经典载体构建流程教材模板ppt
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工程菌构建载体介绍课件
PART 03
载体构建原理
质粒载体构建原理
质粒定义
质粒是一种裸露的、自我复制的双链环状DNA分 子，能稳定地独立存在于宿主细胞染色质或自主 复制的质粒DNA上，并表达其所携带的遗传信息。
质粒复制
质粒复制涉及复制起点、复制子、复制酶等要素， 通过复制酶的催化完成。
质粒特点
质粒具有分子量小、拷贝数高、不整合于宿主染 色体等特点。
基因表达元件包括启动子、 增强子、沉默子等，负责调 控基因的表达。
表达载体构建
通过基因工程技术将目的基 因插入表达载体，再导入受 体细胞，使目的基因得以表 达。
表达产物检测
通过检测表达产物的量与性 质，评估目的基因的表达情 况。
PART 04
载体构建流程
目的基因的
详细描述
基因工程在生物工程中具有广泛的应用价值，它可以 为农业提供抗病、抗虫和抗逆的转基因作物，提高产 量和降低农药使用；在医药领域，基因工程技术可用 于生产重组蛋白药物、基因治疗和疫苗开发等；在工 业领域，基因工程可用于微生物发酵生产化学品、生 物燃料和酶等；此外，基因工程还可用于环保领域， 如降解污染物和修复生态等。
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工程菌构建载体介绍 课件
目 录
• 工程菌与基因工程 • 载体构建原理 • 载体构建流程 • 载体构建的实验操作 • 载体构建的应用与展望
PART 01
引言
目的和背景
介绍工程菌构建载体 的概念和应用领域
探讨工程菌构建载体 在生物工程领域的重 要性和意义
分析工程菌构建载体 的研究现状和发展趋 势
实验试剂
限制性内切酶、T4 DNA连接酶、 DNA聚合酶、dNTPs等。
实验步骤与注意事项
经典流程图模板PPT(共49页)
PPT—流程图汇总48页
2个年代的发展对比时间线
2008
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3D箭头发展历程PPT图示
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• Description of the contents
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多个时间线素材
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简单流程
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2个年代的发展对比时间线
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载体构建流程优秀课件
初步检菌的阳性克隆接种提质粒，供后续酶 切分析以及测序检测。
酶切检测阳性克隆
将菌检的阳性克隆所得质粒进行酶切分析，获得预期 条带的即为阳性克隆。
要进一步确认是否有因PCR所带来的点突变，插入， 缺失等改变目的基因的序列，还需要对阳性克隆进行 测序。
酶切目的基因和载体
酶切注意事项
两种酶切的条件不同时，分别进行两次酶切，切 完一个纯化后再切：温度要求不同，先酶切低温 要求的，再酶切高温要求的；若盐浓度要求不同， 先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐浓度要求的。 只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反 应体系中加入BSA。BSA不会影响任何内切酶的 活性。
DNA 2
形 成
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
1
2
3
4
时间（min）
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
5
PCR常出现的问题
1.假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条
带一致， 有时其条带更整齐，亮度更高 2.出现非特异性扩增带：PCR扩增后出现的条带 与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现 特异性扩增带与非特异性扩增带 3.什么条带都没有
复苏。 （5）室温4,000rpm离心5分钟，弃去上清后，用剩余100μl
培养基重悬细胞并涂布到含抗性的LB琼脂平板表面。注意： 细胞用量应根据连接效率和感受态细胞的效率进行调整。 （6）将平板置于室温直至液体被吸收。 （7）倒置平皿，于37℃培养，12~16小时后可出现菌落。
菌落PCR
此步以适应现代分子生物学实验室批量工作 的高效性，通常只需挑半个菌落直接作为模 板进行常规PCR就能初步检测阳性克隆。
酶切检测阳性克隆
将菌检的阳性克隆所得质粒进行酶切分析，获得预期 条带的即为阳性克隆。
要进一步确认是否有因PCR所带来的点突变，插入， 缺失等改变目的基因的序列，还需要对阳性克隆进行 测序。
酶切目的基因和载体
酶切注意事项
