微生物的接种分离与培养
实验五 微生物的分离、接种及培养法
实验五微生物的分离、接种及培养法一目的要求1.掌握倒平板的方法、划线分离法、稀释平板分离法和菌落（活菌）计数法。
2.熟练掌握微生物的接种技术，学会微生物的一般培养方法和无菌操作技术。
二实验原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
常用的分离方法有： 1) 平板划线分离法；2）稀释平板分离法。
在食品发酵工业中，通过微生物的分离、纯化，选育优良的微生物菌种，以提高产品的质量和产量；在食品卫生管理方面，需要进行微生物检测，必须将微生物单一分离出来，加以鉴别和研究。
土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。
因此土壤是微生物多样性的重要场所，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。
微生物的分离和接种是微生物学中重要的技术之一，需要严格的无菌操作，否则使得微生物实验毫无意义。
三实验材料1.菌种：葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、酵母菌、毛霉、曲霉、青霉等含菌样品。
2.培养基：肉汤蛋白胨培养基（斜面、平板）、肉汤蛋白胨液体培养基、蔡氏琼脂培养基（斜面、平板）。
3.土壤（自带）或其他物品；无菌水，无菌培养基，无菌吸管，无菌三角瓶等。
四实验内容与步骤（一）微生物的分离技术1. 平板划线分离法借助划线使混杂的微生物在平板的表面分散开，以获得单个菌落，从而达到分离的目的。
具体方法如下：倒制平板→制备含菌样品稀释液→划线→倒置适温培养→观察记录（1)倒制平板：将固体培养基熔化→冷却至 50-55℃→注入培养皿内 15ml（无菌操作）→旋匀→静置凝固→即成平板→在皿盖边贴标。
（2)含菌样液制备：样品少许（1-10g），加入盛有无菌水的试管内，摇匀，制成菌悬液即可，能直接划线的样品（如体液、黏液、污水等），可省去这操作。
（3)划线：左手持平板，接种环经灼烧灭菌后，以无菌操作取样，迅速将接种环伸入培养皿，轻轻划线（切勿把平板表面划破）。
然后将培养皿倒置放入恒温培养箱37℃，培养24-48 小时，观察平板上出现的现象，注意菌落的形状，并做记录。
微生物分离鉴定步骤
微生物分离鉴定步骤
微生物的分离和鉴定是微生物学研究中非常重要的步骤，它可
以帮助我们了解微生物的种类和特性。
通常，微生物的分离和鉴定
包括以下步骤：
1. 样品收集，首先需要收集来自环境、生物体表面或其他来源
的微生物样品。
这可能涉及到采集土壤、水样、食品、空气或生物
体组织等样品。
2. 稀释和接种，将样品进行适当的稀释，然后在培养基上进行
接种。
这有助于分离出单一的微生物菌落，以便进行后续的鉴定。
3. 培养，接种后，将培养皿放入恒温培养箱中进行培养。
不同
类型的微生物可能需要不同类型的培养条件，如温度、氧气含量等。
4. 分离，在培养一段时间后，可以观察到菌落的形成。
选择单
一的菌落，进行分离培养，以获得纯培养物。
5. 形态学特征观察，观察微生物的形态学特征，包括细胞形态、大小、颜色等，可以初步了解微生物的特征。
6. 生理生化特性测试，进行一系列生理生化特性测试，如对不同营养物质的利用、酶活性、氧气需求等，以进一步了解微生物的特性。
7. 分子生物学鉴定，利用分子生物学方法，如16S rRNA序列分析，可以对微生物进行更精确的鉴定，包括确定其属种和种的分类位置。
以上是常规的微生物分离和鉴定步骤，通过这些步骤可以全面地了解微生物的特征和分类位置。
值得注意的是，不同的微生物可能需要不同的鉴定方法，有时可能需要结合多种手段进行鉴定，以确保鉴定结果的准确性。
微生物的接种与分离纯化技术及培养方法
微生物的接种与分离纯化技术及培养方法
（一）接种：将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。
1、接种工具和方法
1．接种针2.接种环3.接种钩4.5.玻璃涂棒6.接种圈7.接种锄8.小解剖刀
2、常用的接种方法
•１）划线接种２）点植接种３）穿刺接种４）倾注接种
•５）涂布接种６）液体接种７）注射接种８）活体接种
(二)、分离纯化
1 稀释倾注平板法：
1、先稀释样品，加入平板
2、倒平板时注意培养基温度
3、混合均匀
３、平板划线法：.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.
