2015年双特异性抗体回顾

现代药物探索杂志，2015年3月，00卷00号刊导语：双特异性抗体将两种抗体的功能结合在一个分子中。

目前市场上有两个双特异性抗体（一个近期被批准），还有更多正处于临床研发中。

在大型制药企业的推动下，双特异性抗体正成为新一代的生物制品。

双特异性抗体作者：Roland E.Kontermann和Ulrich Brinkmann免疫和细胞生物学学院，斯图加特大学，德国罗氏制药早期研发，大分子研究，罗氏创新中心，罗氏制药的研究和早期发展（PRED），大分子研究，罗氏彭茨贝格创新中心，彭茨贝格，德国双特异性抗体（bsAbs）结合了两种抗体的特异性，可同时定位不同的抗原或表位。

具有双目标靶向功能性的BsAbs可与多个表面受体或相关配体发生相互作用，例如与癌症、增殖或炎症进程。

BsAbs还可以拉近多个目标，在一个细胞中支持蛋白复合物的形成，或使多个细胞发生接触。

“强制连接”功能的例子有在凝血级联反应或靶向免疫细胞招募剂和/或激活剂中，bsAbs支持蛋白质络合。

经过多年的研究和研发（R＆D），2009年第一个bsAb 被批准。

第二个bsAb上市是在2014年12月，还有几个处在临床试验阶段。

在这里，我们描述bsAbs成为下一波抗体为基础的治疗方法的潜力，侧重于临床开发中的分子。

重组双特异性抗体重组类IgG双特异性抗体的概念原型二十多年前就被设计出来了。

Morrison和他的同事们利用灵活的连接肽段将具有不同结合特异性的单链可变区融合到IgG重链的C末端【1】。

这种分子因为具有双重功能而与正常抗体区分开来。

最初技术的瓶颈阻碍了其进一步发展，使双功能抗体始终主要是学术和生物技术领域研发的一个话题。

然而，技术的快速发展使重组蛋白衍生物工程设计、生产和发展成为可能，加上来自制药工业的新的兴趣，双特异性抗体研究领域正式启动。

现在，已经可以获得许多适合作为治疗用蛋白的不同的bsAb形式【2-17】。

初始阶段在学术领域中时常发生，多种蛋白构型都被证实足够有力支撑其临床应用。

这也随后引发了制药企业的浓厚兴趣，包括罗氏公司、辉瑞、基因泰克、赛诺菲安万特，艾伯维，中外制药，安进和其他公司，现在都在研发双特异性抗体药物。

起初，bsAb是将两个不同的、纯化的单克隆抗体（mAbs）通过化学交联生成，或者是将2 株表达不同单克隆抗体的杂交瘤融合，构建4 倍体杂交瘤。

但是，两株异源抗体的轻重链随机装配，理论上体系中会有10 多种不同组合的抗体存在，为抗体纯化和质控带来了巨大的挑战【18】。

在过去的二十多年里，基因工程技术导致了一系列双特异性重组抗体形式的产生，现在已经有50多种不同的形式【2】。

这使得治疗和诊断用的bsAb的发展发生了革命性变化，使研究人员可以根据目标产物特性要求来调整bsAbs的大小、化合价、灵活性、半衰期和体内分布。

一般来说，bsAb可以分成两大类，一类是含有Fc区，另一类是缺乏Fc区的，后者通常小于免疫球蛋白和含有Fc区的类IgG双特异性分子（图1）。

Fc区有利于采用已建立的针对IgG分子的流程来对bsAb进行纯化，并且能改善其溶解性和稳定性。

此外，Fc区还对Fc-介导的效应功能有影响，可能是一些治疗应用所需的附加效应，例如抗体依赖的细胞毒性（ADCC）、补体结合（CDC）和由于其具有更大的分子量和Fc新生儿受体（FcRn）介导的循环过程而导致的长半衰期【19】。

