拟南芥雄性不育突变体msll42 的遗传定位与功能分析

１．２．４ ＰＣＲ反应 ＰＣＲ反应参照易君等（２００６）１拘方法。引物由英潍捷基 （上海）贸易有限公司合成。用２．５％的琼脂糖凝胶电泳 验证２个亲本Ｌｅｒ和Ｃｏｌ之间的多态性。
１．２．５花药发育的光学显微镜观察 将野生型与突变体植株的花序在ＦＡＡ固定液中固定 １２—２４小时后，用５０％乙醇漂洗２－３次，常规脱水。 ｓｐｕｒｒ树月匕包埋、切片，切片厚度为１ ｕｍ。１％甲苯胺 蓝染色后在显微镜下观察并拍照（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａ１．，２００７； 方子君等。２００８）。
本文通过ＥＭＳ（ｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）诱变处 理野生型拟南芥群体，分离得到一株雄性不育突变体 ｍｓｌｌ４２。细胞学观察表明，突变体花药中小孢子发 育出现异常，导致最后没有花粉形成，果荚中不结种
收稿日期：２００９．０９－０９；接受Ｅｌ期：２００９—１２－０１ 基金项目：国家自然科学基金（Ｎｏ．３０９７１５５３，Ｎｏ．３０６７１１２７）、上海市教委科研创新项目（Ｎｏ．０９ＹＺｌ６８）和上海师范大学科研项目（Ｎｏ．ｓｋ－ ２００８２７） 。通讯作者。Ｅ—ｍａｉｌ：ｓｅｎｚｈａｎｇ＠ｓｈｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
植株花药中则没有花粉粒（图１Ｃ）。与野生型相比， ｍｓｌｌ４２突变体成熟花药中没有花粉粒。当花药完全 开裂的时候，没有花粉粒的释放。这很可能是造成 ｍｓｌ １４２完全雄性不育的原因。
２．２突Hale Waihona Puke Baidu体花药发育的细胞学观察
为了进一步分析ＭＳｌ １４２基因对花药发育的影响，我 们利用细胞学手段对野生型和突变体植株的花药发 育过程进行了横切片的观察比较。结果表明，直到花 药发育的四分体时期，ｍｓｌｌ４２突变体花药与野生型 相比几乎没有差异（图２Ａ，Ｂ）。但在单核小孢子时期， 与野生型相比突变体小孢子已经开始空泡化（图２Ｃ， Ｄ）。在双细胞花粉时期，野生型小孢子外壁明显町见， 而突变体小孢子外壁不明显且窄泡化加剧，部分小孢 子已经破裂，同时观察到花粉囊中出现一些碎片（图 ２Ｅ，Ｆ）。在三细胞花粉时期，野生型花药中有成熟的 花粉，而突变体花药中贝０看不到花粉，仅仅在靠近药 室壁的地方残留小部分碎片（巨１２Ｇ，Ｈ）。
表１突变体ｍｓｌｌ４２定位中所用的分子标记引物序列 Ｔａｂｌｅ １ Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｍｓｌ １４２
万方数据
４０６植物学报４５（４）２０１０
片，６＿８小时后在显微镜下观察并拍照。
２结果与讨论
２．１ 突变体ｍｓｌｌ４２的分离
经ＥＭＳ诱变野生型拟南芥（Ｌｅｔ）群体。通过背景纯化 得至ｌＪｍｓｌ １４２突变体。尽管该突变体植株完令雄性不 育。但它在生长过程中表现出正常的营养生长和花器 官的发育（图１Ａ），而且正反杂交实验证明，其雌蕊是 完全叮育的，说明雌配子体的发育是正常的（数据未 显示）。但是，与野生型植株相比，突变体的果荚短 小、萎缩，且成熟后不含种子（图１Ａ）。对ｍｓｌ １４２突变 体和野生型花的解剖观察发现，在拟南芥刚开放的花 中，野生型花药完全开裂并释放大量的花粉，且雌蕊 柱头上面也粘有大量的花粉，而突变体花药表面则没 有仡粉，雌蕊柱头表面透明，没有花粉的黏附（图 １Ｂ）。为了分析突变体植株因何种发育缺陷而导致雄 性不育，我们用亚历山大染色的方法比较了野生型和 突变体植株的花粉和花药，结果表明野生型植株的花 药中含有被染成红色的成熟可育的花粉粒．而突变体
