电化学发光检验的原理
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缺点 半衰期短,试剂货架期不长。 标记物不断变化,试剂批间、批内变化大,标准曲线不能保存。 反应时间长,操作步骤很难自动化。 使用放射性核素,对人体有一定的危害性。 分析的限度为 10 mol/ml 或 10 g/ml。
放射免疫分析技术开创了体液微量物质定量分析的新领域,并为其他标记免疫分析奠定了基础。放 射免疫技术是临床实验室l重要检测手段,已广泛应用于激素、维生素、药物、肿瘤标志物、病原 微生物抗原(抗体)的定量分析。
数字信号转化成浓度,报结果。The end!
总结
双抗体夹心法: 1)测定大分子抗 原 2)测定成正比: 信号低=浓度低, 信号高=浓度高
检测有多个结合 位点的抗原,如 TG,TSH,PRL, FSH,LH等。
竞争法: 1)测定小分子抗 原 2)测定成反比: 信号低=浓度高, 信号高=浓度低
检测仅一个结合 位点的抗原,如 FT3,FT4,TT3, TT4,TG-Ab,TRAb,E2,孕酮, 睾酮等。
1996年德国宝灵曼公司推出Elecsys 2010系统 世界上第一台 应用电化学发光技术的全自动免疫分析仪 1998年罗氏公司收购宝灵曼公司 2001年罗氏推出电化学发光免疫模块E 170 罗氏是全球唯一 应用电化学发光免疫技术制造仪器的厂商 2006年罗氏推出电化学发光免疫模块e601 2007年罗氏推出电化学发光免疫模块e411
化学发光免疫测定法
化学发光免疫测定法出现于20世纪90年代初。由于最后测定的是光子的量, 不但对检测者无害,其敏感度和精密度均优于RIA,而且试剂较稳定,并可 进行全自动分析。
缺点
采用标记催化酶(如辣根过氧化物酶)或化学发光分子(如鲁米诺)的方 法,其化学反应一般不稳定,为间断的、闪烁性发光,而且在反应过程中 易发生裂变,导致反应结果不稳定。 检测时需对结合相与游离相进行分离,操作步骤多。 反应原理相对落后。(间接发光)
3.高稳定性 ↆ
亲和常数高, 解离常数很低。
4 最终在反应杯里形成磁颗粒连接的抗原抗体复合物
5 反应杯中的复合物被转移至测量池
测量池中启动磁场,吸附磁颗粒连接的免疫复合物。 加入Procell溶液,去除反应体系杂质并提供三丙胺TPA 。
6 在测量池电场环境下TPA提供电子,激发钌发出光信号
7 测量池中的工作电极采集光信号
[Ru(bpy)3]2+-e¯→ [Ru(bpy)3]3+(强氧化剂)
TPA·+ [Ru(bpy)3]3+ → [Ru(bpy)3]2++ TPA
ↆ γ光子(620nm)
电化学发光原理
底物:三联吡啶钌[Ru(bpy)2+3] N羟基琥珀酰胺酯(NHS) 三丙胺(TPA)
在电极阳极表面,以上两种电化学活性物质同时失去电子发生氧 化反应,2价的[Ru(bpy)2+3] 标记物被氧化成3价的[Ru(bpy)3+3] 的标 记物,TPA被氧化成阳离子自由基TPA+* , TPA+* 很不稳定,自发地失 去一个质子而形成自由基TPA* ,其为强还原剂,将一个电子给3价的 [Ru(bpy)3+3] ,使其成为激发态的Ru(bpy)2+3 ,而TPA自身被氧化成氧 化产物。激发态的Ru(bpy)2+3衰减时发射一个波长620nm的光子,重新 形成基态的Ru(bpy)2+3 。这一过程在电极表面周而复始进行,产生许 多光子。使得光信号增强。
电化学发光的反应步骤
① 双抗体夹心法
② 竞争法
两种方法在反应原理上并没有什么不同,最后都是检测钌标记回到基 态所释放的光信号。只不过竞争法多加入了一种竞争物,和放射免疫 分析有异曲同工之处。
1 试剂/样本加入反应杯
第一抗体标记生物素(与微磁珠结合) 第二抗体标记钌Ruthenium(产生光信号)
电化学发光技术的优势
与其它几种标记免疫测定技术相比,电化学发光具有更多的优点: 1. 高灵敏度,检测下限达pmol; 2. 线形范围宽,达7个数量级; 3. 快速,出第一个结果的时间仅需数分钟; 4. 应用范围广,可以同样的灵敏度和线性范围检测各种物质,包括DNA; 5. 试剂稳定,无污染和衰变问题; 6. 自动化程度高。
