Fmoc法肽合成中正交保护赖氨酸的研究进展

Ｆｍｏｃ法肽合成中正交保护赖氨酸的研究进展摘要：综述了各种用于Ｆｍｏｃ法肽合成赖氨酸的正交保护方法，这些保护方法对多肽的化学修饰起着十分重要的作用。

介绍了各种正交保护赖氨酸的合成、脱除方法及在肽合成中的应用实例，分析了各种保护基的特点、相互间的互补性及不足之处。

关键词：正交保护；肽合成；赖氨酸１９６３年，Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ创立了固相多肽合成法〔１〕，从此以各种保护氨基酸为原料的固相合成研究及其应用引起了人们的广泛关注。

今天，固相合成法得到了很大发展。

正交保护是指在一定条件下，分子中的一组保护基可被选择性地脱除，而其他保护基不受影响〔２〕。

一般情况下，正交保护是指基于机理之间的区别，例如半永久性和临时性保护基之间的区别，而且正交保护策略一般能提供较温和的反应条件。

Ｌｙｓ中的ε氨基碱性很强，同时具有亲核作用。

Ｆｍｏｃ策略中，Ｂｏｃ基团是比较好的保护基团，对碱的稳定性好，可以有效抑制副反应的发生。

赖氨酸是双氨基的氨基酸，同时Ｌｙｓ一般也是进行化学修饰的位点，这时需要特殊的保护基团，一般使用Ａｌｌｏｃ〔３〕、Ｄｄｅ〔４〕、ｉｖＤｄｅ〔５〕等进行正交保护。

１Ｄｄｅ保护的赖氨酸Ｄｄｅ保护基团在肽合成中主要用于保护伯胺，它是由２乙酰基５，５二甲基１，３环己二酮在ＤＭＦ溶液中形成的〔６〕。

由于它易于被２％肼／ＤＭＦ溶液脱除和在ＴＦＡ和哌啶溶液中相对稳定，所以Ｄｄｅ保护的赖氨酸在Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ肽合成策略中用于合成支链肽、环肽和侧链氨基修饰的肽。

１．１ＦｍｏｃＬｙｓ（Ｄｄｅ）ＯＨ的合成ＦｍｏｃＬｙｓ（Ｄｄｅ）ＯＨ的合成方法较多。

由于醛酮和伯胺反应生成含碳氮双键的亚胺（西佛碱），亚胺在稀酸中水解，又回到原来的羰基化合物及胺，可以用这一机理来保护赖氨酸中的ε氨基。

ＰｒａｓａｄＳ．Ｒａｊｅ等〔７〕报道用茴香醛在碱性条件下和赖氨酸形成西佛碱临时性地保护ε氨基，然后选择Ｆｍｏｃ保护α氨基。

稀酸水解西佛碱去除ε氨基保护，最后选择保护基保护ε氨基。

可以利用这一原理合成ＦｍｏｃＬｙｓ（Ｄｄｅ）ＯＨ（图１）〔８〕。

图１ＦｍｏｃＬｙｓ（Ｄｄｅ）ＯＨ的合成１．２Ｄｄｅ保护基团的脱除Ｄｄｅ保护基团可以用２％的水合肼在ＤＭＦ溶液或乙醇胺溶液中去除（图２）。

用水合肼脱除Ｄｄｅ时，若肽链中同时含有Ａｌｌｏｃ保护基团，Ａｌｌｏｃ上的双键会被肼还原。

加入一定量的烯丙基醇作为清除剂能阻止双键的还原〔９〕。

图２用２％的水合肼／ＤＭＦ溶液脱除Ｄｄｅ保护基团由于在利用水合肼脱除Ｄｄｅ保护基团时，会有部分的Ｆｍｏｃ基团脱落，Ｊ．Ｊ．ＤｉａｚＭｏｃｈｏｎ等〔１０〕利用盐酸羟胺（咪唑，ＮＭＰ，ＤＣＭ）在Ｆｍｏｃ保护基团存在的情况下定量脱除Ｄｄｅ保护基团（图３）。

