金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)适配子的筛选和应用
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前言……………………………………………………………………………9 一、材料和方法…………………………………………………………12 二、结果…………………………………………………………………25 三、讨论…………………………………………………………………33 四、结论…………………………………………………………………39
磷酸盐缓冲液 人外周血单核淋巴细胞
polymerase chain reaction streptavidin
聚合酶链式反应 链霉亲合素
Staphylococcus aureus enterotoxin A
金黄色葡萄球菌肠毒素 A
systematic evolution of ligands by exponential 指数富集配基的系统进化
参考文献……………………………………………………………………………40 综述…………………………………………………………………………………45 致谢…………………………………………………………………………………56
2 万方数据
福建医科大学硕士学位论文
缩写 Amp Ap BSA DHA DM－S DMSO dNTP dsDNA EB EDAC EDTA ELADA ELISA IPTG Kd LB MTT
寡核苷酸文库。利用 SELEX 筛选技术，以 SEA 蛋白为靶标，筛选出与其高 亲和力、高特异性结合的适配子群，并利用荧光标记的适配子监测各轮 ssDNA 富集库与 SEA 的结合力。 2. 以结合力最高的一轮筛选产物为模板 PCR 扩增后纯化，TA 克隆、测序后， 利用 Chromas 和 DNAman 软件分析序列的一级结构并模拟二级结构。 3. 分别以地高辛-抗地高辛抗体-碱性磷酸酶系统和生物素-链霉亲和素-碱性磷 酸酶系统作为桥连建立酶联适配子直接检测法（enzyme- linked aptamer direct assay，ELADA）和斑点杂交法（dot hybridization assay，DHA），利用这两种 方法鉴定筛选出的适配子与 SEA 的亲和力和特异性。同时测定不同浓度适配 子与 SEA 的结合力，使用 GraphPad.Prism.v5.0 软件计算各候选适配子的解离 常数 Kd 值。 4. 以系列浓度的适配子同 SEA 共同刺激人外周血单核淋巴细胞，利用 MTT 法 测定 PBMC 的吸光度，并计算出刺激指数（SI）分析增殖活性。 【结果】 1. SEA与ssDNA富集库的结合力随着筛选轮数的增加逐渐提高。第9轮后结合力 从最初的5.8％上升至48.3％，提高了8倍，继续筛选将不再增加。 2. 将富集的第9轮产物进行克隆测序，成功的17个单克隆测序中共得到4条序 列，分别是：S3（3, 4, 5, 7, 9, 10, 14, 15, 18, 19）；S12（12, 16, 17, 20, 24）； S6；S23。软件模拟出各适配子的结构主要以发卡、茎环结构为主。
金黄色葡萄球菌肠毒素 A（SEA）适配子
的筛选及应用
中文摘要
【目的 】利 用指 数富集 配基 的系 统进 化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment, SELEX)技术获得能高亲和力高特异性结合金黄色葡萄球 菌肠毒素（SEA）的功能性适配子，为建立适配子快速检测 SEA 的方法奠定基 础，并为治疗金黄色葡萄球菌的感染提供新的思路。 【方法】 1. 体外合成中间为 40 nt 的随机序列，两端为固定序列，全长共 76nt 的 ssDNA
碱性磷酸酶 牛血清白蛋白 斑点杂交法 链酶亲和素标记磁珠 二甲基亚砜 脱氧核苷三磷酸 双链 DNA 溴化乙锭 乙基碳二亚胺盐酸盐 乙二胺四乙酸 酶联适配子直接检测法 酶联免疫吸附法
isopropylthio-β-galactoside
异丙基硫代-β-D-半乳糖苷
the dissociation constant lurib-Bertani medium
解离常数 LB 培养基
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazoliumbromide
3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯 基四氮唑溴盐
optical density
光密度
phosphate buffered solution peripheral blood mononuclear cell
enrichment
single-stranded DNA
单链 DNA
tris（hydroxymethyl）aminomethane
三羟甲基氨基甲烷
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-D- galactoside
5-溴-4-氯-3-吲哚-1-β- D-半乳糖
3 万方数据
福建医科大学硕士学位论文
OD PBS PBMC PCR SA SEA SELEX
ssDNA Tris X-gal
英文缩略词表
ABRIVIATIONS
英文全称
中文全称
ampicillin
氨苄青霉素
alkaline phosphatase bovine serum albumin dot hybridization assay dynabeads M-280 streptavidin dimethyl sulfoxide deoxyribonucleoside triphosphate double stranded DNA ethidium bromide ethyldimethy carbodiimide ethylenediaminotetracetic acid enzyme-linked aptamer direct assay enzyme-linked immunosorbent assay