这些功能可以通过基因工程的手段进一步利用，例如，通过消除ADCC和/或CDC同时保存长半衰期。

相比之下，缺乏Fc区的bsAb完全依赖其抗原结合能力来发挥治疗效力。

图1 由两个不同抗原结合位点的抗体形成双特异性抗体的不同机制图解。

双特异性IgG分子可以由同一个细胞株表达的两条不同的轻链和重链组装而成。

然而，由于不同肽链之间的随机组合会产生大量的相对双特异性抗体来说非功能性的分子。

一个简单的解决办法是融合第二个结合部分，例如单链的Fv片段、单独的重链或轻链的N端或C 端结构域、整个抗体的N端或C端结构域，这样产生一个对每个抗原有两个结合位点的四价分子（如图1）。

含双可变区的免疫球蛋白(DVD-Ig)也属于对称的双特异性IgG和类IgG分子，第二个重链可变区与一个重链的可变区融合在一起，第二个轻链可变区与轻链融合（如图2）【20】。

通过选择VH和VL结构域结合两种不同抗原的能力可以实现双重识别（图2）。

这种二合一抗体是二价的，有别于正常的IgG分子。

二价双特异性抗体分子的产生的一个突破是knobs-into-holes技术的发展【12】。

（knobs-into-holes杂二聚技术，原理很简单，利用基因工程技术，在其中一条重链上做一个钮（knob），在另一条重链上做一个扣（hole），然后两个咬合在一起形成双抗。

）通过在两个CH3结构域引入不同的突变来促使重链发生异源二聚化，由此产生不对称抗体。

近年来在一般方法的基础上建立了很多新方法，例如利用选择性突变【21】、静电转向效应【22】、或IgG和IgA来源的混合CH3结构域【13】。

然而这些方法都有一个称为light-chain problem（轻链问题）的麻烦，就是不同的轻链与重链异源二聚体会发生随机配对。

这可以通过采用一个能够同时结合两个抗原的共同的轻链来解决。

然而，不是所有的抗体都适用。

在这种情况下，可以采用细菌表达和组装分别含有匹配的轻-重链、含有凸起或凹洞的半抗体【15】。

CrossMab技术提供了一个完美的解决方案【16】。

正确配对的轻链是通过交换一条重链的CH1结构域和对应轻链的CL（轻链恒定区）结构域来获得的（图2）。

最近，突变也被引入到Fab片段的表面的CH1-CL以及VH-VL区，由此产生轻重链的正确配对【23】。

值得注意的是，通过进一步融合一个抗原结合部分，非对称的重链同样可以作为产生二价双特异性，甚至三特异性抗体的基石【6】。

图2 临床研究阶段的不同形式的双特异性抗体缺乏Fc区的小分子bsAb要么由两个抗体的VH和VL区组成，要么由Fab片段组成。

两个scFv片段串联成的scFv分子是其中一种简单的形式，在双特异性T细胞衔接器（BiTE）技术中采用的就是这种形式。

在这种形式中，两个scFv片段以一种灵活的方式通过连接肽段连接在一起【24】。

另外一种方法是基于双体抗体的形式。

来自两个抗体A和B的可变区作为多肽链被表达出来，VHA-VLB和VHB-VLA，通过一个短肽连接在一起，促使两条链发生异源二聚化【25】。

二价双体抗体形式后来被进一步改进，转换成单链版本（scDb）【26】和四价的二聚体衍生物（tandAb）【27】，对每种抗原有两个结合位点，还有通过二硫键稳定的变体，例如双倍亲和力靶向分子（DART）【28】。