这种新的脱除方法在脱除Ｄｄｅ时不会对Ｆｍｏｃ保护基团有任何影响。

图３盐酸羟胺（咪唑，ＮＭＰ，ＤＣＭ）溶液脱除Ｄｄｅ保护基团１．３Ｄｄｅ保护基团的不足之处Ｄｄｅ保护基团的不足之处主要有２点：首先，当用２０％的哌啶／ＤＭＦ脱除Ｆｍｏｃ时，在每次脱除过程中会有少量的Ｄｄｅ保护基团脱落，所以在合成长链肽时会严重影响肽的纯度，为了避免上述副反应产生可以使用ＤＢＵ／ＤＭＦ（２∶９８）作为Ｆｍｏｃ的脱除试剂；其次，有报道指出Ｄｄｅ保护基团会发生分子内的从侧链或α氨基到赖氨酸上ε氨基的Ｎ→Ｎ’位移〔１１〕。

１．４Ｄｄｅ保护的赖氨酸在肽合成中的应用Ｇ．Ｂ．Ｂｌｏｏｍｂｅｒｇ等〔１２〕用ＦｍｏｃＬｙｓ（Ｄｄｅ）ＯＨ和正交保护的Ｇｌｕ成功地合成支链环肽。

具体方法为先合成ＡｃＣｙｓ（ｔｒｔ）Ｇｌｕ（ＯＡｌｌ）ＡｌａＬｙｓ（Ｄｄｅ）Ｒｅｓｉｎ后用１．５％的水合肼／ＤＭＦ脱除Ｄｄｅ保护基团，然后赖氨酸上的ε氨基与ＦｍｏｃＧＧＥＫＴＲＮＱＭＧＣＯＯＨ偶联，最后脱除Ｆｍｏｃ保护基后的α氨基，用Ｐｄ（ＰＰｈ３）４脱除Ｇｌｕ上的Ａｌｌｙｌ保护基后的γ羧基偶联，这样便得到环肽。

２ｉｖＤｄｅ保护的赖氨酸由于ｉｖＤｄｅ是通过改进Ｄｄｅ保护基团而得到４２重庆理工大学学报的，它的化学性质和Ｄｄｅ比较相似。

由于ｉｖＤｄｅ的空间位阻效应较大，使侧链ｉｖＤｄｅ保护基团在哌啶／ＤＭＦ溶液中的稳定性比Ｄｄｅ好，同时降低了其侧链位移倾向〔１３〕。

２．１ＦｍｏｃＬｙｓ（ｉｖＤｄｅ）ＯＨ的合成的用ｉｖＤｄｅ保护的赖氨酸和Ｄｄｅ保护的赖氨酸的合成方法类似。

ＳｉｒｉＲａｍＣｈｈａｂｒａ〔１４〕、李文曲〔１５〕等报道用适当量的ＤＣＣＤＭＡＰ活化的羧酸酰化双甲酮与ＦｍｏｃＬｙｓＯＨ在乙醇溶液中回流即得到Ｄｄｅ类保护的赖氨酸衍生物（图４）。

图４ＦｍｏｃＬｙｓ（ｉｖＤｄｅ）ＯＨ的合成２．２ｉｖＤｄｅ保护基团的脱除由于ｉｖＤｄｅ和Ｄｄｅ的化学性质比较相近，所以它和Ｄｄｅ的脱除条件也是一致的。

脱除方法均为２％的肼／ＤＭＦ溶液。

２．３ｉｖＤｄｅ保护基团的不足之处当脱除ｉｖＤｄｅ保护基团时，若同时含有烯丙基类保护基，应在脱保护溶液中加入一定的烯丙醇用来阻止烯丙基上双键被还原。

２．４ｉｖＤｄｅ保护的赖氨酸在肽合成中的应用Ｂｏｌｓｃｈｅ等〔１６〕报道用ＦｍｏｃＬｙｓ（ｉｖＤｄｅ）ＯＨ将牛乳铁蛋白肽ＬＦａｍｐｉｎ２６５２８４（ＮＤＬＩＷＫＬＬＳＫＡＱＥＫＦＧＫＮＫＳＲＣ）和ＬＦｃｉｎ１７３０（ＮＦＫＣＲＲＷＱＷＲＭＫＫＬＧＣ）连接在一起，最后得到嵌合肽（ＮＦＫＣＲＲＷＱＷＲＭＫＫＬＧＫＲＳＫＮＫＧＦＫＥＱＡＫＳＬＬＫＷＩＬＤＮ）。