四格法
平板划线法：1、倒平板，标记培养基名称，编号和实验日期。
2、划线方法
微生物的培养方法
（一）一般培养法（需氧培养）
•培养温度:25~37℃；接种后平板、试管、三角瓶，置于恒温培养箱
（二）、厌氧培养方法
1、简易的厌氧培养法：
•（1）庖肉培养法
•（2）铁丝圈厌氧培养法
•（3）焦性没食子酸法
2、厌氧罐法
3、厌氧手套箱法
A、厌氧缸法：厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。
•接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内
培养。
B、厌氧罐法：装入待培养的对象，然后密闭罐盖，接着可采用抽真空→灌氮→抽真空→灌氮→抽真空→灌混合气(N2∶CO2∶H2=80∶10∶10，V/V)。
（三）二氧化碳培养法
•1、烛缸法2、二氧化碳置換法
•3、化学法：每一升用重碳酸钠0.4克与浓盐酸0.35亳升加入
•4、二氧化碳培养箱法。
微生物的分离、接种和培养技术
微生物的分离、接种和培养技术一、实验的目的和内容目的：掌握微生物接种和分离纯化技术，掌握无菌操作技术。
内容：用平板划线法分离微生物；学习斜面接种及穿刺接种等无菌操作技术。
二、基本原理在自然界中，各种微生物是在互为依赖的关系下共同生活的。
因此，为了取出特定的微生物进行纯培养，必须从中把他们分离出来。
微生物接种技术是进行微生物实验和相关研究的基本操作技能。
无菌操作是微生物接种技术的关键。
接种是将微生物或微生物悬液引入新鲜培养基的过程。
由于实验目的、培养基种类及实验器皿等不同，所用接种方法不尽相同。
斜面接种、液体接种、固体接种和穿刺接种操作均以获得生长良好的纯种微生物为目的。
分离培养微生物时，要考虑微生物对外界的物理、化学等因素的影响。
即选择该类微生物最适合的培养基和培养条件。
在分离、接种、培养过程中，均需严格的无菌操作，防止杂菌侵入，所用的器具必须经过灭菌，接种工具无论使用前后都要经过灭菌，且在无菌室或无菌箱中进行。
三、材料及器材（一）菌种：大肠杆菌、枯草杆菌，金黄色葡萄球菌，酵母菌。
（二）培养基：肉汤培养基试管斜面，肉汤半固体培养基，肉汤固体培养基试管斜面，肉汤固体培养基平板，查氏培养基试管斜面，查氏培养基平板。
易（三）仪器及其他工具：接种环，接种针，接种钩，镊子，酒精灯，火柴，酒精棉，试管架，标签纸，恒温培养箱等。
四、方法与步骤（一）接种。
1、试管菌种转接：试管细菌菌种转接主要用于菌种的活化、分离、纯化。
（1）将菌种试管与待接种的试管培养基依次排列，挟于左手的拇指与其他四指之间，用右手的无名指与小指和手掌边拔出棉塞并挟住。
（2）置试管口于酒精火焰附近。
（3）将接种工具垂直插入酒精火焰中烧红，再横过火焰3次，然后再放入有菌试管中，在管壁上停留片刻待其冷却。
（4）取少许菌种置于另一支试管中，按一定的接种方式把菌种接种到新的培养基上。
（5）取出接种工具，试管口和棉塞进行火焰灭菌。
（6）重新塞上棉塞。
（7）烧死接种工具上的残余菌，把试管和接种工具放回原处。
微生物培养与分离方法
微生物培养与分离方法大多数细菌均可以通过人工方法培养，而衣原体和病毒的分离培养往往需要活组织、鸡胚、特殊细胞株及动物接种。
只有将微生物培养出来才能对它进行研究、鉴定和应用。
一、接种与分离方法根据待检标本的性质、培养目的和所用培养基的种类，采用不同的接种方法。
1．平板划线分离培养法对混有多种细菌的临床标本，采用划线分离和培养，使原来混杂在一起的细菌沿划线在琼脂平板表面分离，得到分散的单个菌落，以获得纯种。
临床送检的标本如痰、咽试子、泌尿生殖道的分泌物和粪便等细菌检验均需要借助琼脂平板划线分离目的菌。
平板划线分离法通常有两种方法：（1）分区划线分离法：此法常用于含菌量较多的标本如痰、泌尿生殖道的分泌物和粪便或混合细菌的分离。
先用接种环挑取标本涂布于琼脂平板1区（占培养基总面积的1/4）并作数条划线，再于2、3、4区依次划线。
每划完一个区域，均将接种环烧灼灭菌1次，冷后再划下一区域，每一区域的划线均与上一区域的划线交接1~3次。
一个成功分区划线的平板，培养后分别观察1区形成菌苔，2区菌落连成线，3区和4区可分离到单个菌落。
