紫杉醇提取及纯化

3．1 化学反应法 紫杉醇很难与衍生物 c e ph a l o m a n n i n e 分 离 ， 用化学反应 的方法将 c e p h a l o ma n n i n e 的性质改变而保持紫杉醇的性质不发生改变,使得二者容易 分离 。K i n g s t o n 等,尝试的用 0sO4 处理紫杉醇与 c e p h a l o ma n n i n e 的混合物，发现 0sO4 能选择性 的氧化 c e p h a l o ma ml i n e ，使之成为醇，而紫 杉醇却不受影 响，这种方法有较好的效果，可使紫杉醇的 纯度达到 9 5％ ， 但因毒性大而不能应用于实践 。Mu r r a y 改良法采用含 1 ％ ～1 0％ O3 氧化后，加入吉拉德氏 酰肼一 A C OH 混合物使 O Z O —c e p h a l o — ma n n i n e ( c e p h a l o ma n n i n e 被氧化的产物 )最后 通过选择性沉淀或用乙酸乙脂一水等萃取，就可以把紫杉醇 分离出来,可使紫杉醇的纯度达到 9 7．5 ％相比较 K in g s
1 ．3 起幡界萃取法 超临界流体技术( S P F )引入到紫杉醇的提取纯化技 术中可以减少含氯有机溶剂的使用，S P F 最常用的溶剂是 c o2，它本身无毒且易从提取物中分离，是一种环保 、安全 的新技术。早在 1 9 9 2 年 J e n n i n g s 等 就已经对 该技术作了研究，发现用 c o2 和加入乙醇改性剂的 c o 2 作 S P F 溶剂，在 3 1 8 K 温 度和 l 8．0 7～2 5．7 9 MP a 压力下进行紫杉醇的提取，紫杉醇提取率高达 0．0 8 ％。 N a i r 等用含 0．001％ ～15％丙酮或乙腈的超临界 co 2 ，也可以有效地提取东北红豆杉的紫杉醇。但由于 S P F
由于苯基反相介质在分离多环化合物方面有独特的作 用，因此可用紫杉醇分离 。苯基一硅胶介质以硅胶为基质 ， r 一氨丙基三氧基硅烷( A P T S ) 为连接臂，通过液相法( 分 别用三乙胺 、吡啶 、吗啡啉为催化剂 ) 和气相法合成 。 采用甲醇一水( 6 5 ： 3 5 ) 为流动相，用液相法合成的 苯基一硅胶介质其纯度和回收率分别为 ：三乙胺催化合成 的为 5 3 ．5 ％ 、5 9．3 ％ ，吡啶催化合成的为 6 o ．2 ％、 9 8．6 ％，吗啡啉催化合成的为 4 9 .8％、4 0．8 ％ ； 用气相法合成的苯基一 硅胶介质可使紫杉醇的纯度达 7 7．4％，回收率达 9 2％。
而且其回收率大于 1 4 0％。对氧化铝色谱中氧化铝的酸碱 性等条件的优化选择结果表明：用碱性氧化铝，流动相中含 水 0．03％,甲醇 1．5％,反应时间在 3 0 mi n 左右，洗脱 速度在 1 ～3 m1 ／mi n 之间时效果最好，可以使紫杉醇的 含量从小于 1 ％提高到大于 2 7 ％ ，紫杉醇的表观回收率 大于 170％。这说明有其它非游离的紫杉醇转化成了游离紫 杉醇，研究表明通过碱性氧化铝柱色谱后 ， 有 5 0％的 7 一 表一 紫杉醇可以转化成游离紫杉醇，使紫杉醇的回收率可 达 170％。
2．2 氧化铝色谱柱 在比较色谱介质性能研究中，通过比较固相萃取、硅 胶色谱、氧化铝色谱以及制备薄层色谱，可知用氧化铝柱色 谱能获得 40 以上的纯化倍数，极性比紫杉醇弱的物质基本 被除去，然后通过-步 c 18 固相萃取便可除去极性比紫杉 醇 稍强的杂质。用氧化铝柱色谱初分离工艺不但纯化倍数高 ，
3 ．2 制备型 HPLC 和 HS C C C 制备型 HP L C 在分离紫杉醇类化合物方面有着重要的 作用，有较深入的研究，制备纯化多用正相，在早期研究中 Wi t h e r u p 在比较 C 18 氰基柱和苯基柱分别对紫杉醇 紫杉烷化合物进行分离 ，结果发现氰基柱和苯基柱刈紫杉 醇和 c e p h a l o ma n n i n e 有较好的分离度 ， 但 却不能有效的对 7 一 表一 l 0-去乙酰基紫杉醇( 7 一 e p i 一 1 0 一 d e a c e t y l — t a x o 1 ) 进行分离