两种酶切的条件不同时，分别进行两次酶切，切 完一个纯化后再切：温度要求不同，先酶切低温 要求的，再酶切高温要求的；若盐浓度要求不同， 先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐浓度要求的。 只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反 应体系中加入BSA。BSA不会影响任何内切酶的 活性。
DNA 2
形 成
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
1
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时间（min）
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
5
PCR常出现的问题
1.假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条
带一致， 有时其条带更整齐，亮度更高 2.出现非特异性扩增带：PCR扩增后出现的条带 与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现 特异性扩增带与非特异性扩增带 3.什么条带都没有
复苏。 （5）室温4,000rpm离心5分钟，弃去上清后，用剩余100μl
培养基重悬细胞并涂布到含抗性的LB琼脂平板表面。注意： 细胞用量应根据连接效率和感受态细胞的效率进行调整。 （6）将平板置于室温直至液体被吸收。 （7）倒置平皿，于37℃培养，12~16小时后可出现菌落。
菌落PCR
此步以适应现代分子生物学实验室批量工作 的高效性，通常只需挑半个菌落直接作为模 板进行常规PCR就能初步检测阳性克隆。
经典载体构建流程教材PPT实用课件(共23页)
经典载体构建流程
I 载体构建流程
提取mRNA RT
PCR
cDNA
得目的基因
PCR产物纯化
菌落PCR 转化 连接
纯化酶切产物
酶切目的基因和载体
保菌
挑取阳性克隆去测序
测序正确的摇菌提质粒
导入表达宿主 测试表达情况
提取mRNA
如果可能，实验室应辟出专门RNA操作区，离心 机、移液枪、试剂等均应专用。RNA操作区应保 持清洁，并定期进行消毒。.操作过程中应自始至 终佩戴口罩和手套，并经常更换，以避免将手、 臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带 入试管或污染用具。操作过程所用器材都要经过 特殊处理。一次性枪头、离心管等塑料制品 采用 连续灭菌两次来灭活RNA酶。研钵 180℃ ，4h。
DNA 2
形 成
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
1
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时间（min）
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
5
PCR常出现的问题
1.假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条
带一致， 有时其条带更整齐，亮度更高 2.出现非特异性扩增带：PCR扩增后出现的条带 与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现 特异性扩增带与非特异性扩增带 3.什么条带都没有
酶切目的基因和载体
酶切注意事项
两种酶切的条件不同时，分别进行两次酶切，切 完一个纯化后再切：温度要求不同，先酶切低温 要求的，再酶切高温要求的；若盐浓度要求不同， 先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐浓度要求的。 只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反 应体系中加入BSA。BSA不会影响任何内切酶的 活性。
I 载体构建流程
提取mRNA RT
PCR
cDNA
得目的基因
PCR产物纯化
菌落PCR 转化 连接
纯化酶切产物
酶切目的基因和载体
保菌
挑取阳性克隆去测序
测序正确的摇菌提质粒
导入表达宿主 测试表达情况
提取mRNA
如果可能，实验室应辟出专门RNA操作区，离心 机、移液枪、试剂等均应专用。RNA操作区应保 持清洁，并定期进行消毒。.操作过程中应自始至 终佩戴口罩和手套，并经常更换，以避免将手、 臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带 入试管或污染用具。操作过程所用器材都要经过 特殊处理。一次性枪头、离心管等塑料制品 采用 连续灭菌两次来灭活RNA酶。研钵 180℃ ，4h。
DNA 2
形 成
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
1
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时间（min）
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
5
PCR常出现的问题
1.假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条
带一致， 有时其条带更整齐，亮度更高 2.出现非特异性扩增带：PCR扩增后出现的条带 与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现 特异性扩增带与非特异性扩增带 3.什么条带都没有
