最新免疫组化双重染色技术
多重免疫组化技术流程概述
多重免疫组化技术流程概述多重免疫组化技术是一种在细胞和组织水平上同时检测多个抗原的方法。
它结合了多种免疫学技术，如免疫荧光染色、酶免疫组织化学染色和免疫组织化学染色等，能够提供详细的细胞和组织信息。
多重免疫组化技术的流程一般包括以下几个步骤：1. 标本制备：首先需要收集组织样本或细胞样本，并进行固定和包埋处理。
固定可以保持细胞和组织的形态结构，同时保护抗原的抗原性。
包埋则是将样本固定在切片上，便于后续的染色和观察。
2. 抗原恢复：对于某些抗原，组织样本中的天然结构可能会导致抗原的遮掩，需要通过抗原恢复的方法使抗原重新暴露出来。
抗原恢复的方法包括热诱导抗原恢复（HIER）和酶诱导抗原恢复（EIER）等。
3. 抗体选择：根据研究目的，选择适当的一抗和二抗。
一抗是识别目标抗原的主要抗体，二抗则与一抗结合形成复合物，并携带染色物质或荧光标记物。
4. 染色和显色：根据所选择的染色方法，将一抗和二抗与样本中的抗原结合。
常用的染色方法有免疫荧光染色、酶免疫组织化学染色和免疫组织化学染色等。
免疫荧光染色利用荧光标记的二抗可以通过荧光显微镜观察。
酶免疫组织化学染色则通过酶标记的二抗和底物反应产生可见的颜色。
免疫组织化学染色则使用酶标记的二抗和特定的染色剂进行染色。
5. 显微观察和图像分析：将染色后的样本放置在显微镜下观察，并进行图像采集和分析。
根据染色的结果，可以对细胞和组织中的抗原进行定性和定量分析。
多重免疫组化技术的优点在于可以同时检测多个抗原，从而提供更全面的信息。
它可以应用于各种研究领域，如肿瘤学、免疫学和神经科学等。
通过对多个抗原的检测，可以了解它们在细胞和组织水平上的分布和相互关系，进而推断其功能和相互作用。
然而，多重免疫组化技术也存在一些挑战和限制。
首先，不同抗体的选择和优化需要一定的经验和时间。
其次，不同抗体的交叉反应也可能导致误判。
此外，多重免疫组化技术的操作复杂，需要一定的设备和技术支持。
多重免疫组化技术是一种强大的工具，可以提供详细的细胞和组织信息。
免疫组化-双重染色
免疫组化-双重染色免疫组化双重染色方法和步骤：在生物医学和临床研究实践中，经常需要检测两种不同物质是否在同一样品中共存或同一种细胞中共存，因此出现了免疫组织化学双重染色。
此方法有几种类型，包括免疫酶组织化学和免疫荧光细胞化学法结合;同一切片的再度染色法(先对第一种抗原染色，阳性部位拍照，再用酸处理使抗原抗体解离，继之，对第二种抗原染色、拍照);两种酶标抗体3又重染色(分别用辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶标记第二抗体.用间接法分别显示A和B抗原，如两种一抗来自同一种属，常有重叠染色);不同种属来源的抗体双重染色。
目前，最常用的是最后一种方法。
不同种属来源的抗体双重染色，两种抗体间无交又反应.特异性较高，即使细胞内抗原量很少也能检测。
但是，当两种抗原存在于同一部位而其中之一浓度较高，占绝对优势时将妨碍另一种抗原染色，此种情况应分别染色，首先染色含量较少的抗原，再显示含量丰富的抗原。
在该方法中应用最多的是把SABC法或SP法的实验流程重复两次，其中两种不同特异性抗体(可以是小鼠或大鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体的任何两个组合)，与一抗对应的不同种属生物素化二抗和两种不同显色系统。
即可将不同部位或相同部位的两种抗原显示出来。
该方法用于石蜡切片时应考虑所选择的两个抗体的修复方法应该一致或一个抗体的修复对另一个抗体的染色结果没有影响。
试剂配制：1、3％过氧化氢甲醇：30％H2O210ml＋纯甲醇90ml→充分混匀。
2、0.3％过氧化氢甲醇：30％H2O21ml＋纯甲醇99ml→充分混匀。
3、免疫组化专用PBS（pH7.2—7.6）：NaCl8.5g＋磷酸氢二钠（无水）2.8g＋磷酸二氢钠（无水）0.4g溶于双蒸水并定容至1000毫升。
然后测pH值使之在7.2—7.6。
如果用的是含水磷酸盐，应加上分子式中水的含量。
4、0.3％TritonX－100（聚乙二醇辛基苯基醚）：TritonX－100是一种非离子型表面活性剂（或称清洁剂），分子量为646.86（C34H62O11）。
免疫组化双重染色技术在胸腺肿瘤PD-L1检测中的应用
-1032-临床与实验病理学杂志J Cliv Exp Patinl2020Dec；36(8)网络出版时间：2020-8-258：46网络出版地址：https://kus.c/di.ue/kcms/2e4il/34.1073.R.62221025.1457.025.htul免疫组化双重染色技术在胸腺肿瘤PD-P1检测中的应用邢杰，赵继开，丁闻洁，韩昱晨关键词:胸腺瘤;PDW/PD-L-;免疫组化双重染色中图分类号:R734.5文献标志码：B文章编号：008-7366（2222）10-1435-03doi:44.13315/j.c/di.cjcep.7020.10.226PDW/LD-CI通路已经在多种肿瘤中进行了广泛深入的研究，如黑色素瘤、结肠癌、肺癌、乳腺癌等，并且PDN/PD-L8表达可能与恶性肿瘤的临床病理特征或不良预后相关J T。