福建医科大学硕士学位论文
1 万方数据
福建医科大学硕Biblioteka Baidu学位论文
目录
英文缩略词表………………………………………………………………………3 中文摘要……………………………………………………………………………4 英文摘要……………………………………………………………………………6 正文…………………………………………………………………………………9
磷酸盐缓冲液 人外周血单核淋巴细胞
polymerase chain reaction streptavidin
聚合酶链式反应 链霉亲合素
Staphylococcus aureus enterotoxin A
金黄色葡萄球菌肠毒素 A
systematic evolution of ligands by exponential 指数富集配基的系统进化
参考文献……………………………………………………………………………40 综述…………………………………………………………………………………45 致谢…………………………………………………………………………………56
2 万方数据
福建医科大学硕士学位论文
缩写 Amp Ap BSA DHA DM－S DMSO dNTP dsDNA EB EDAC EDTA ELADA ELISA IPTG Kd LB MTT
寡核苷酸文库。利用 SELEX 筛选技术，以 SEA 蛋白为靶标，筛选出与其高 亲和力、高特异性结合的适配子群，并利用荧光标记的适配子监测各轮 ssDNA 富集库与 SEA 的结合力。 2. 以结合力最高的一轮筛选产物为模板 PCR 扩增后纯化，TA 克隆、测序后， 利用 Chromas 和 DNAman 软件分析序列的一级结构并模拟二级结构。 3. 分别以地高辛-抗地高辛抗体-碱性磷酸酶系统和生物素-链霉亲和素-碱性磷 酸酶系统作为桥连建立酶联适配子直接检测法（enzyme- linked aptamer direct assay，ELADA）和斑点杂交法（dot hybridization assay，DHA），利用这两种 方法鉴定筛选出的适配子与 SEA 的亲和力和特异性。同时测定不同浓度适配 子与 SEA 的结合力，使用 GraphPad.Prism.v5.0 软件计算各候选适配子的解离 常数 Kd 值。 4. 以系列浓度的适配子同 SEA 共同刺激人外周血单核淋巴细胞，利用 MTT 法 测定 PBMC 的吸光度，并计算出刺激指数（SI）分析增殖活性。 【结果】 1. SEA与ssDNA富集库的结合力随着筛选轮数的增加逐渐提高。第9轮后结合力 从最初的5.8％上升至48.3％，提高了8倍，继续筛选将不再增加。 2. 将富集的第9轮产物进行克隆测序，成功的17个单克隆测序中共得到4条序 列，分别是：S3（3, 4, 5, 7, 9, 10, 14, 15, 18, 19）；S12（12, 16, 17, 20, 24）； S6；S23。软件模拟出各适配子的结构主要以发卡、茎环结构为主。
金黄色葡萄球菌肠毒素 A（SEA）适配子
的筛选及应用
中文摘要
【目的 】利 用指 数富集 配基 的系 统进 化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment, SELEX)技术获得能高亲和力高特异性结合金黄色葡萄球 菌肠毒素（SEA）的功能性适配子，为建立适配子快速检测 SEA 的方法奠定基 础，并为治疗金黄色葡萄球菌的感染提供新的思路。 【方法】 1. 体外合成中间为 40 nt 的随机序列，两端为固定序列，全长共 76nt 的 ssDNA
碱性磷酸酶 牛血清白蛋白 斑点杂交法 链酶亲和素标记磁珠 二甲基亚砜 脱氧核苷三磷酸 双链 DNA 溴化乙锭 乙基碳二亚胺盐酸盐 乙二胺四乙酸 酶联适配子直接检测法 酶联免疫吸附法
isopropylthio-β-galactoside
异丙基硫代-β-D-半乳糖苷
the dissociation constant lurib-Bertani medium
解离常数 LB 培养基
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazoliumbromide
3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯 基四氮唑溴盐
optical density
光密度
phosphate buffered solution peripheral blood mononuclear cell
enrichment
single-stranded DNA
单链 DNA
tris（hydroxymethyl）aminomethane
三羟甲基氨基甲烷
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-D- galactoside
5-溴-4-氯-3-吲哚-1-β- D-半乳糖
3 万方数据
福建医科大学硕士学位论文
OD PBS PBMC PCR SA SEA SELEX
ssDNA Tris X-gal
英文缩略词表
ABRIVIATIONS
英文全称
中文全称
ampicillin
氨苄青霉素
alkaline phosphatase bovine serum albumin dot hybridization assay dynabeads M-280 streptavidin dimethyl sulfoxide deoxyribonucleoside triphosphate double stranded DNA ethidium bromide ethyldimethy carbodiimide ethylenediaminotetracetic acid enzyme-linked aptamer direct assay enzyme-linked immunosorbent assay
福建医科大学硕士学位论文
1 万方数据
福建医科大学硕Biblioteka Baidu学位论文
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