酶切目的基因和载体
酶切注意事项
两种酶切的条件不同时，分别进行两次酶切，切 完一个纯化后再切：温度要求不同，先酶切低温 要求的，再酶切高温要求的；若盐浓度要求不同， 先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐浓度要求的。 只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反 应体系中加入BSA。BSA不会影响任何内切酶的 活性。
1.2-2基因表达载体的构建(共15张PPT)【优秀课件】
1.2-2基因表达载体的构建(共15张PPT )【优 秀课件 】
1.日本那些再现曲水宴的表演，有着 不少“中 国元素”，但是 由于现 代年轻 人对古 代中国 文化了 解甚少 ，并不 知道哪 些元素 来自中 国。 2.本着保证校车安全的原则，公安机 关将会 同教育 行政等 部门对 校车驾 驶人进 行逐一 审查， 坚决清 退不符 合安全 规定的 校车驾 驶人。 3.山寨文化是一种平民文化、草根文 化，自 然有其 存在的 意义和 价值， 但山寨 产品的 泛滥则 是中国 知识产 权意识 不足的 揭露与 讽刺。
谢谢观赏 4.神舟7号宇宙飞船载着三位航天英雄胜利返回地球，这艘宇宙飞船是我们国家自行研制的，每一个中国人不能不为之骄傲。 5.这家工厂虽然规模不大，但曾两次 荣获省 科学大 会奖， 三次被 授予省 优质产 品称号 ，产品 远销全 国各地 和东南 亚地区 。 6.杭州湾跨海大桥是一座由我国自行 建造、 自行设 计、自 行管理 、自行 投资的 特大型 交通基 础设施 ，是我 国跨海 大桥建 设史上 的一个 重要里 程碑。 7、为防止东南亚地区发生的禽流感 传入我 国，国 家质检 总局和 农业部 今天联 合发出 通知， 自即日 暂行禁 止进口 来自疫 区的禽 类及其 产品。
基因工程的基本操作程序P8
目的基因的获取 方法
目的基因的获取可以从自然界中已有的物种中分离出来，也可以用人工 的方法合成。1.从基因中获取2.利用PCR
技术扩增目 的基因
3.化学方法直
接人工合成
第二步：基因表达载体的构建（核心步骤）
1.基因表达载体构建的
使目的基因在受体细胞中 稳定存在 ，并且可以遗传给下一代 使目的基因能够___表_达____和 发挥作用 。
1.下列有关抗虫基因表达载体的叙述，正确的是（ C ）
1.日本那些再现曲水宴的表演，有着 不少“中 国元素”，但是 由于现 代年轻 人对古 代中国 文化了 解甚少 ，并不 知道哪 些元素 来自中 国。 2.本着保证校车安全的原则，公安机 关将会 同教育 行政等 部门对 校车驾 驶人进 行逐一 审查， 坚决清 退不符 合安全 规定的 校车驾 驶人。 3.山寨文化是一种平民文化、草根文 化，自 然有其 存在的 意义和 价值， 但山寨 产品的 泛滥则 是中国 知识产 权意识 不足的 揭露与 讽刺。
谢谢观赏 4.神舟7号宇宙飞船载着三位航天英雄胜利返回地球，这艘宇宙飞船是我们国家自行研制的，每一个中国人不能不为之骄傲。 5.这家工厂虽然规模不大，但曾两次 荣获省 科学大 会奖， 三次被 授予省 优质产 品称号 ，产品 远销全 国各地 和东南 亚地区 。 6.杭州湾跨海大桥是一座由我国自行 建造、 自行设 计、自 行管理 、自行 投资的 特大型 交通基 础设施 ，是我 国跨海 大桥建 设史上 的一个 重要里 程碑。 7、为防止东南亚地区发生的禽流感 传入我 国，国 家质检 总局和 农业部 今天联 合发出 通知， 自即日 暂行禁 止进口 来自疫 区的禽 类及其 产品。
基因工程的基本操作程序P8
目的基因的获取 方法
目的基因的获取可以从自然界中已有的物种中分离出来，也可以用人工 的方法合成。1.从基因中获取2.利用PCR
技术扩增目 的基因
3.化学方法直
接人工合成
第二步：基因表达载体的构建（核心步骤）
1.基因表达载体构建的
使目的基因在受体细胞中 稳定存在 ，并且可以遗传给下一代 使目的基因能够___表_达____和 发挥作用 。
1.下列有关抗虫基因表达载体的叙述，正确的是（ C ）
载体构建流程pp课件
• 切胶回收PCR产物时，避免DNA在紫外线下暴露时间过长 从而形成嘧啶二聚体，造成PCR产物不能连接。
• 凝胶电泳检测纯化后的PCR产物的浓度，优化连接反应时 插入片段与载体摩尔比例为2:1~10:1（通常为3:1）。
• PCR产物及载体应尽量避免反复冻融，否则易造成3’末端 残基的丢失。
• 一般连接25度2小时，16或4度过夜。
• 另外酶切后纯化前，均需热灭活，以免残余的限 制性内切酶干扰后续连接反应，降低阳性率。
15
回收前
回收后
酶切载体带 酶切目的条带
16
连接
• 催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二 酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接。
• PCR产物最好进行切胶回收纯化，以去除PCR产物中的非特 异性片段和引物等杂质。
• 初步检菌的阳性克隆接种提质粒，供后续酶 切分析以及测序检测。
20
酶切检测阳性克隆
• 将菌检的阳性克隆所得质粒进行酶切分析，获得预期 条带的即为阳性克隆。
• 要进一步确认是否有因PCR所带来的点突变，插入， 缺失等改变目的基因的序列，还需要对阳性克隆进行 测序。
• 选用的酶通常为设计引物的两个酶，因为它能完整切 下ORF和载体骨架，可以通过条带大小以判断阳性克 隆。