上海师范大学生命与环境科学学院，上海２００２３４ 摘要经ＥＭＳ诱变野生型拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）群体筛选得到一株雄性不育突变体ｍｓｌ １４２，突变体的果荚短小。不 含种子。细胞学观察和扫描电镜结果表明．突变体花药发育过程中。花药中小孢子外壁异常、破裂，最后没有花粉形成。遗 传分析表明，该突变体为隐性单核基因突变所致：利用图位克隆的方法将ＭＳ７１４２基因定位于第１条染色体的ＢＡＣ克隆 Ｆ１６Ｐ１７上４４ ｋｂ区间内。目前尚未见该区间内有雄性不育基因的报道。以上结果结合生物信息学分析表明，＾侣７１４２是一个 新的调控花药发育的关键基因。该工作为花药发育关键基因＾佑＂４２的克隆及功能分析奠定了基础。
成三细胞的成熟花粉粒，同时积累物质：绒毡层细胞 发生程序性死亡，并逐渐降解。在此期间，绒毡层提 供了小孢子发育所必需的营养物质。并分泌孢粉素形 成花粉外壁。随着绒毡层的逐渐衰亡，它的分解产物 填入花粉壁，形成一层由脂类、蛋白质和色素等成分 组成的花粉包被（Ｃｈａｎｄｈｕｒｙ，１９９３）。我们的细胞学 观察结果显示，突变体的小孢子从四分体中释放后， 小孢子的发育出现异常且空泡化。小孢子内细胞质逐 渐凝聚，并且小孢子破裂。这很可能是由于突变体小 孢子中没有积累足够的细胞质，或者小孢子内细胞质 已经渗漏到药室内。说明小孢子自身的完整性出现问 题。小孢子的不完整性还很可能随着其外壁形成异常 而加剧，因为随着小孢子的发育，其内容物逐渐减 少，空泡化加剧，而且花粉囊中出现碎片（图２Ｇ，Ｈ）。
１．２方法 １．２．１ 突变体的遗传分析 以野生型Ｌｅ，植株作为父本、突变体作为母本进行杂 交得到Ｆ１代，收获Ｆ１代种子。Ｆ１种下后自交，获得Ｆ２ 代种子，种植下去，观察Ｆ２代的表型，并统计Ｆ２代中 可育植株与不育植株的比例。
１．２．２基因的定位
以野生型Ｃｏｌ植株作为父本、突变体Ｌｅ啦株作为母本
进行杂交得到Ｆ１代，Ｆ１代自交后得到Ｆ２代，收集Ｆ２代 中的不育植株用于基因定位。基因定位的方法及所用 分子标记参照易君等（２００６）。一旦找到了连锁的分子 标记，就在该分子标记附近设计新的分子标记（表１），
Ｆｉｇｕｒｅ ２ Ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ｌ八Ｃ，Ｅ，Ｇ）ａｎｄ ｍｓｌ １４２（Ｂ，Ｄ，Ｆ，Ｈ）ａｎｔｈｅｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ （Ａ），（Ｂ）Ａｎｔｈｅｒｓ ａｔ ｔｅｔｒａｄ ｓｔａｇｅ；ＩＣ），ＩＤ）Ａｎｔｈｅｒｓ ａｔ ｕｎｉｎｕｃｌｅａｔｅ ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｅ ｓｔａｇｅ（ａｒｒｏｗｈｅａｄ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｖａｃｕｏｌａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｅ）； （Ｅ），ＩＦ）Ａｎｔｈｅｒｓ ａｔ ｂｉｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｏｌｌｅｎ ｓｔａｇｅ（ａｒｒｏｗｈｅａｄ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｄｅｂｒｉｓ）；（Ｇ），ＩＨ）Ａｎｔｈｅｒｓ ａｔ ｔｒｉｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｏｌｌｅｎ ｓｔａｇｅ．Ｂａｒ＝１ ５ ｐｍ