优wenku.baidu.com氧化铝
62.6
11
柱色谱
13.91
99.7
6
大孔吸附树
脂
大孔交换树
脂
制备型 TLC
精制
碳 18 制备 型 RP-HPLC
98
5
碳 18 硅胶
95.1
96
7
常压反相柱色谱
SW-Taxane
98
78
12
正相柱
Murry 改良
97.5
13
法
95
14
Kingston
氧化法
99.21
15
溴加成
80
16
硅胶吸附柱
t o n 方法而言，Mu r r a y 改 良法无疑是一大进 步。J e f f 等发现用臭氧和 Gi r a r d 试 剂氧化法分离紫杉醇和 e e p h a l o m a n n i n e 取得了良好的效果。
除了用氧化方法外，近来又发现用溴加成的方法来分 离紫杉醇和 c e p h alo m a n n l n e 的混合物，其具体 过程是将树皮用 l ％的柠檬酸渗漉，提取物的总萜经过两次 柱色谱，得到总萜含量为 4 0 ％ ～5 0 ％的粗品，然后进 行溴加成。对加成条件进行优化筛选，结 果发现选用 0．7 5 ml ( 溶 解 于 1.3 ml 的 c c L4) 的溴量／1 0 g 的加成 样( 溶解 于 2 5 nml 的 CH CI3 ) ，反应温度小于 2 0 ° C，时间不超 过 5 mi n ，可得到白色晶体的 p a c l i t a x e l 纯度可高达 9 9 ．2 l ％。其他方法相比较 ，溴 加成具有安全成本低 、操作简单易行等优点 。
1 ．4 固相萃取法 固相萃取( S P E ) 是近 2 0 年才发展起来的技术 ， 用 S P E 方法可以快速除去浸膏中的脂、蜡及色素等杂质 ， 获取初步纯化的紫杉醇。比较浸膏经 S e p - P a k C18 硅 胶和硅胶以及氧化铝固相萃取 ，结果发现浸膏经氧化铝 固 相萃取后 ，不仅供试品中大量的亲水性物质 、脂类物质被 去除，更重要的是 7 一表-紫杉醇峰也随之去除 ，这给紫杉 醇的常压色谱精制提供了可能 。
1.23
99.3
6
烷（1∶1）
碳 18 硅胶
8.3
99.1
6
固相萃取
硅胶固相萃
6.44
98.2
6
取
9.6
101
7
三氧化二铝
固相萃取
色谱
中压硅胶柱 色谱
40.6 14.63
98.9
5 6
法
常压硅胶柱
77.4
92.0
8
色谱
苯基硅胶介
26.3
140.5
6
质色谱
﹥27
﹥170
9
氧化铝柱色
谱
2.15
99.6
10
2 柱色谱技术的优化与应用
2．1 硅胶柱色谱 硅胶柱色谱在色谱中应用很广泛 。一般情况下，紫杉 醇在硅胶柱上的保留较强，用 CHCI3 淋洗时紫杉醇不会被洗 脱．用 CHCI3 和甲醇的混合溶液洗脱可分离出两个峰。如果
在色谱流动相中添加 0．0 5％水时，分离出的紫杉醇纯度有 所提高 ，分离速度加快，经常压硅胶柱色谱可获纯度 >1 4 ％ ，回收率 >9 8 ％的紫杉醇。在中压快速硅胶柱色谱 的条件下，用 cH 2cl2 、甲醇梯度洗脱，可使紫杉醇的纯 度达到 4 0 ％ ～6o％ 。
色谱
l 萃取工艺的优化
1 ．1 溶剂萃取法 溶剂萃取法常用于紫杉醇的粗提阶段，在此阶段主要 考虑溶剂的选择。通常紫杉醇先用甲醇 、乙醇或甲醇一三 氯甲烷 ( 1 ： 1 ) 浸取，除去溶剂所得的浸膏用 CH2Cl2 一 H2O 或 C H3Cl-H20 萃取 ，这种方法提取获得的浸膏杂 质含量多 。日本学者对紫杉醇提取的溶剂种类进行了研究， 结果表明在乙酸乙脂 、甲醇 、乙酸乙酯一甲醇 、乙酸乙 脂一二氯甲烷 、乙酸乙脂丙酮等溶剂中发现以乙酸乙脂一 丙酮( 1 ： 1 ) 混合溶剂提取效果最好，一次便可以使紫 杉醇的提取量高于以往常用溶剂所能得到的量。
关键词 紫杉醇 ；提取 ；纯化 ；综述