（2）连续划线分离法：此法常用于含菌量不多的标本或培养物中的细菌分离培养。
方法是先将接种物在琼脂平板上1/5处轻轻涂抹，然后再用接种环或拭子在平板表面曲线连续划线接种，直至划满琼脂平板表面。
琼脂斜面接种法主要用于菌落的移种，以获得纯种进行鉴定和保存菌种等。
用接种环（针）挑取单个菌落或培养物，从培养基斜面底部向上划一条直线，然后再从底部沿直线向上曲折连续划线，直至斜面近顶端处止。
生化鉴定培养基斜面接种，用接种针挑取待鉴定细菌的菌落，从斜面中央垂直刺入底部，抽出后在斜面上由下至上曲折划线接种。
3．穿刺接种法此法多用于半固体培养基或双糖铁、明胶等具有高层的培养基接种，半固体培养基的穿刺接种可用于观察细菌的动力。
接种时用接种针挑取菌落，由培养基中央垂直刺入至距管底0.4cm处，再沿穿刺线退出接种针。
微生物的分离与培养技术
微生物的分离与培养技术微生物是指肉眼无法看到的微小生物体，包括细菌、真菌、病毒等。
研究微生物的分离与培养技术对于了解微生物的特性、功能以及应用具有重要意义。
本文将介绍微生物的分离与培养技术的基本原理和步骤。
一、分离微生物的基本原理和方法分离微生物是指从混合微生物群落中将特定微生物种类单独分离出来。
这对于研究微生物种类的多样性和个体差异性非常重要。
下面将介绍两种常用的分离微生物的方法。
1. 肉眼分选法肉眼分选法适用于鉴定和培养易于在富含营养物质的培养基上生长的微生物。
该方法通常用于分离细菌和真菌。
具体步骤如下：a. 首先，将混合微生物群落接种于富含营养物质的琼脂平板上（如营养琼脂平板）。
b. 然后，通过观察生长在琼脂平板上的细菌或真菌的形态、大小、颜色等特征，选择目标微生物。
c. 最后，用无菌的接种环将目标微生物划取到新的培养基上进行单独培养。
2. 稀释涂布法稀释涂布法可用于分离微生物样本中的单个细胞。
该方法适用于细菌和真菌的分离。
具体步骤如下：a. 首先，将微生物样本逐渐稀释至一定浓度。
b. 然后，取少量稀释后的样本使用平板计数法（将稀释后的样本涂布在琼脂平板上，并按照一定比例稀释），以得到适宜的菌落数。
c. 最后，通过观察琼脂平板上的菌落形态，选择目标微生物，并用无菌的接种环将目标微生物划取到新的培养基上进行单独培养。
二、微生物的培养技术培养微生物是为了让细菌、真菌等微生物在富含营养物质的环境中生长和繁殖。
培养技术有助于了解微生物的生长特性和生理特点。
下面将介绍两种常用的微生物培养技术。
1. 液体培养法液体培养法是将微生物接种于富含营养物质的液体培养基中，通过培养瓶或试管中的液体环境，利用微生物对营养物的吸收和转化来进行培养。
具体步骤如下：a. 首先，准备好富含营养物质的液体培养基。
b. 然后，用无菌技术将微生物接种到培养基中。
c. 最后，将培养瓶或试管密封好，放入恒温摇床中，控制培养温度和培养时间，观察微生物的生长情况。
微生物的接种分离和纯培养
穿刺接种技术：用接种针从菌种斜面上挑取 少量菌体并竖直穿刺到半固 体培养基中；
接种无菌操作步骤
1. 将菌种斜面和待接种新鲜斜面夹在左手 的食指、中指和无名指之间，大拇指按在两 只试管中间。右手旋松棉塞，便于拔出； 2. 右手拿接种环，竖直伸入火焰中，环端 及伸入试管中部分均充分灭菌；
I
冷却至 45℃左右
每皿约倒入15ml
肉汤培养基
II
III
0.2ml 0.2ml
0.2ml
微生物的计数
血球计数法 平板活菌计数法
计繁殖数法只适宜于单细胞状态的微生物 或丝状微生物产生的孢子
血球计数法
一、实验原理
血球计数器是一特制的厚载玻片，上面 刻有一定面积的方格，将盖玻片盖上后，由 于两者之间存在着距离使之形成一定容积的 小室。滴入待测样品后，使样品均匀充满小 室，在显微镜下计算小室内的菌数，换算成 单位体积的样品中所含的菌数。
度。
思考题
1. 微生物的纯种分离通常采用那些方法，并说明个 方法的特点。
2. 什么叫微生物的污染？如何防止？ 3. 从两种方法计数得出的菌液浓度是否一致？分析
误差产生的原因，由此比较一下两者的优缺点及 各自的适用范围。 4. 平板活菌计数中，为何选择生长有25～250个菌 落的平板？
碰到火焰，以免烧死菌体 6. 血球计数器要洁净干燥，滴入菌液时在盖玻片与