花粉壁的发育，特别是外壁的形成，依赖于小孢 子和绒毡层细胞两者之间的协调发育（Ｐａｘｓｏｎ－ Ｓｏｗｄｅｒｓ ｅｔ ａ１．，１９９７；Ｐｉｆｆａｎｅｌｌｉ ｅｔ ａ１．，１９９８）。在四分 体时期小孢子壁已开始发育，当小孢子从四分体胼胝 质壁中释放后。由绒毡层产生的孢粉素沉积在花粉 上。形成花粉外壁。在拟南芥中，已报道许多基因的 突变影响花粉外壁的形成。如ＭＳ２基因（Ａａｒｔｓ ｅｔ ａ１．， １９９３，１９９７）、转录因子ＡｔＭＹＢｌ０３（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａ１．， ２００７）、ＤＥＸｌ基因（Ｐａｘｓｏｎ—Ｓｏｗｄｅｒｓ ｅｔ ａ１．，２００１）、 ＦＬ尸基因（Ａｒｉｉｚｕｍｉ ｅｔ ａ１．，２００３）、ＮＥＦｌ基因（Ａｒｉｉｚｕｍｉ ｅｔ ａ１．。２００４）、ＲＰＧｌ基因（Ｇｕａｎ ｅｔ ａ１．，２００８）、胼胝 质合成酶一５（ｃａｌｌｏｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ５，ＣａｌＳ５）基因（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａ１．。２００５）和转录因子ＭＳｌ（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａ１．，２００１；１１０ ａｎｄ Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ。２００２；Ｙａｎｇ ｅｔ ａ１．。２００７）等。尽管对 这些基因克隆和突变体的研究使我们对小孢子外壁 的形成有所了解。但这些基因在小孢子外壁发育过程 中的作用机理还不清楚，而且还有许多新的基因没有 被克隆。
在被子植物中，成熟的花粉粒有２层壁：花粉外 壁（ｅｘｉｎｅ）和花粉内壁（ｉｎｔｉｎｅ）（Ｈｅｓｌｏｐ－Ｈａｒｒｉｓｏｎ，１ ９７１： Ｐｉｆｆａｎｅｌｌｉ ｅｔ ａ１．。１９９８）。外壁的主要成分来源于绒毡 层的孢粉素，构成花粉外壁的复杂纹饰结构。内壁是 花粉壁的最内层。位于小孢子质膜和外壁之间 （Ｈｅｓｌｏｐ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ。１９７１ ｏ花粉内壁主要由花粉粒本 身合成。通常在花粉外壁表面的腔或间隙中充满花粉 覆盖物。这些花粉覆盖物也称花粉鞘（ｐｏｌｌｅｎｋｉｔｔ）或含 油层（ｔｒｙｐｈｉｎｅ）。是绒毡层细胞分泌的物质。
植物学报Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｏｆＢｏｔａｎｙ ２０１０．４５（４）：４０４＿４１０，ｗｗｗ．ｃｈｉｎｂｕｌｌｂｏｔａｎｙ．ｃｏｍ
ｄｏｉ：１０．３９６９ｒｊ．ｉｓｓｎ．１６７４－３４６６．２０１０．０４．００２
·研究报告·
拟南芥雄性不育突变体ｍｓｌｌ４２的遗传定位与功能分析
常玉花，周鹊，杨仲南，张森。
万方数据
常玉花等：拟南芥雄性不育突变体ｍｓｌｌ４２的遗传定位与功能分析４０５
子。扫描电镜观察发现小孢子外壁异常、破裂。遗传 分析表明，该突变体的性状是由单个隐性核基因控制 的。利用图位克隆的方法对突变基因进行定位，结果 表明ＭＳ７１４２基因位于第１条染色体的ＢＡＣ克隆 Ｆ１６Ｐ１７上４４ ｋｂ区间内。这些结果为进一步克隆 ＭＳ７１４２基因及研究其功能奠定了基础。
用高通量ＤＮＡ提取方法（Ｘｉｎ ｅｔ ａ１．，２００３）提取大批Ｆ２ 代遗传群体中的突变体单株ＤＮＡ。对这些植株进行 基因型分析。进一步定位目的基因。
１．２．３ ＤＮＡ的提取 拟南芥基因组ＤＮＡ的提取参Ｊ琅Ｚｈａｎｇ等（２００３）。
１材料与方法