这些分子的体积小，再加上缺乏Fc区，导致其在体内会快速发生肾清除。

尽管体积小有利于组织渗透（如在肿瘤治疗中），但其血清半衰期短会影响剂量（如在频繁注射或输液中需要）。

延长半衰期的方法，包括聚乙二醇（PEG）融合、类PEG多肽融合或白蛋白结合部分的融合【29】。

BsAbs还可以通过将不同的抗原结合部分（如scFv或Fab）与其他蛋白结构域融合生成，可进一步包含新的功能。

例如，两个scFv片段与白蛋白融合，使抗体片段获得了更长的血清白蛋白循环时间【30、31】。

另外一个例子是基于cAMP依赖的蛋白激酶和一个激酶锚定蛋白的异源二聚化的“dock-and-lock”方法【32】。

这些结构可以与Fab片段或者整个抗体分子连接形成双特异性抗体【33】。

图1显示了生物技术学术界和制药行业等不同群体用于获得bsAb格式不同的策略示意图。

大多数的这些格式仍在临床前评价阶段和许多可能依然停留在这个阶段。

然而,一些格式已经开始临床开发，详见表1。

临床开发中的bsAb格式的如图2所示。

免疫细胞的招募和激活四价双特异性抗体用于T细胞招募：Trion制药抗上皮细胞粘附分子和抗CD3的双特异性抗体——卡妥索单抗（catumaxomab,Removab1）是第一个获得上市许可的双特异性抗体【34】。

Trion制药将卡妥索单抗作为一个三功能bsAb、一个肿瘤抗原和小鼠来源IgG2a和老鼠来源IgG2b的CD3结合混合物。

它可以靶向肿瘤，通过结合T细胞受体混合物的CD3亚基来招募T效应细胞，同时可以通过结合FCγ受体激活单核细胞、巨噬细胞、树突细胞和NK细胞【35】。

这使其可以在卵巢癌中可杀死从而减少肿瘤细胞（图3A），阻止和减少腹水积累。

作为第一代双特异性抗体，卡妥索单抗是一个由小鼠-老鼠杂交瘤表达的非人源的、小鼠-老鼠源杂合的抗体，每条臂结合不同的抗原。

正确配对的异源二聚化抗体是通过分离目标分子与非所期待的单特异性老鼠源或小鼠源抗体以及错误连接的L链污染物而获得的。

L链的错配也可以减少，因为老鼠L链更倾向于与老鼠H链配对，反之亦然；小鼠的H和L链也会优先配对。

卡妥索单抗是有效的，并且具有可接受的安全性，只需要很小的剂量（10-150 mg）在9-13天内腹腔输液四到五次。

除了被批准用于治疗恶性腹水，卡妥索单抗还被应用于卵巢癌的临床研究（二期）、胃癌（二期）以及上皮癌（一期和二期，见表1）。

鉴于卡妥索单抗是老鼠-小鼠源杂合的，在大多数患者身上会出现抗小鼠IgG或抗老鼠IgG的反应；然而，其疗效并未受显著影响。

通过杂交瘤技术有一系列的bsAb产生，包括同时抗CD3和CD20或HER2，以及其他的一些肿瘤抗原，像神经节苷脂GD2和GD3【34-42】。

所有这些bsAb都处于临床前评估，其中有两个进入了临床试验阶段：一个是ertumaxomab(Rexomun)，通过结合HER2靶向肿瘤细胞，通过其抗CD3臂招募T细胞，目前处于治疗转移性乳腺癌临床一期阶段【42】。

另一个是Lymphomun,通过靶向结合T细胞表面的CD20 抗原，通过其抗CD3臂招募T细胞，目前处于B细胞淋巴瘤患者的临床一到二期研究。

图3 不同bsAb的作用机制BiTEs招募T细胞：Amgen公司（从Micromet收购获得此技术）鉴于Trion制药研发的招募免疫细胞的类IgG双特异性抗体是含有Fc区的，相对有更长的血清半衰期，Amgen采用BiTEs技术开发了一种概念不同的招募效应细胞的抗体形式【43、44】。

这些小个体是仅由抗体的单链可变区scFvs通过连接肽段连接在一起的【44-46】。

它们作为重组蛋白由CHO细胞表达，只含有两个抗原结合位点。

其中一个靶向肿瘤相关的细胞表面抗原（比对CD3有更高的亲和力），另一个以更低的亲和力结合CD3【44】。

由于BiTEs 体积更小且缺乏Fc区，其血清半衰期更短。

尽管如此，它们在细胞培养中剂量低至10 g/ml 的情况下仍能发挥效力并诱导特异性的抗肿瘤细胞毒性（靶向裂解培养细胞）【47、48】。