载玻片间不能有气泡 7. 血球计数时显微镜光线不宜太亮
实验安排（三人一组）
斜面接种：每组三支 液体接种：每组三支（大肠、四联、枯草各一支） 穿刺接种：每组二支（四联一支、变形一支） 平板划线分离：每人划一块平板（混合菌液) 稀释分离：I、II、III各一块平板（混合菌液) 血球计数：写出小格数目，并算出酵母菌液
微生物实验中的接种分离和培养操作步骤
微生物实验中的接种、分离和培养操作步骤微生物实验中的接种、分离和培养操作步骤一、目的要求1、掌握各种分离、接种方法。
2、掌握无菌操作基本环节。
二、实验说明微生物在自然界中呈混杂状态存在，要获得所需菌种，必需从中把它们分离出来。
在保存菌种时不慎受到到污染也需予以分纯。
微生物分离和纯化的方法很多，但基本原理却是相似的，即将待分离的样品进行一定的稀释，并使微生物的细胞（或孢子）尽量以分散状态存在，然后使其长成一个个纯种单菌落。
然而上述工作又离不开接种，即将一种微生物移到另一灭过菌的培养基上的过程。
三、实验材料1、恒温培养箱。
2、接种环、玻璃棒、吸管、酒精灯。
3、培养基（上次实验配制的）。
4、大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌。
四、方法步骤（一）接种的操作1、斜面接种（接金黄葡萄球菌）（1）操作前，先用75%酒精擦手，待酒精挥发后点燃酒精灯。
（2）将菌种管和斜面握在左手大姆指和其它四指之间，使斜面和有菌种的一面向上，并处于水平位置。
（3）先将菌种和斜面的棉塞旋转一下，以便接种时便于拔出。
（4）左手拿接种环（如握钢笔一样），以火焰上先将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管其余部位也过火灭菌。
（5）用右手的无名指、小指和手掌将菌种管和待接斜面试管的棉花塞或试管帽同时拔出，然后让试管口缓缓过火灭菌（切勿烧过烫）。
（6）将灼烧过的接种环伸入菌种管内，接种环在试管内壁或未长菌苔的培养基上接触一下，让其充分冷却，然后轻轻刮取少许菌苔，再从菌种管内抽出接种环。
（7）迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。
从斜面底部向上作“Z”形来回密集划线。
有时也可用接种针仅在培养基的中央拉一条线来作斜面接种，以便观察菌种的生长特点。
（7）迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。
从斜面底部向上作“Z”形来回密集划线。
有时也可用接种针仅在培养基的中央拉一条线来作斜面接种，以便观察菌种的生长特点。
（8）接种完毕后抽出接种环灼烧管口，塞上棉塞。
微生物的分离与培养技术原理及其应用-文档资料
微生物的分离与培养技术原理及其应用-文档资料
微生物的分离与培养技术是微生物学实验室中最基本、最重要的实验技术之一。
其主要原理是将混合微生物群落分离为单一的微生物菌落，并在适宜的环境条件下使其生长繁殖形成单一菌种培养物，以便进行鉴定和研究。
1.微生物的分离技术
（1）稀释涂布法：将微生物混合液逐渐稀释，然后取一定量的稀释液涂布在富养基平板上，待菌落形成后，挑取单一菌落进行培养和研究。
（2）过滤法：利用微孔膜或滤纸将混合液过滤，将过滤后留在微孔膜或滤纸上的微生物进行培养和研究。
（1）液体培养：将微生物接种在富足的液体富养基中，置于适当的温度、光照和通气条件下进行培养。
（3）混合培养：将两种或以上的微生物同时接种在同一富养基上进行培养，这一技术可同时培养多种微生物，缩短实验时间。
3.技术应用
微生物的分离与培养技术在微生物学研究、医学诊断、生物工程和食品工业等领域都得到广泛应用。
（1）微生物学研究：分离单一菌种进行研究，为微生物学研究提供基础。
（2）医学诊断：从临床样品中分离出致病微生物进行培养与鉴定，有助于快速准确地诊断、鉴定和治疗病原微生物感染。
（3）生物工程：在微生物培养基中添加营养物质，用微生物进行合成、代谢和分泌等反应。
（4）食品工业：将微生物培养在富有营养的富养基中进行发酵，生产出发酵食品。