• 什么条带都没有，其原因可能是少加东西，酶已经失活了，或退火温 度太高等。解决方法：检查是否少加东西了，换一下酶，降低退火温 度或做个梯度，摸一下条件。
10
PCR产物纯化
• 倘若直接对PCR产物进行酶切，体系的杂蛋 白、离子等会造成酶切困难或星活性，残 余的聚合酶也会填平粘性末端，造成克隆 失败。
21
挑取阳性克隆去测序
• 测序是构建载体的最后一个关键的环节，只有测 序正确的阳性克隆才算成功构建载体。
• 凝胶电泳检测纯化后的PCR产物的浓度，优化连接反应时 插入片段与载体摩尔比例为2:1~10:1（通常为3:1）。
• PCR产物及载体应尽量避免反复冻融，否则易造成3’末端 残基的丢失。
• 一般连接25度2小时，16或4度过夜。
• 另外酶切后纯化前，均需热灭活，以免残余的限 制性内切酶干扰后续连接反应，降低阳性率。
15
回收前
回收后
酶切载体带 酶切目的条带
16
连接
• 催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二 酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接。
• PCR产物最好进行切胶回收纯化，以去除PCR产物中的非特 异性片段和引物等杂质。
• 初步检菌的阳性克隆接种提质粒，供后续酶 切分析以及测序检测。
20
酶切检测阳性克隆
• 将菌检的阳性克隆所得质粒进行酶切分析，获得预期 条带的即为阳性克隆。
• 要进一步确认是否有因PCR所带来的点突变，插入， 缺失等改变目的基因的序列，还需要对阳性克隆进行 测序。
• 选用的酶通常为设计引物的两个酶，因为它能完整切 下ORF和载体骨架，可以通过条带大小以判断阳性克 隆。
• 什么条带都没有，其原因可能是少加东西，酶已经失活了，或退火温 度太高等。解决方法：检查是否少加东西了，换一下酶，降低退火温 度或做个梯度，摸一下条件。
10
PCR产物纯化
• 倘若直接对PCR产物进行酶切，体系的杂蛋 白、离子等会造成酶切困难或星活性，残 余的聚合酶也会填平粘性末端，造成克隆 失败。
21
挑取阳性克隆去测序
• 测序是构建载体的最后一个关键的环节，只有测 序正确的阳性克隆才算成功构建载体。
腺病毒载体构建(共10张PPT)
腺病毒载体构建
腺病毒
•腺病毒 Adenovirus 最初由人类腺样增殖体组织培养中分离得到的，
此病毒名称也由此而来。质粒是直径约70毫微米的正二十面体，各
顶点具有突起。结构亚基总数为252个。核酸是双链DNA，分子量20— 25×106。无包膜。在被感染的细胞核中增殖，病毒蛋白在细胞质内合
成，再输送到细胞核。 •腺病毒可见于人、鸡、牛、狗、鼠、猪和猴中，并各自具有严格的 寄主特异性，不感染他种动物。对人类可引起感冒症状、呼吸系统不 适等。
大
腺病毒基因完全缺失载体克隆容量可达37kb。
安全性好 无需整合进宿主细胞基因组中，目的基因在宿主细胞 基因组外游离状态下表达，整合突变致癌可能性小。
腺病毒 是一种大分子线性双链无包膜DNA病毒。它通 过 受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组
转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞 基因组中.
腺病毒的基因及其功能
ITR Ψ E1a/E1b E2 E3 E4 ITR
腺病毒基因组编ห้องสมุดไป่ตู้数十个腺病毒的结构和功能蛋白，分为早期表达和晚期表 达。
AdEasy腺病毒载体系统
稳定性 高
腺病毒粒子相对稳定，插入外源基因的病毒基因组在
连续传代中保持不变，易于用重组DNA技术操作。
宿主范 围广
可转入分裂后的非分裂细胞中发挥作用，可以感染处 于分裂状态的细胞。
感染性
强
可经不同途径进入不同组织(可以在肠道内繁殖，也可 以 在呼吸道内繁殖。
包装容量 改建腺病毒基因部分缺失载体的克隆容量可达10kb，
统需要一个腺病毒突变体作为辅助病毒。
腺病毒基因组编码数十个腺病毒的结构和功能蛋白，分为早期表达和晚期表达。 （科研、临床应用最广泛 E4蛋白调节有效的晚期基因转录 E3蛋白对抗宿主的抗病毒防御系统 改建腺病毒基因部分缺失载体的克隆容量可达10kb，腺病毒基因完全缺失载体克隆容量可达37kb。 （科研、临床应用最广泛 载体。 载体。 第一代腺病毒载体：一般将E1或E3基因缺失的腺病毒载体成为一代 腺病毒粒子相对稳定，插入外源基因的病毒基因组在连续传代中保持不变，易于用重组DNA技术操作。
腺病毒
•腺病毒 Adenovirus 最初由人类腺样增殖体组织培养中分离得到的，
此病毒名称也由此而来。质粒是直径约70毫微米的正二十面体，各
顶点具有突起。结构亚基总数为252个。核酸是双链DNA，分子量20— 25×106。无包膜。在被感染的细胞核中增殖，病毒蛋白在细胞质内合
成，再输送到细胞核。 •腺病毒可见于人、鸡、牛、狗、鼠、猪和猴中，并各自具有严格的 寄主特异性，不感染他种动物。对人类可引起感冒症状、呼吸系统不 适等。
大
腺病毒基因完全缺失载体克隆容量可达37kb。
安全性好 无需整合进宿主细胞基因组中，目的基因在宿主细胞 基因组外游离状态下表达，整合突变致癌可能性小。
腺病毒 是一种大分子线性双链无包膜DNA病毒。它通 过 受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组
转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞 基因组中.