电化学发光免疫技术
电化学发光免疫测定法(ECLIA)发展于 1996年,它在 发光反应中加入了电化学反应,是继放射免疫、酶免疫、 化学发光免疫测定之后的新一代标记免疫测定技术,是 电化学和免疫测定相结合的产物。
世界公认的 最先进 的临床免疫检测技术
二.电化学发光技术的发展史及其原理 1.发展历程
LOREM IPSUM DOLOR
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2 两种抗体皆能与靶抗原特异性结合,生成抗原抗体复合物
3 加入链霉亲和素包被的磁珠
磁珠直径2.8um, 表面凸凹,链霉亲和素包被,与生物素结合,生 物素-链霉亲和素特异亲和作用是目前已知的最牢固的非共价生物结 合作用。
生物素-亲和素放大系统
特点
1.高特异性 ↆ
高度特异性结 合
2.高敏感性 ↆ
4个结合位点
目录
1 免疫检测技术的发展 2 电化学发光系统及其原理 3 电化学发光技术的优势
一.免疫检测技术的发展
电化学发光
放免
酶免 荧光免疫 化学发光
1959 1970~80‘S
20来自百度文库0‘S
免疫检测技术三个重要的历程
放射免疫分析
1959年Berson和Yalow建立了放射免疫分析方法(RIA),大大提高了 免疫测定的敏感度,这种标记免疫测定开拓了医学检验的新领域 。
酶免疫测定法
1971年Engvall和Perlman建立了固相酶免疫测定方法(ELISA),这种非放 射标记免疫测定在临床检验,特别是感染性疾病的诊断中取得了广泛应用。
缺点 试剂制备困难。 操作步骤复杂,耗时长。 影响因素多,质量控制难以保证。 最后测定的是颜色的光密度,其精密度和敏感性不如发光免疫技术。
2.电化学发光反应原理
顾名思义,电化学发光(ECL)是电场参与化学发光所产生的结果,是指通过施加一定的电压进行电 化学反应:
[Ru(bpy)3]2+:三联吡啶钌,是一种电化学发光剂 TPA:三丙胺,电子供体。
失电子
(阳离子自由基,不稳定) ↆ
TPA-e¯→TPA+·- H+ → TPA·(强还原剂)
放射免疫分析技术开创了体液微量物质定量分析的新领域,并为其他标记免疫分析奠定了基础。放 射免疫技术是临床实验室l重要检测手段,已广泛应用于激素、维生素、药物、肿瘤标志物、病原 微生物抗原(抗体)的定量分析。
数字信号转化成浓度,报结果。The end!
总结
双抗体夹心法: 1)测定大分子抗 原 2)测定成正比: 信号低=浓度低, 信号高=浓度高
检测有多个结合 位点的抗原,如 TG,TSH,PRL, FSH,LH等。
竞争法: 1)测定小分子抗 原 2)测定成反比: 信号低=浓度高, 信号高=浓度低
检测仅一个结合 位点的抗原,如 FT3,FT4,TT3, TT4,TG-Ab,TRAb,E2,孕酮, 睾酮等。
1996年德国宝灵曼公司推出Elecsys 2010系统 世界上第一台 应用电化学发光技术的全自动免疫分析仪 1998年罗氏公司收购宝灵曼公司 2001年罗氏推出电化学发光免疫模块E 170 罗氏是全球唯一 应用电化学发光免疫技术制造仪器的厂商 2006年罗氏推出电化学发光免疫模块e601 2007年罗氏推出电化学发光免疫模块e411
化学发光免疫测定法
化学发光免疫测定法出现于20世纪90年代初。由于最后测定的是光子的量, 不但对检测者无害,其敏感度和精密度均优于RIA,而且试剂较稳定,并可 进行全自动分析。
缺点
采用标记催化酶(如辣根过氧化物酶)或化学发光分子(如鲁米诺)的方 法,其化学反应一般不稳定,为间断的、闪烁性发光,而且在反应过程中 易发生裂变,导致反应结果不稳定。 检测时需对结合相与游离相进行分离,操作步骤多。 反应原理相对落后。(间接发光)
3.高稳定性 ↆ
亲和常数高, 解离常数很低。
4 最终在反应杯里形成磁颗粒连接的抗原抗体复合物
5 反应杯中的复合物被转移至测量池