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微生物的接种、分离纯化与培养方法一、接种将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。
１、接种工具和方法在实验室或工厂实践中，用得最多的接种工具是接种环、接种针。
由于接种要求或方法的不同，接种针的针尖部常做成不同的形状，有刀形、耙形等之分。
有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。
在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。
（图３－３）图３－３接种和分离工具1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀常用的接种方法有以下几种：１）划线接种这是最常用的接种方法。
即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。
常用的接种工具有接种环，接种针等。
在斜面接种和平板划线中就常用此法。
２）三点接种在研究霉菌形态时常用此法。
此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。
除三点外，也有一点或多点进行接种的。
３）穿刺接种在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。
做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。
用的培养基一般是半固体培养基。
它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。
４）浇混接种该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45°C左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。
待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。
５）涂布接种与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。
６）液体接种从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称为液体接种。
实验五 微生物的接种、分离与培养技术
合不紧密，用接种针容易挑起
，多数表面较光滑、湿润、较
粘稠，易挑取，质地均匀，色
泽多样。
细菌菌落特征：剖面图
细菌菌落特征：常见的平面正面图
吸管或吸嘴；如果只取少量而且勿需定量也可用接种
环，视实验目的而定
三、实验器材与试剂
菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆
菌等营养琼脂斜面
Hale Waihona Puke 培养基：肉汤营养琼脂斜面、肉汤营养液体
培养基
仪器和其它用品：接种环、酒精灯、无
菌玻璃吸管等
图1 接种和分离工具 1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀
实验五
微生物的接种、分离
与培养技术
一、目的要求
熟练掌握从固体培养基和液体培养基中转
接微生物的无菌操作技术 明确无菌操作的重要性
二、基本原理
高温对微生物具有致死效应，因此在微生物的转
接过程中，一般在火焰旁进行，并用火焰直接灼烧接 种环，以达到灭菌的目的，但一定要保证其冷却后方 可进行转接，以免烫死微生物。 如果是转接液体培养物，则用预先已灭菌的玻璃
四、操作步骤
火焰旁打开培养物试管帽 火焰旁挑菌落
火焰旁接种
空白组 静置培养
斜面接种时的无菌操作
(1)接种灭菌 (2)开启棉塞 (3)管口灭菌 (4)挑起菌苔 (5)接种 (6)塞好棉塞
斜面接种法及接种后菌落生长示意图
接种后菌落生长示意图菌苔(lawn)
细菌菌落的特征
一般都较小，菌落与培养基结
微生物的接种分离和纯培养
接种工具：接种环、接种针、 移液管和刮铲等
○ 接种必须在严格无菌的环 境中进行！
试验材料
菌种：四联球菌，大肠杆菌，枯 草杆菌，变形杆菌，混合菌液
