克隆载体及其主要功能

.克隆载体及其主要功能

载体是克隆基因的关键组分，载体使重组DNA分子能够在受体细胞中复制。质粒和噬菌体是两种天然的DNA载体。目前，能在不同受体细胞中使用的载体有数百种，其中，可以在大肠杆菌中使用的载体数目最多。

质粒pBR322是一种典型的大肠杆菌克隆载体，它全长仅为4.3kb。pBR322带有两种抗生素抗性基因：b -内酰胺酶基因和四环素抗性基因，前者修饰并消除氨苄青霉素对大肠杆菌的毒性。通常，目的基因插入载体质粒将破坏四环素抗性功能。因此，使用含有氨苄青霉素和四环素的培养基，我们可以鉴别大肠杆菌的转化细胞：带有重组质粒的转化细胞只能在含氨苄青霉素、不含四环素的培养基上生长；另一方面，原受体细胞不能在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上生长；而有载体质粒但没有目的基因的转化细胞能在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上生长。另外，pBR322是一种松弛型质粒，在培养液中加入氯霉素可以使转化细胞中的质粒拷贝数由通常的15个增至1000-3000个，此间，大肠杆菌的染色体并不复制。

在细菌中，噬菌体载体是另外一类常用的克隆载体。和质粒不同的是，噬菌体载体通过感染过程即转导进入宿主大肠杆菌细胞。通常，作为克隆载体的噬菌体，都经过一定的突变和缺失处理。因此，这类噬菌体进入大肠杆菌细胞之后，并不像一般噬菌体那样在宿主染色体上整合，而是直接进入裂解周期：大量复制噬菌体、裂解宿主细胞，最终在培养基上形成含有大量噬菌体拷贝的噬菌斑。

和质粒载体相比，噬菌体载体能够克隆更长的DNA片断。

3.重组克隆筛选

3.1.抗性基因插入失活筛选法

根据抗生素抗性基因插入失活原理而设计的插入失活法是重组体常用的筛选方法。如非重组的pBR322质粒DNA上的四环素和氨苄青霉素抗性基因都是正常的, 表型为AprTcr。带有这种质粒的受体菌可以在加有四环素和氨苄青霉素的双抗性平板上生长。但是, 如果在该质粒的四环素抗性基因内插入外援片段, 就会造成四环素抗性基因失活, 变成AprTcs, 携带这种质粒的宿主菌可以在氨苄青霉素的平板上生长, 而不能在四环素抗性平板上生长。

3.2. 蓝白斑筛选法

根据抗生素抗性基因插入失活原理而设计的插入失活法需要进行菌落平板的影印复制, 才能够将所需的重组体挑选出来, 大大增加了筛选的工作量。后来, 人们设计了以β-半乳糖苷酶的产生作为颜色筛选标记的载体, 简化了筛选程序, 提高了灵敏度。这类载体系统包括M13噬菌体、pUC质粒系统、pEGM质粒系统。它们的共同特点是载体上携带一段细菌的lacZ基因, 它编码β-半乳糖苷酶的一段146个氨基酸的α-肽, 载体转化的受体菌为lacZΔM15基因型。这样, 载体同宿主通过互补, 具有完整的β-半乳糖苷酶的活性。如果在载体的lacZ基

因中插入外源DNA, 造成lacZ基因失活, 不能合成α-肽, 失去同宿主的互补, 不能形成有功能的β-半乳糖苷酶, 失去分解X-gal的能力。在X-gal平板上, 含阳性重组体的细菌为物色菌落(质粒载体)或无色噬菌斑(M13噬菌体载体);

非重组体转化的细菌为蓝色菌落或蓝色噬菌斑。

4.重组克隆鉴定

酵母是目前较为有效的外源基因表达系统，可实现目的蛋白的高效分泌表达，且可对目的蛋白进行糖基化加工等。酵母表达系统利用的是乙醇氧化酶基因启动子作为强诱导型启动子，可被甲醇诱导。宿主菌GS115在His4基因位点被突变，因而只有当携有外源基因和His4基因的表达载体与酵母染色体在Aox1基因处发生同源重组后，酵母克隆才能在组氨酸缺陷培养基（MD）平板上生长。而此时由于酵母基因组上Aox1基因被取代，重组克隆仅能利用Aox2缓慢代谢甲醇（Mut p>s），表现为在MM平板上生长缓慢。因而一般采用MD/MM平板筛选法来筛选重组酵母克隆。但由于至少10%～20%的转化子是载体His4基因和GS115染色体上的His突变基因位点间的转换而形成，因而这种所谓的重组克隆并不携有载体上的目的基因表达序列。这种假阳性的克隆的排除只有用PCR方法来鉴定目的基因是否存在于酵母染色体上。传统提取酵母染色体的方法较为繁琐且耗时较长，而其他相对简便的方法中则需使用酵母裂解酶处理，我们采用了一种新的快速制备酵母染色体的方法，通过PCR鉴定重组酵母克隆，排除了MD/MM平板筛选出的假阳性克隆。