝卜等脱分化很容易，而禾谷类的脱分化 较前者难；花器官脱分化较易，而茎叶则较难；幼茎组 织脱分化较易，而成熟的老组织较难。
**愈伤组织在分裂期会出现导管细胞，筛管细胞，分泌细胞， 毛状体细胞及木栓细胞等，并出现由小而密集的分裂细胞构 成的细胞团，称为拟分生组织。 **这些区域化的细胞团往往在以后分化中称为形成芽原基及 根原基的中心，愈伤组织也经常呈颗粒状的外形，这些颗粒 中含有韧皮部、木质部和形成层组织，这种具有类似微管组 织的愈伤组织颗粒也具有分化形成不定芽和不定根的能力。
**诱导期长短因植物种类、外植体的生理状态和外部因素 而异，即使同一种物种不同基因型同一外植体的愈伤组织 诱导期也不同。
**如有的植物愈伤组织诱导期只有1天（菊芋），而有的 植物诱导期需要几天（胡萝卜），而刚收获得菊芋块茎诱 导期只要22h，经贮藏5个月后，其诱导期延长到2天。
**愈伤组织进入分裂期时，外植体的脱分化因植物种类、 基因型、外植体种类和生理状况而有很大差异。
愈伤组织形成
特点
诱导期 分裂期
改变原来的分化方向和代谢方式， 合成代谢加强，合成大量蛋白质和 核酸物质为细胞的分裂和增殖奠定 基础
外植体外层细胞开始分裂，细胞 脱分化，愈伤组织结构疏松，缺 少组织结构，颜色浅而透明
分化期
Callus表层细胞分裂逐渐停止， 而转向其内部的局部地区，并改 变分裂面的方向，出现瘤状结构 外表，Callus中可以发现维管组 织，但不形成维管系统
愈伤组织再生能力降低，且受遗传因素控制，依不同 基因型而异，但也有例外，有的基因型的植株再生往 往在愈伤组织经多次继代后而产生
注意：
**愈伤组织遗传上的不稳定性因基因型、外植体、培养基成分和培养时间 而异。 **同基因型的同一种外植体在不同培养基上会产生不同的变异。 **组织培养中涉及到的遗传变异主要是细胞核组成的改变，变异是不可逆 的，这种遗传上的改变可以是染色体畸变，细胞核破碎，或者是由于细胞 内复制引起的多倍性以及分子水平上的改变等形式。 **培养基成分，特别是外源激素的成分与变异的产生密切有关。
每块苗数 4.0 2.1 0.5 0.1 0.0 0.0 0.0
外植体苗龄对蚕豆愈伤组织诱导的影响
红豆杉不同外植体的愈伤组织诱导情况
4、培养基类型
依培养基配方中含盐量多少可将目前培养基分为4类：
**含盐量较大的培养基，如Murashige and Skoog于1962年设计的MS培养基以及 改良的MS培养基，这类培养基含较高浓度的硝酸盐、铵盐和钾盐，微量元素非 常全，此外LS（Linsmaier and Skoog, 1965）、BL(Brown and Lawrence, 1968)、ER(Eriksson, 1965)培养基也属于这类培养基。
形态建成方式
通过产生单极性不定芽或不定根， 再在不定芽下方长出不定根或在 不定根上产生不定芽，并在二者 之间分化出维管束组织形成完整 植株
通过体细胞胚胎 途径再生植株
Callus仅分化出不定根或不 定芽而形成无根苗或无苗根
在Callus的邻近部位分化出 不定根和不定芽，然后二者 通过维管束组织结合起来形 成完整植株
第十三章 植物愈伤组织
第一节 愈伤组织的诱导和形成 第二节 愈伤组织形态建成 第三节 愈伤组织的形成及其形态
建成的某些生理生化基础
第一节 愈伤组织的诱导和形成
愈伤组织
是在离体培养条件下，经植物细胞脱分化和不断增殖 所形成的无特定结构的组织 。经一段时间的生长和增殖 以后，在其内部出现一定程度的分化，产生出一些具有分 生组织结构的细胞团、色素细胞或管状分子。在离体条件 下，植物细胞全能性的表达，是使细胞发生分裂形成愈伤 组织而实现的。