培养基：牛肉膏蛋白胨液体培养 基，牛肉
膏蛋白胨固体培养基，牛肉膏蛋 白胨半固体培养基
其他：接种针，接种环，培养皿， 吸管，记号笔等
以无菌操作用接种环 沾取待分离的混合菌 液；
左手持盛培养基的三 角瓶，在火焰附近， 用右手手掌边夹取棉 塞，将三角瓶转移到 右手，瓶口过火；
左手持培养皿底并使 其面向火焰，划线， 划线距离恰当（尽量 靠近，但线与线勿碰 到）。
左手取一无菌培养皿， 在火焰边稍稍打开皿 盖，倒入培养基15ml 左右，放在桌面上轻 轻摇匀，待凝后即成 平板；
微生物的接种分离和纯培养
什么是纯种培养？
自然界中的微生物都是杂居在一起的，通过分离，
01
使它们由混杂状态到单个个体在固体培养基上成为
一个菌落，就获得纯种。
原理是将待分离的样品进行一定的稀释，使之分散，
02
在固体培养基上形成单个菌落，再转接到适当的培
养基上，就认为是纯种。
接种技术
接种技术是将微生物接到适 于生长繁殖的人工培养基或 生物体内的过程。
穿刺接种技术
一．用接种针以无菌操作挑取少许菌体穿刺与半固体培养基中间，刺至管底， 再按原途退出。穿刺时要做到手稳、动作轻巧、快速；
二．塞紧棉塞后，放入37℃恒温培养箱内培养24小时观察结果。
实验步骤之二分离法
01
琼脂平板划线分离法
02 稀释分离法
琼脂平板划线分离法
牛肉膏蛋白胨琼脂培 养基加热熔化后，冷 却至45℃左右；
微生物纯种分离,培养及接种技术实验原理
微生物纯种分离,培养及接种技术实验原理微生物纯种分离、培养及接种技术是微生物学中最基本的实验技术之一。
其目的是从混合的微生物菌群中分离出单一的微生物菌落，并在适宜的培养条件下进行纯化和生长，以获得纯种微生物。
一、实验器材和试剂1.灭菌针2.毛细胞计数板3.显微镜4.平板接种器、针头5.无菌匀浆棒、吸管6.细菌培养基7.消毒液二、实验步骤1. 样品处理及制备首先需要选择一份待测试的样品，包括土样、水样、空气、食品等，然后将样品采集到无菌容器中，再将其送到实验室。
在进行样品处理之前，需要先进行简单的初步处理，将样品进行稀释或者过滤，将其中的杂质和大颗粒物去除，以利于后续实验的操作。
接下来需要进行制备培养基，根据不同的微生物种类，需要选择适当的培养基进行培养。
通常情况下，我们可以使用凝胶培养基、液体培养基、甜菜汁培养基等，以满足微生物在不同环境下生长所需的营养物和成分。
2.分离纯化分离纯化是该实验的关键步骤。
将经过预处理的样品移到无菌试管中，打开试管口，加入适量的制备好的培养基，然后利用匀浆棒或吸管将混合物均匀混合。
然后利用平板接种器将混合物接种到培养基平板上，使其密切接触。
然后将接种好的平板置于恒温箱中，以利于微生物的生长和营养物质的自我繁殖。
在接种后2-7天内，不同类型的微生物将在培养基平板上生长出不同的菌落，每一种菌落都代表一种单一的微生物。
将这些菌落分离提取，并再次进行培养，就能得到单纯的微生物菌种。
3.纯种微生物菌种接种在获得单纯的微生物菌种之后，需要将其再次接种到培养基中进行培育。
将相应体积的纯种菌种接种到培养基平板上，使其能够生长繁殖。
在接种后约24小时内，微生物将在培养基中生长出许多菌落。
根据菌落的特征和形态，可以对不同的微生物进行鉴定和分类。
如果需要进行更加深入的分析，可以对微生物菌种进行进一步培养、萃取定量和测序等工作，以获取更多的相关信息。
三、实验注意事项1. 实验前需要保证实验室内部环境和仪器均为无菌状态。
微生物的培养与分离方法
微生物的培养与分离方法接种与分离方法根据待检标本的性质、培养目的和所用培养基的种类，采用不同的接种方法。
1．平板划线分离培养法对混有多种细菌，采用划线分离和培养，使原来混杂在一起的细菌沿划线在琼脂平板表面分离，得到分散的单个菌落，以获得纯种。
平板划线分离法通常有两种方法：①分区划线分离法：此法常用于含菌量较多的细菌的分离。
先用接种环挑取标本涂布于琼脂平板1区（占培养基总面积的¼）并作数条划线，再于2、3、4区依次划线。
每划完一个区域，均将接种环烧灼灭菌1次，冷后再划下一区域，每一区域的划线均与上一区域的划线交接1~3次。
一个成功分区划线的平板，培养后分别观察1区形成菌苔，2区菌落连成线，3区和4区可分离到单个菌落。