１．１植物材料 本研究所用的野生型拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ Ｌ．） 分别以Ｃｏｌｕｍｂｉａ（Ｃ０１）和Ｌａｎｓｂｅｒｇ ｅｒｅｃｔａ（Ｌｅｔ）为遗 传背景，突变体ｍｓｌｌ４２（Ｌｅｒ遗传背景）是由本实验室 经ＥＭＳ诱变得到的雄性不育株系。植物种植采用易君 等（２００６）的方法。突变体和野生型（Ｌｅｔ）回交３次。
关键词 花药发育，拟南芥，雄性不育突变体，图位克隆 常玉花，周鹊，杨仲南，张森（２０１ ０）．拟南芥雄性不育突变体ｍｓｌｌ４２的遗传定位与功能分析．植物学报４５，４０４－４１ ０．
花药及花粉的发育是植物功能基因研究的一个 重要方向，花药及花粉发育异常通常会导致雄性不 育。这种雄性不育现象大多与花药形态、体细胞与生 殖细胞的发育、小孢子发生、花粉发育、花药的开裂 以及花粉粒的功能等相关（Ｓａｎｄｅｍ ｅｔ ａ１．，１９９９）。在 拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ｄＰ。正常的花药发育过 程包括１４个时期。每个时期都有其特征性的细胞事 件发生，这１４个时期又被分为４个阶段：第１个阶段。 在花药原基中进行细胞分裂从而形成花药全部组织： 第２个阶段，小孢子母细胞经过减数分裂形成含有小 孢子的四分体：第３个阶段，小孢子从四分体中释放， 并且发育成含有三细胞的花粉粒：第４个阶段，成熟 花粉释放（Ｓａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａ１．。１９９９）。
在拟南芥花药发育的第３个阶段，主要的生命活 动包括：单倍体的小孢子形成外壁并通过有丝分裂形
图１ 拟南芥野生翟Ｊ（Ｖ盯）与ｍｓｌｌ４２突变体植株的表型分析 （Ａ）野生型和ｍｓ＂４２的植株：（Ｂ）野生型和ｍｓｌｆ４２的花：（Ｃ）野生型和ｍｓｌｌ４２花药的亚历山人染色 Ｆｉｇｕｒｅ １ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ（ＷＴ）ａｎｄ ｍｓｌ １４２ ｐｌａｎｔ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ （Ａ）Ｔｈｅ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ａｎｄ ｍｓｌ １４２ ｐｌａｎｔ；（Ｂ）Ｆｌｏｗｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ａｎｄ ｍｓｌ １４２；（Ｃ）Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ａｎｄ
ｍｓｌ １４２ ａｎｔｈｅｒｓ
万方数据
常玉花等：拟南芥雄性不育突变体ｍｓｌｌ４２的遗传定位与功能分析４０７
圈２拟南芥野生型‘Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｇ）与ｍｓｌｌ４２突变体ＩＢ，Ｄ，Ｆ，Ｈ）花药发育的细胞学观察比较 （Ａ），（Ｂ）四分体时期花药：（Ｃ），（Ｄ）单核小孢子时期花药（箭头显示小孢子空泡化）：（Ｅ），ＩＦ）双细胞花粉时期花药（箭头显示碎片）： ＩＧ），ＩＨ）三细胞花粉时期花药。Ｂａｒ＝１５ ｐｍ
１．２．６花粉粒的扫描电镜观察 在解剖镜下分离野生型和突变体植株１３期的花药， 置于金属台上。真空干燥后喷金，扫描电镜观察并拍 照记录（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａ１．。２００７；方子君等，２００８）。
１．２．７亚历山大染色 取花药刚刚开裂的花朵（此时花微微张开４片花瓣）于 载玻片上，用解剖针小心除去花瓣和雌蕊，尽可能的 不破坏花药，然后将花药固定在载玻片上。滴１—２滴 亚历山大染液（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ。１ ９６９），小心地盖上盖玻