腺病毒的基因及其功能
ITR Ψ E1a/E1b E2 E3 E4 ITR
腺病毒基因组编ห้องสมุดไป่ตู้数十个腺病毒的结构和功能蛋白，分为早期表达和晚期表 达。
AdEasy腺病毒载体系统
稳定性 高
腺病毒粒子相对稳定，插入外源基因的病毒基因组在
连续传代中保持不变，易于用重组DNA技术操作。
宿主范 围广
可转入分裂后的非分裂细胞中发挥作用，可以感染处 于分裂状态的细胞。
感染性
强
可经不同途径进入不同组织(可以在肠道内繁殖，也可 以 在呼吸道内繁殖。
包装容量 改建腺病毒基因部分缺失载体的克隆容量可达10kb，
统需要一个腺病毒突变体作为辅助病毒。
腺病毒基因组编码数十个腺病毒的结构和功能蛋白，分为早期表达和晚期表达。 （科研、临床应用最广泛 E4蛋白调节有效的晚期基因转录 E3蛋白对抗宿主的抗病毒防御系统 改建腺病毒基因部分缺失载体的克隆容量可达10kb，腺病毒基因完全缺失载体克隆容量可达37kb。 （科研、临床应用最广泛 载体。 载体。 第一代腺病毒载体：一般将E1或E3基因缺失的腺病毒载体成为一代 腺病毒粒子相对稳定，插入外源基因的病毒基因组在连续传代中保持不变，易于用重组DNA技术操作。
《载体构建流程》课件
度。
案例三：物联网设备中的载体应用
要点一
总结词
要点二
详细描述
物联网设备中的载体构建主要关注设备的物理设计、通信 协议和数据传输等方面。
在物联网设备中，载体构建涉及设备的外观设计、内部结 构、通信协议选择和数据传输方案等。一个优秀的物理设 计能够确保设备的稳定性和耐用性；合理的通信协议选择 能够提高设备间的通信效率和稳定性；而高效的数据传输 方案则能够确保设备收集的数据能够及时准确地传输到中 心服务器进行处理。
使用调试技术定位和解决 载体构建过程中的错误和 异常，确保载体的稳定性 和可靠性。
04
载体构建的实际应用案例
案例一：网站建设中的载体应用
总结词
网站建设是载体构建的重要应用领域，通过合理的架构设计和内容规划，能够提高网站的可用性和用户体验。
详细描述
在网站建设中，载体构建主要涉及网站的页面设计、布局、导航、内容组织等方面。通过合理的页面设计，可以 提升网站的视觉效果和吸引力；合理的布局和导航设计，可以提高用户浏览和查找信息的效率；而合理的内容规 划，则能够确保网站提供的信息具有价值，满足用户需求。
载体制作
编程实现
根据设计稿，使用编程语言和工 具实现载体功能。
素材准备
准备所需的图片、音频、视频等 素材，确保内容质量。
测试与调试
在制作过程中，对载体进行测试 和调试，确保功能正常。
载体测试
功能测试
对载体的各项功能进行测试，确保其正常工作。
兼容性测试
测试载体在不同操作系统、浏览器等环境下的兼 容性。
案例四：游戏开发中的载体应用
总结词
游戏开发中的载体构建主要关注游戏画面的表现力、操 作体验和游戏机制等方面。
详细描述
案例三：物联网设备中的载体应用
要点一
总结词
要点二
详细描述
物联网设备中的载体构建主要关注设备的物理设计、通信 协议和数据传输等方面。
在物联网设备中，载体构建涉及设备的外观设计、内部结 构、通信协议选择和数据传输方案等。一个优秀的物理设 计能够确保设备的稳定性和耐用性；合理的通信协议选择 能够提高设备间的通信效率和稳定性；而高效的数据传输 方案则能够确保设备收集的数据能够及时准确地传输到中 心服务器进行处理。
使用调试技术定位和解决 载体构建过程中的错误和 异常，确保载体的稳定性 和可靠性。
04
载体构建的实际应用案例
案例一：网站建设中的载体应用
总结词
网站建设是载体构建的重要应用领域，通过合理的架构设计和内容规划，能够提高网站的可用性和用户体验。
详细描述
在网站建设中，载体构建主要涉及网站的页面设计、布局、导航、内容组织等方面。通过合理的页面设计，可以 提升网站的视觉效果和吸引力；合理的布局和导航设计，可以提高用户浏览和查找信息的效率；而合理的内容规 划，则能够确保网站提供的信息具有价值，满足用户需求。
载体制作
编程实现
根据设计稿，使用编程语言和工 具实现载体功能。
素材准备
准备所需的图片、音频、视频等 素材，确保内容质量。
测试与调试
在制作过程中，对载体进行测试 和调试，确保功能正常。
载体测试
功能测试
对载体的各项功能进行测试，确保其正常工作。
兼容性测试
测试载体在不同操作系统、浏览器等环境下的兼 容性。
案例四：游戏开发中的载体应用
总结词
游戏开发中的载体构建主要关注游戏画面的表现力、操 作体验和游戏机制等方面。
详细描述
人教版生物选修三1.2节DNA重组技术的基本操作程序(2)基因表达载体的构建课件(共18张PPT)(
组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添 加 抗生素B 的培养基进行培养。
巩 固提 高
例2、【2016年江苏高考33题（节选）】下表是几种限制酶识别序 列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中 切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：
（1）用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用
抗生素 抗性基因
破 思考讨论：
选用EcoRⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶切割外源DNA和质粒，
可以形成哪些连接产物？
质粒和含目的基因的外源DNA正向连接
限制酶的选择：EcoRⅠ和HindⅢ切割结果分析
EcoRⅠ
… GAATTC … CTTAAG
目的基因
HindⅢ
AAGCTT … TTCGAA…
HindⅢ EcoRⅠ
BclⅠ和Hind Ⅲ 两种限制酶切割。