先将ＦｍｏｃＬｙｓ（ｉｖＤｄｅ）ＯＨ和ＮｏｖａＳｙｎＴＧＲ树脂偶联在一起，脱除Ｆｍｏｃ后，接着合成ＬＦｃｉｎ１７３０，用Ｂｏｃ保护ＬＦｃｉｎ１７３０末端Ｐｈｅ上的α氨基。

然后用水合肼脱除赖氨酸上的ＩｖＤｄｅ基团后偶联ＬＦａｍｐｉｎ２６５２８４。

这样赖氨酸上的α氨基和ε氨基分别连接了一段多肽。

这个嵌合肽具有有较强的抗菌活性，对离子强度较不敏感。

合成及研究ＨＩＶｇｐ４１三聚体对研究开发新型抗ＨＩＶ融合酶抑制剂及ＨＩＶ疫苗具有十分重要的意义。

Ｌｕ等〔１７〕试图用全保护的５１肽ｇｐ４１单体直接与Ｐｉｎｗｈｅｅｌ三元酸缩合后支链脱保护，结果发现其偶联产率极低，支链脱保护产率小于１％。

为此，作者采用ＩｖＤｄｅ保护３７及５１位赖氨酸，单体支链脱保护纯化后与Ｐｉｎｗｈｅｅｌ三元酸氟化物偶联，然后脱除ＩｖＤｄｅ，成功地合成了ＨＩＶｇｐ４１三聚体，产率可达２２％。

３Ａｌｌｏｃ保护的赖氨酸１９５０年，Ａｌｌｏｃ（烯丙氧羰基）保护基被Ｓｔｅｖｅｎｓ和Ｗａｔａｎａｂｅ〔１８〕首次用于保护胺和醇。

Ａｌｌｏｃ保护基的脱除可通过使用铂和钯催化剂催化氢解、液氨金属钠，或使用碘化頮的冰醋酸溶液来完成。

但用这些方法脱除Ａｌｌｏｃ都过于复杂，这就限制了它在有机合成中的应用。

随着Ｔｓｕｊｉ和Ｔｒｏｓｔ开发的钯催化的烯丙基脱除反应的出现，烯丙基保护基的潜力才被人们所认识。

由于它良好的正交性和脱除条件较温和，现在Ａｌｌｏｃ是使用频率较高的正交保护基团之一。

３．１Ｆｍｏｃｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）ＯＨ的合成由于赖氨酸上的α位氨基和羧基与铜易形成络合物，许家喜等〔１９〕利用此反应先选择性地将ε位氨基与酰化试剂ＡｌｌｏｃＣｌ反应得到ε位氨基被Ａｌｌｏｃ保护的铜络合物。

因这种络合物在水中的溶解性比较好，在加热条件下直接通入Ｈ２Ｓ，可以得到解离完全的产物。

ε氨基保护的赖氨酸经碱（ＮａＯＨ或Ｎａ２ＣＯ３）将α位的氨基从其内盐解离出来后，与ＦｍｏｃＣｌ反应便可得到正交保护的ＦｍｏｃＬｙｓ（Ａｌｌｏｃ）ＯＨ（图５）。

图５ＦｍｏｃＬｙｓ（Ａｌｌｏｃ）ＯＨ的合成５２姜和，等：Ｆｍｏｃ法肽合成中正交保护赖氨酸的研究进展３．２Ａｌｌｏｃ保护基团的脱除Ａｌｌｏｃ保护基团的脱除为钯催化的烯丙基转移到各种各样的亲核试剂（烯丙基清除剂）的过程（图６）〔２０〕。

在此反应中通常选用Ｐｄ（ＰＰｈ３）４作为催化剂。

有的文献中选用ＰｄＣｌ２（ＰＰｈ３）２作为催化剂，因为它的性能优于Ｐｄ（ＰＰｈ３）４，其优越性主要有２点〔２７〕：①在空气中稳定；②与零价的Ｐｄ（ＰＰｈ３）４不同，二价的ＰｄＣｌ２（ＰＰｈ３）２在加入亲核试剂进行消除反应前，不会催化脱羧使烯丙基氨基甲酸酯重排为烯丙胺。

