荧光定量PCR原理及操作步骤

起点定量与终点定量
荧光化学
TaqMan
SYBR Green 1
TaqMan
SYBR Green I 工作原理
• 。 SYBR Green 1 结合到双链DNA的小沟部位
• SYBR Green 1 染料只有和双链DNA结合后才发荧光
TAGCCGTAGCATTA
G C
G C
A T
T A
GCGCA T
GT
C
AG
CA
C
变性: 无荧光信号
A CGACT A G G A T G GT A C A G T C G TG T GCTGA T C C T A C C A T GT C A G CA C
未结合SYBR Green 1 dye
SYBR Green I 应用范围
• 起始模板浓度定量
①actin ③achi ⑤aly ②actin ④achi ⑥aly
⑦vlg ⑧vlg
⑨stat ⑩stat
定量与常规PCR的差别
• 常规PCR技术：
• 对PCR扩增反应 的终产物进行定 量及定性分析
Biblioteka Baidu
定量PCR技术： 通过对PCR扩增反 应中每一个循环产 物荧光信号的实时 检测从而实现对起 始模板定量及定性 的分析
三个关键词：
实时，定量，荧光
PCR分四个阶段
如何定量？
• Ct值的概念 • Ct值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号
开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对 应的循环次数。
定量原理
确定初始模板的浓度
初始 DNA量越多, 荧光 达到某一值（域值）时 所需要的循环数越少
Log浓度与循环数呈线 性关系，根据样品扩增 达到域值的循环数就可 计算出样品中所含的模 板量
• 融解曲线分析
– ---可区分单一产物、变异产物、多种产物和（ 或）引物二聚体
• 基因型分析
SYBR Green I 优点 SYBR Green I 缺点
PCR程序指南
UNG酶使用原理
金牌Tag酶活性
参比荧光：管家荧光ROX
ROX校正效果
96孔板设置举例
PCR曲线
标准曲线
荧光定量PCR real time-PCR
定量PCR反应体系
模板cDNA Tag mixture 引物1 引物2 H20
4ul 10ul 0.5ul 0.5ul 5ul
①③⑤⑦⑨ ②④⑥⑧⑩
1♀
模板
443.45 ng/ul
17.738 ng/ul
2♂
模板
686.75 ng/ul
26.47 ng/ul