测量池中启动磁场,吸附磁颗粒连接的免疫复合物。 加入Procell溶液,去除反应体系杂质并提供三丙胺TPA 。
6 在测量池电场环境下TPA提供电子,激发钌发出光信号
7 测量池中的工作电极采集光信号
[Ru(bpy)3]2+-e¯→ [Ru(bpy)3]3+(强氧化剂)
TPA·+ [Ru(bpy)3]3+ → [Ru(bpy)3]2++ TPA
ↆ γ光子(620nm)
电化学发光原理
底物:三联吡啶钌[Ru(bpy)2+3] N羟基琥珀酰胺酯(NHS) 三丙胺(TPA)
在电极阳极表面,以上两种电化学活性物质同时失去电子发生氧 化反应,2价的[Ru(bpy)2+3] 标记物被氧化成3价的[Ru(bpy)3+3] 的标 记物,TPA被氧化成阳离子自由基TPA+* , TPA+* 很不稳定,自发地失 去一个质子而形成自由基TPA* ,其为强还原剂,将一个电子给3价的 [Ru(bpy)3+3] ,使其成为激发态的Ru(bpy)2+3 ,而TPA自身被氧化成氧 化产物。激发态的Ru(bpy)2+3衰减时发射一个波长620nm的光子,重新 形成基态的Ru(bpy)2+3 。这一过程在电极表面周而复始进行,产生许 多光子。使得光信号增强。
电化学发光的反应步骤
① 双抗体夹心法
② 竞争法
两种方法在反应原理上并没有什么不同,最后都是检测钌标记回到基 态所释放的光信号。只不过竞争法多加入了一种竞争物,和放射免疫 分析有异曲同工之处。
1 试剂/样本加入反应杯
第一抗体标记生物素(与微磁珠结合) 第二抗体标记钌Ruthenium(产生光信号)
电化学发光技术的优势
与其它几种标记免疫测定技术相比,电化学发光具有更多的优点: 1. 高灵敏度,检测下限达pmol; 2. 线形范围宽,达7个数量级; 3. 快速,出第一个结果的时间仅需数分钟; 4. 应用范围广,可以同样的灵敏度和线性范围检测各种物质,包括DNA; 5. 试剂稳定,无污染和衰变问题; 6. 自动化程度高。
电化学发光免疫技术
电化学发光免疫测定法(ECLIA)发展于 1996年,它在 发光反应中加入了电化学反应,是继放射免疫、酶免疫、 化学发光免疫测定之后的新一代标记免疫测定技术,是 电化学和免疫测定相结合的产物。
世界公认的 最先进 的临床免疫检测技术
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2 两种抗体皆能与靶抗原特异性结合,生成抗原抗体复合物
3 加入链霉亲和素包被的磁珠
磁珠直径2.8um, 表面凸凹,链霉亲和素包被,与生物素结合,生 物素-链霉亲和素特异亲和作用是目前已知的最牢固的非共价生物结 合作用。
生物素-亲和素放大系统
特点
1.高特异性 ↆ
高度特异性结 合
2.高敏感性 ↆ
4个结合位点
目录
1 免疫检测技术的发展 2 电化学发光系统及其原理 3 电化学发光技术的优势
一.免疫检测技术的发展
电化学发光
放免
酶免 荧光免疫 化学发光
1959 1970~80‘S
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免疫检测技术三个重要的历程
放射免疫分析
1959年Berson和Yalow建立了放射免疫分析方法(RIA),大大提高了 免疫测定的敏感度,这种标记免疫测定开拓了医学检验的新领域 。
酶免疫测定法
1971年Engvall和Perlman建立了固相酶免疫测定方法(ELISA),这种非放 射标记免疫测定在临床检验,特别是感染性疾病的诊断中取得了广泛应用。
缺点 试剂制备困难。 操作步骤复杂,耗时长。 影响因素多,质量控制难以保证。 最后测定的是颜色的光密度,其精密度和敏感性不如发光免疫技术。
2.电化学发光反应原理
顾名思义,电化学发光(ECL)是电场参与化学发光所产生的结果,是指通过施加一定的电压进行电 化学反应:
[Ru(bpy)3]2+:三联吡啶钌,是一种电化学发光剂 TPA:三丙胺,电子供体。
失电子
(阳离子自由基,不稳定) ↆ
TPA-e¯→TPA+·- H+ → TPA·(强还原剂)