①连续划线分离法：此法常用于含菌量不多的标本或培养物中的细菌分离培养。
方法是先将接种物在琼脂平板上1/5处轻轻涂抹，然后再用接种环或拭子在平板表面曲线连续划线接种，直至划满琼脂平板表面。
2.琼脂斜面接种法主要用于菌落的移种，以获得纯种进行鉴定和保存菌种等。
用接种环（针）挑取单个菌落或培养物，从培养基斜面底部向上划一条直线，然后再从底部沿直线向上曲折连续划线，直至斜面近顶端处止。
生化鉴定培养基斜面接种，用接种针挑取待鉴定细菌的菌落，从斜面中央垂直刺入底部，抽出后在斜面上由下至上曲折划线接种。
3．穿刺接种法此法多用于半固体培养基或双糖铁、明胶等具有高层的培养基接种，半固体培养基的穿刺接种可用于观察细菌的动力。
接种时用接种针挑取菌落，由培养基中央垂直刺入至距管底0.4cm处，再沿穿刺线退出接种针。
双糖铁等有高层及斜面之分的培养基，穿刺高层部分，退出接种针后直接划线接种斜面部分。
4．液体培养基接种法用于各种液体培养基如肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等的接种。
用接种环挑取单个菌落，倾斜液体培养管，在液面与管壁交界处研磨接种物（以试管直立后液体淹没接种物为准）。
此接种法应避免接种环与液体过多接触，更不应在液体中混匀、搅拌，以免形成气溶胶，造成实验室污染。
微生物的接种、分离和培养
实验六微生物的接种、分离和培养一、目的要求1．理解和掌握微生物接种、分离基本技术的原理与操作要领。
2．熟悉微生物接种、分离的无菌操作过程。
3．了解微生物需氧培养的方法。
4．学会观察和描述微生物的各种培养性状。
二、实验原理1. 微生物接种指将微生物纯种或含菌材料转移到另一营养基质上的过程。
根据不同的目的可采用的不同的接种方法，如平板划线法、斜面划线法、浸洗法、涂布法、倾注法、穿刺法、点植法和影印法。
2. 微生物分离指依据微生物的特征，采用各种方法从含菌样品中获得由单一个体（如单一菌体或孢子）或一段菌丝生长繁殖形成的微生物群体的过程。
常用的分离方法有：平板划线法、稀释涂布平板分离法、稀释倾注平板分离法和单细胞分离法。
平板分离法的基本原理包括两个方面：（1）选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等要求或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
（2）微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。
因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。
值得指出的是从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。
因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。
3. 微生物培养指微生物被接种到营养基质后，在一定条件下生长繁殖的过程，分需氧培养法和厌氧培养法。
本实验所做的需氧培养法，是采用生化培养箱和恒温摇床进行的。
4. 微生物的培养形状培养性状是微生物在培养基上所表现的群体形态和生长情况。
平板菌落特征、斜面和液体培养特征、半固体穿刺培养特征等培养性状，是鉴定微生物的重要形态学依据。
菌落是由单个或少数细胞在固体培养基表面或里面生长繁殖所形成的眼可见的子细胞群体。
菌落形态会因菌种不同或菌种相同但所用培养基、培养温度和时间等条件不同而存在不同程度的差异。
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3、培养： 37℃恒温培养箱中培养24～48h后，观察结果。
图2 斜面接种时的无菌操作 (1)接种灭菌 (2)开启棉塞 (3)管口灭菌 (4)挑起菌苔 (5)接种 (6)塞好棉塞
斜面接种法及接种后菌落生长 示意图
接种后菌落生长示意图菌苔(lawn)
分离培养法
• 细菌分离培养的目的是获得纯种（单个
菌落）。
• 分离培养成纯种菌的方法有平板划线法、
倾注平板法和动物接种分离法等，其中
以平板划线法最为常用。
平板划线法
• 倒平板
• 挑取菌落