Ａｌｌｏｃ基团的脱除关键就在于选择合适的亲核试剂。

亲核试剂又分为可逆型烯丙基清除剂（如吗啉）和不可逆型烯丙基清除剂（如双甲酮和ＮＤＭＢＡ）。

它们的主要区别是可逆型烯丙基清除剂一旦烯丙基化可回复到π烯丙基复合物。

如果烯丙基清除剂选择不当的话便会形成烯丙胺副产物，而且可能以不同的方式形成。

主要有几点：１）自由氨基与亲核试剂（烯丙基清除剂）竞争捕获π烯丙基钯络合物，因此，最好使用这样的脱保护系统，能形成质子胺或伪装成非亲核形式的胺或使用过量烯丙基清除剂（图６）。

２）烯丙基基团与清除剂形成的也可通过一个平衡过程形成烯丙胺（图７）。

图６钯催化的烯丙基羧酸酯的脱除图７使用质子可逆的烯丙基清楚剂时烯丙胺的形成机理最后，Ａｌｌｏｃ保护的胺衍生物在Ｐｄ催化剂和未加任何亲核试剂的条件下经过脱羧重排形成烯丙胺。

一般情况下仲胺的重排要比伯胺快〔２１〕。

ＰａｌｏｍａＧｏｍｅｚＭａｒｔｉｎｅｚ等以Ｎ甲基苄胺为例使用各种不同烯丙基清除剂来脱除Ａｌｌｏｃ，表１给出了其结果。

该研究的目的在于为多肽合成选择确定最佳的清除剂〔２２〕。

这些研究结果表明２种胺硼烷，ＮＨ３·ＢＨ３和Ｍｅ２ＮＨ·ＢＨ３被推荐为优良的烯丙基清除剂，因为它们有快速的反应动力学。

表１Ｐｄ（ＰＰｈ３）４作为催化剂时各种烯丙基清除剂的相对效率ＡｌｌｙｌＧｒｏｕｐＳｃａｖｅｎｇｅｒ％ＹｉｅｌｄＨＮ（Ｍｅ）ＣＨ２ＰｈＡｌｌＮ（Ｍｅ）ＣＨ２ＰｈＮＤＭＢＡ１０００Ｔｈｉｏｓａｌｉｃｙｌｉｃａｃｉｄ１０００ＰｈＳｉＨ３９５５Ｂｕ４ＮＢＨ４６０４０ＮＨ３·ＢＨ３９９．６～１０００～０．４Ｍｅ２ＮＨ·ＢＨ３１０００ｔＢｕＮＨ２·ＢＨ３９６～９７３～４Ｍｅ３Ｎ·ＢＨ３０１００Ｐｙ·ＢＨ３０１００３．３Ａｌｌｏｃ保护基团的不足之处Ａｌｌｏｃ保护基的不足之处主要体现在脱除过程中易生成烯丙胺副产物。

不过只要选择适当的亲核试剂（烯丙基清除剂），这个问题应该能够克服。

３．４Ａｌｌｏｃ保护的赖氨酸在肽合成中的应用Ｆｍｏｃｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）ＯＨ在肽合成中大都用于合成长效多肽，且大部分都是在ε氨基上用ＭＩＰＡ（３马来酰亚胺基丙酸）修饰与白蛋白结合而长效的。

Ｂａｋｉｓ等〔２３〕利用Ａｌｌｏｃ保护的赖氨酸合成了经ＭＩＰＡ修饰的长效利钠肽（利尿降压药）衍生物。

Ｂｒｉｄｏｎ等〔２４〕合成了长效ＧＬＰ１肽。

谢东等〔２５〕利用Ｆｍｏｃｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）ＯＨ经ＭＩＰＡ修饰合成了ＨＩＶ融合抑制长效多肽ＦＢ００６Ｍ。

６２重庆理工大学学报４讨论与展望多肽类药物相对于小分子药物来说稳定性较差，在体内易降解，半衰期短，这些特殊性使得该类药物的主要临床应用剂型为注射剂。