（2）为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板
培养基中添加
四环素 。
筛选导入重组质粒的受体细胞
【2019年江苏高考33题（改编）】下图是某基因工程中构建
重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因（
tetr)和氨苄青霉素抗性基因（ampr）。
模拟制作——基因表达载体的构建
方法步骤
3.一种限制酶切割：用剪刀（代表EcoRⅠ，识别序列及切
割位点为G↓AATTC）切割“质粒”和“含目的基因的外源 DNA”。用双手代表DNA连接酶，分别体验质粒自身环 化、含目的基因的外源DNA自身环化、质粒和含目的基因 的外源DNA正、反向连接的过程。
1和2连接， 1 '和2'连接 正向 相互连接
1和2'连接，1 '和2连接 反向
巩 固提 高
例2、【2016年江苏高考33题（节选）】下表是几种限制酶识别序 列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中 切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：
（1）用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用
抗生素 抗性基因
破 思考讨论：
选用EcoRⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶切割外源DNA和质粒，
可以形成哪些连接产物？
质粒和含目的基因的外源DNA正向连接
限制酶的选择：EcoRⅠ和HindⅢ切割结果分析
EcoRⅠ
… GAATTC … CTTAAG
目的基因
HindⅢ
AAGCTT … TTCGAA…
HindⅢ EcoRⅠ
BclⅠ和Hind Ⅲ 两种限制酶切割。
（2）为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板
培养基中添加
四环素 。
筛选导入重组质粒的受体细胞
【2019年江苏高考33题（改编）】下图是某基因工程中构建
重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因（
tetr)和氨苄青霉素抗性基因（ampr）。
模拟制作——基因表达载体的构建
方法步骤
3.一种限制酶切割：用剪刀（代表EcoRⅠ，识别序列及切
割位点为G↓AATTC）切割“质粒”和“含目的基因的外源 DNA”。用双手代表DNA连接酶，分别体验质粒自身环 化、含目的基因的外源DNA自身环化、质粒和含目的基因 的外源DNA正、反向连接的过程。
1和2连接， 1 '和2'连接 正向 相互连接
1和2'连接，1 '和2连接 反向
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复苏。 （5）室温4,000rpm离心5分钟，弃去上清后，用剩余100μl
培养基重悬细胞并涂布到含抗性的LB琼脂平板表面。注意： 细胞用量应根据连接效率和感受态细胞的效率进行调整。 （6）将平板置于室温直至液体被吸收。 （7）倒置平皿，于37℃培养，12~16小时后可出现菌落。
菌落PCR
此步以适应现代分子生物学实验室批量工作 的高效性，通常只需挑半个菌落直接作为模 板进行常规PCR就能初步检测阳性克隆。
经典载体构建流程
I 载体构建流程
提取mRNA RT
PCR
cDNA
得到目的基因
PCR产物纯化
菌落PCR 转化 连接
纯化酶切产物
酶切目的基因和载体
保菌
挑取阳性克隆去测序
测序正确的摇菌提质粒
导入表达宿主 测试表达情况
提取mRNA
如果可能，实验室应辟出专门RNA操作区，离心 机、移液枪、试剂等均应专用。RNA操作区应保 持清洁，并定期进行消毒。.操作过程中应自始至 终佩戴口罩和手套，并经常更换，以避免将手、 臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带 入试管或污染用具。操作过程所用器材都要经过 特殊处理。一次性枪头、离心管等塑料制品 采用 连续灭菌两次来灭活RNA酶。研钵 180℃ ，4h。
注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出 现星号活性，可通过增加反应体系的总体积的方 法实现这一要求。
酶切常见问题
纯化酶切产物
通常此步是必要的，可以对比未经纯化的酶切产 物进行连接后获得的阳性克隆大大低于胶回收酶 切产物连接所得阳性克隆。
此步的目的是去除多余的片段，得到单一纯化的 目的基因与载体骨架，使之连接不受其他序列干 扰。
解决方法
假阳性的原因及解决方法：可能引物设计不合适：选择的扩增序列与 非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产 物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需 重新设计引物。还有就是靶序列或扩增产物的交叉污染 。
非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引 物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及 PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出 现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特 异性扩增。 其对策有：①必要时重新设计引物。②减低酶量或调 换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。 ④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与 延伸)。