紫杉醇 ( t a x o 1 ) 是 1 9 7 1 年自太平洋红豆杉 (T a x u s b r e v i f o 一 lia ) 树皮中分离出的一种 二萜类化合物 。1 9 9 2 年被 F D A 批准用于治疗晚期乳 腺癌的特效药上市。紫杉醇在植物体中含量很低 ，并与多 种类似物共存 ，目前从红豆杉中分离紫杉醇及半合成前体 的过程一般是用甲醇或乙醇浸出( 或超临界提取) ，然后经 己烷脱脂 ，二氯甲烷或氯仿萃取得粗提物 ，经多次硅胶柱 色谱后再用制备型高效液相色谱 ( H P L C) 、 高速逆流 色谱 ( H C S S S ) 纯化后重结晶得到产品 ，目前不同工 艺中各个步骤的纯度 、回收率见表 l 。由于紫杉醇的资源 短缺 ，加之分离时存在得率低 ．成本高 ，生产周期长等 问题 ，导致紫杉醇价格昂贵。为解决这些问题 ． 国内外 学者围绕增加得率 ， 提高纯度 ， 简化步骤等对紫杉醇的
2．3 大孔吸附树脂 紫杉醇具有多环结构，容易被带苯环的吸附剂特异性 吸附。在静态吸附的条件下，通过对树脂类型、树脂吸附的 最佳 p H 值进行选择，发现用 20 1×4 型树脂，p H 为 6．4 时效果最好。在动态吸附的条件下对洗脱条件进行比较 ， 结果表明用 50％甲醇水溶液为初始溶剂 ( 调 p H 为 6 ．4 ) 溶解供试品及淋洗，紫杉醇被完全吸附于 2 0 1×4 型树脂 上，以 8 0％的甲醇溶液洗脱，经一步树脂吸附色谱 ， 除 去了紫杉醇浸膏中的脂 、蜡等杂质，供试品颜色由棕黑色 转成浅黄色，紫杉醇含量从 0 、6 5％提高到 2．1 5％ ， 紫杉醇的回收率为 9 9.6％。在对东北红豆杉的研究中， 用 乙醇提取液在高分子树脂( MN) 上用乙醇和水进行梯度洗
用于粗提阶段成本过高，至今还难以进行大规模实践。而超 临界流体重结晶( S P R) 有较大分离制备量及简单高效的 过程。把 S P F 和 S P R 技术相结合，采用 S P R 等压温差．吸 附法过程，其富集浓度可达到 l 0 倍所以采用 S P R：许并 配合分步吸附法给难分离的紫杉醇纯化带来了曙光，只要对 吸附剂及现有装置进行适当改进，就可以高效快速地替代现 有冗长而低效的硅胶柱色谱分离过程。
1 ．2 多元萃取法 陈海涛等针对紫杉醇和有机溶剂的特性 ，提出了红豆 杉细胞两液相培养的有机溶剂（油酸或油酸与邻苯二甲醇二 甲酯的混合溶液 )中离紫杉醇的多元萃取方法 ， 即是将甲
醇加入含有紫杉醇的有机溶剂中，甲醇和有机溶剂互溶而成 一相，然后加入水，因水与有机溶剂不相溶而成两相（ 水 相：紫杉醇一水-甲醇 ；有机相：紫杉醇一有机溶剂-甲醇) ， 使得水相对紫杉醇的溶解能力大幅度提高，从而将有机相中 的紫杉醇萃取到水相中，使紫杉醇得以分 离。通过测定知 道紫杉醇在培养液( 无甲醇存在的水相 ) 和油酸( 有机相) 体系中的分配系数为 0．OO649，有甲醇存在( 水相中甲醇的 摩尔分数为 0.453 )时 ，紫杉醇在水相和油酸体系中的分配 系数可达 0．2～0．55 ， 所以采用多元萃取法可大大提高 紫杉醇的分离效果 ，在甲醇存在下其分配系数可以提高两 个数量级 。
脱，可实现紫杉烷与大部分非紫杉烷的分离，分离出紫杉烷 类化合物后，再用 Z o r b a x — S W 柱进行分离 ，用 乙醇一 水( 4 5 ： 5 5 ) 可把紫杉醇与另外两种紫杉烷基 本达到分离，得到高纯度的紫杉醇。
3 紫杉醇与衍生物 c e p h a l o ma n n i n e 的分离
提取和纯化技术开展了一系列研究。本文对此做一综述。
表1 收率
提取
紫杉醇提取纯化工艺中各个步骤所得纯度和回
方法
纯度
∕﹪
甲醇 乙酸乙酯丙酮（1∶1） 固相提取法
0.0058 0.0065
回收
参考
率∕﹪ 文献
3 3 4 115.8±5.3
萃取
二氯甲烷 乙烷脱脂
0.27﹣0.31 1.0-1.28
5 5
一水二氯甲
兰州交通大学 化学与生物工程学院 综合能力训练Ⅰ——文献综述
题目：紫杉醇提取与纯化研究进展
作者：李建军 学号：200907258 指导教师：谢放 完成日期：2010-7-21
紫杉醇提取与纯化研究进展
李建军 兰州交通大学化学与生物工程学院，甘肃兰州 730070
摘要 综述近年来紫杉醇提取纯化技术中的提取 、萃 取 、柱色谱和高效液相色谱几个步骤的研究进展 ,评价其 在 生产中的实用性 。