• 划线
• 注意：划线完毕，将琼脂平板培养基倒置，并在 培养皿底玻璃上，用记号笔注明接种菌名、接种 者姓名及班级、日期等，将培养皿倒置放在恒温 箱培养，以避免培养过程中凝结水自皿盖滴下。
长的条件，从而淘汰一些不需要的微生物。
2、微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个 细胞繁殖而成的集合体。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 实验材料
1．菌种：枯草芽孢杆菌斜面和平板中的未知菌落。
2．培养基：营养琼脂斜面、营养琼脂平板。
3．接种与分离工具：接种环、接种针、涂布棒等。 4．其它：平皿、恒温培养箱、酒精灯等。
•
【实验结果观察记录】
细菌生长情况的观察
• 观察琼脂平板表面生长的各种菌落，注意其大小、 形状、边缘、表面结构、透明度、颜色等性状。
• 观察斜面培养基表面生长的枯草芽孢杆菌的菌苔形状。
细菌菌落的特征
一般都较小，菌落与培养基结
合不紧密，用接种针容易挑起，
多数表面较光滑、湿润、较粘
稠，易挑取，质地均匀，色泽
倒 平 板
平板划线法的示意图
• 见图4-1：A B是最常使用的、最基本的方 法，其中图B常用于含菌量较少的标本。
图4-2 分区划线法示意图
• 三段分区法
四段分区法
五段分区法
培养后情况
细菌的群体形态
菌落（R型）
单菌落（clone)
菌苔(lawn)
菌落（S型）
culture plate
菌落(R型)
穿刺接种等，以获得生长良好的纯种微生物。
选择一种好的接种方法，对于微生物的分离、纯化、增殖
和鉴别等都很重要。因接种方法的不同，常需采用不同的接种
工具，如接种环、接种针、移液管和涂布棒等。
为了确保纯种不被杂菌污染，在整个过程中，必须进行严
格的无菌操作。
接种：将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或
多样。
细菌菌落特征：常见的平面正面图
细菌菌落特征：剖面图
思考题
1、平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
2、为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种 环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？ 3、在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一 次划线的末端开始划线？ 4、详细描述各种微生物在斜面、平板上的培养特征。
微生物的分离、接种与培养
目的要求
1、掌握无菌操作技术在微生物接种、分离过程中的重要性。 2、掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化的基本操作技
术。
3、通过对菌落特征的观察，可为初步鉴定微生物提供有 利资料，因其特征可作为微生物分类鉴定的指标之一。
实验原理
微生物的接种技术是生物科学研究中的一项最基本的操作 技术。由于目的不同，可采用不同的接种方法，如斜面接种、
活的生物体内的过程叫做接种。
分离与纯化：从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或
某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
稀释涂布平板法、平板划线法是分离与纯化微生物的常规 方法。
平板划线法原理
1、选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度、 温度和氧等，造成只利于该微生物生长而抑制其他微生物生
图1 接种和分离工具 1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀
培养基的制备过程
以营养琼脂培养基为例 过滤 营养琼脂4克 蒸馏水100毫升 加热融化 调配 调pH
分装
高压灭菌
无菌检测
冰箱备用
实验内容
1、细菌纯种接种法:斜面接种
2、细菌的分离培养技术:平板划线分离法