DNA 2
形 成
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
1
2
3
4
时间（min）
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
5
PCR常出现的问题
1.假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条
带一致， 有时其条带更整齐，亮度更高 2.出现非特异性扩增带：PCR扩增后出现的条带 与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现 特异性扩增带与非特异性扩增带 3.什么条带都没有
切胶回收PCR产物时，避免DNA在紫外线下暴露时间过长 从而形成嘧啶二聚体，造成PCR产物不能连接。
凝胶电泳检测纯化后的PCR产物的浓度，优化连接反应时 插入片段与载体摩尔比例为2:1~10:1（通常为3:1）。
PCR产物及载体应尽量避免反复冻融，否则易造成3’末端 残基的丢失。
一般连接25度2小时，16或4度过夜。
RT
由于真核基因是由非编码的内含子将ORF分隔开 来的断裂基因，若以基因组为模板PCR得到的片 段克隆进载体，不能在原核细胞剪接内含子，也 不能在非对象真核细胞中正确剪接表达。所以要 克隆真核蛋白基因，需以不含内含子的连续编码 的mRNA为模板。
PCR耐热酶不能直接以mRNA为模板扩增，必须 通过逆转录酶将mRNA逆转录为cDNA,再以cDNA 为模板扩增目的基因。
什么条带都没有，其原因可能是少加东西，酶已经失活了，或退火温 度太高等。解决方法：检查是否少加东西了，换一下酶，降低退火温 度或做个梯度，摸一下条件。
PCR产物纯化
倘若直接对PCR产物进行酶切，体系的杂 蛋白、离子等会造成酶切困难或星活性， 残余的聚合酶也会填平粘性末端，造成克 隆失败。
所以此步对整个分子克隆都至关重要，可 适当用酚抽提、柱纯化，必要的话也可以 胶回收。
根据不同的目的，可有三类引物选择
PCR得到目的基因
刚开始摸条件时，
都会先做一个梯
度PCR，出最
适条件。
由于此步为获 取正确的目的基
94
温
度 72
（℃）
因，所以尽量避
55
免PCR的突变格
外重要。其中所
采取的措施有：
22
使用高保真酶、
循环次数控制在
300cycle左右、
引物设计合理等。
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
转化
基本步骤： （1）将100μl感受态细胞于冰上解冻。 （2）取5μl连接产物加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次以
混匀内容物。 在冰上放置30分钟。 （3）将管放入预加温到42℃的水浴中，热激90秒。快速将
管转移到冰浴中，使细胞冷却1~2分钟。 （4）每管中加700μl LB培养基，37℃振荡培养1小时，进行
另外酶切后纯化前，均需热灭活，以免残余的限 制性内切酶干扰后续连接反应，降低阳性率。
回收前
酶切载体带 酶切目的条带
回收后
连接
催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二 酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接。
PCR产物最好进行切胶回收纯化，以去除PCR产物中的非 特异性片段和引物等杂质。
酶切目的基因和载体
酶切注意事项
两种酶切的条件不同时，分别进行两次酶切，切 完一个纯化后再切：温度要求不同，先酶切低温 要求的，再酶切高温要求的；若盐浓度要求不同， 先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐浓度要求的。 只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反 应体系中加入BSA。BSA不会影响任何内切酶的 活性。
初步检菌的阳性克隆接种提质粒，供后续酶 切分析以及测序检测。
酶切检测阳性克隆
将菌检的阳性克隆所得质粒进行酶切分析，获得预期 条带的即为阳性克隆。
要进一步确认是否有因PCR所带来的点突变，插入， 缺失等改变目的基因的序列，还需要对阳性克隆进行 测序。
培养基重悬细胞并涂布到含抗性的LB琼脂平板表面。注意： 细胞用量应根据连接效率和感受态细胞的效率进行调整。 （6）将平板置于室温直至液体被吸收。 （7）倒置平皿，于37℃培养，12~16小时后可出现菌落。
菌落PCR
此步以适应现代分子生物学实验室批量工作 的高效性，通常只需挑半个菌落直接作为模 板进行常规PCR就能初步检测阳性克隆。
经典载体构建流程
I 载体构建流程
提取mRNA RT
PCR
cDNA
得到目的基因
PCR产物纯化
菌落PCR 转化 连接
纯化酶切产物
酶切目的基因和载体
保菌
挑取阳性克隆去测序
测序正确的摇菌提质粒
导入表达宿主 测试表达情况
提取mRNA
如果可能，实验室应辟出专门RNA操作区，离心 机、移液枪、试剂等均应专用。RNA操作区应保 持清洁，并定期进行消毒。.操作过程中应自始至 终佩戴口罩和手套，并经常更换，以避免将手、 臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带 入试管或污染用具。操作过程所用器材都要经过 特殊处理。一次性枪头、离心管等塑料制品 采用 连续灭菌两次来灭活RNA酶。研钵 180℃ ，4h。
注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出 现星号活性，可通过增加反应体系的总体积的方 法实现这一要求。
酶切常见问题
纯化酶切产物
通常此步是必要的，可以对比未经纯化的酶切产 物进行连接后获得的阳性克隆大大低于胶回收酶 切产物连接所得阳性克隆。
此步的目的是去除多余的片段，得到单一纯化的 目的基因与载体骨架，使之连接不受其他序列干 扰。
解决方法
假阳性的原因及解决方法：可能引物设计不合适：选择的扩增序列与 非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产 物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需 重新设计引物。还有就是靶序列或扩增产物的交叉污染 。
非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引 物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及 PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出 现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特 异性扩增。 其对策有：①必要时重新设计引物。②减低酶量或调 换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。 ④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与 延伸)。
DNA 2
形 成
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
1
2
3
4
时间（min）
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
5
PCR常出现的问题
1.假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条
带一致， 有时其条带更整齐，亮度更高 2.出现非特异性扩增带：PCR扩增后出现的条带 与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现 特异性扩增带与非特异性扩增带 3.什么条带都没有
切胶回收PCR产物时，避免DNA在紫外线下暴露时间过长 从而形成嘧啶二聚体，造成PCR产物不能连接。
凝胶电泳检测纯化后的PCR产物的浓度，优化连接反应时 插入片段与载体摩尔比例为2:1~10:1（通常为3:1）。
PCR产物及载体应尽量避免反复冻融，否则易造成3’末端 残基的丢失。
一般连接25度2小时，16或4度过夜。
RT
由于真核基因是由非编码的内含子将ORF分隔开 来的断裂基因，若以基因组为模板PCR得到的片 段克隆进载体，不能在原核细胞剪接内含子，也 不能在非对象真核细胞中正确剪接表达。所以要 克隆真核蛋白基因，需以不含内含子的连续编码 的mRNA为模板。
PCR耐热酶不能直接以mRNA为模板扩增，必须 通过逆转录酶将mRNA逆转录为cDNA,再以cDNA 为模板扩增目的基因。
什么条带都没有，其原因可能是少加东西，酶已经失活了，或退火温 度太高等。解决方法：检查是否少加东西了，换一下酶，降低退火温 度或做个梯度，摸一下条件。
PCR产物纯化
倘若直接对PCR产物进行酶切，体系的杂 蛋白、离子等会造成酶切困难或星活性， 残余的聚合酶也会填平粘性末端，造成克 隆失败。
所以此步对整个分子克隆都至关重要，可 适当用酚抽提、柱纯化，必要的话也可以 胶回收。
根据不同的目的，可有三类引物选择
PCR得到目的基因
刚开始摸条件时，
都会先做一个梯
度PCR，出最
适条件。
由于此步为获 取正确的目的基
94
温
度 72
（℃）
因，所以尽量避
55
免PCR的突变格
外重要。其中所
采取的措施有：
22
使用高保真酶、
循环次数控制在
300cycle左右、
引物设计合理等。
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
转化
基本步骤： （1）将100μl感受态细胞于冰上解冻。 （2）取5μl连接产物加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次以
混匀内容物。 在冰上放置30分钟。 （3）将管放入预加温到42℃的水浴中，热激90秒。快速将
管转移到冰浴中，使细胞冷却1~2分钟。 （4）每管中加700μl LB培养基，37℃振荡培养1小时，进行
另外酶切后纯化前，均需热灭活，以免残余的限 制性内切酶干扰后续连接反应，降低阳性率。
回收前
酶切载体带 酶切目的条带
回收后
连接
催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二 酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接。
PCR产物最好进行切胶回收纯化，以去除PCR产物中的非 特异性片段和引物等杂质。
酶切目的基因和载体
酶切注意事项
两种酶切的条件不同时，分别进行两次酶切，切 完一个纯化后再切：温度要求不同，先酶切低温 要求的，再酶切高温要求的；若盐浓度要求不同， 先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐浓度要求的。 只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反 应体系中加入BSA。BSA不会影响任何内切酶的 活性。
初步检菌的阳性克隆接种提质粒，供后续酶 切分析以及测序检测。
酶切检测阳性克隆
将菌检的阳性克隆所得质粒进行酶切分析，获得预期 条带的即为阳性克隆。
要进一步确认是否有因PCR所带来的点突变，插入， 缺失等改变目的基因的序列，还需要对阳性克隆进行 测序。