近年来国内外关于胸腺瘤PDN/PD-C-的研究较少，但均表明PD-CI表达与胸腺肿瘤（包括胸腺瘤和胸腺癌）的组织学类型、MasaWs分期以及疗效相关，并且能够提示肿瘤的恶性程度及预后J「5。
常规PD-C8检测方法为免疫组化，但PD-C8在正常的胸腺上皮细胞及淋巴细胞中也有表达J-6,可能使得免疫组化染色结果判读困难，为解决这 一问题，作者尝试采用P/3+PDW-免疫组化双重染色法对胸腺肿瘤进行染色，由于p/3广泛表达于上皮源性肿瘤细胞胞核,p63+PD-C I免疫组化双重染色法能够更加清楚的判断胸腺源性上皮细胞的PD-C8阳性率。
1材料与方法14材料收集上海市胸科医院病理科存档的胸腺肿瘤手 术切除样本64例，其中B1、B2及B3型胸腺瘤各I5例，胸腺癌-5例，每例胸腺肿瘤连续切片3张，分别用于HE染色、PD-C8免疫组化染色、p63+PD-C I免疫组化双重染色。
14染色方法标本均经I0%中性福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋，免疫组化染色采用Mulbmer法，染色平台为Dabu Link48全自动免疫组化染色平台,一抗PD-CI（22C3,5 :50,Dako公司）、p63（-:300,上海长岛生物公司、，其他试剂均为Dako AuWstainr Link48全自动免疫组化染色平台专用试剂,购自安捷伦科技（上海）公司。
免疫组化和组织化学双重染色技术在组织芯片上的应用
免疫组化和组织化学双重染色技术在组织芯片上的应用
赵秀兰;张诗武;刘增辉;王欣;古强;孙保存
【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》
【年(卷),期】2004(020)004
【摘要】组织芯片是从组织块中挑选典型部位的组织以获得数百个圆柱状的样本，并按次序排列在一个新的石蜡块上，制作成HE切片，然后按研究的需要进行免疫组化及原位杂交等研究。
组织芯片技术最重要的特点是：一次可以同时对多个组织块检测研究而对原来的组织材料破坏很小。
此外，利用组织芯片仪还可以进行组织切片的精确定位和多种类型的分子生物学分析。
【总页数】2页(P483-484)
【作者】赵秀兰;张诗武;刘增辉;王欣;古强;孙保存
【作者单位】天津医科大学病理学教研室 300070;天津医科大学病理学教研室300070;天津医科大学病理学教研室 300070;天津医科大学病理学教研室 300070;天津医科大学病理学教研室 300070;天津医科大学病理学教研室 300070
【正文语种】中文
【中图分类】R446.8
【相关文献】
1.CD34与D2-40双重免疫组织化学染色技术在鉴别血管与淋巴管中的应用 [J], 盖文君;姚宏
2.弹力纤维染色与免疫组织化学双重染色技术在先天性心脏病肺动脉高压研究中的
应用 [J], 沈萍;郭林林;徐卓明
3.醋酸氨银染色法网状纤维染色与免疫组织化学双重染色技术 [J], 张晓波;姚海涛;卢凤美;孟庆媛
4.骨髓标本中免疫组织化学及DNA原位末端标记双重染色技术的应用 [J], 李晓;浦权
5.免疫组织化学和天狼猩红双重染色技术在病理诊断中的应用 [J], 刘亚敏;张诗武;魏焕萍
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免疫荧光双染
免疫荧光双染在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。
双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。
冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS 1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。
将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1 (TdT)和试剂2(dUTP)按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。
5、BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。
6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。
（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。
8、 DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。
去除PBS 后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
9、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
免疫组化双染技术在非小细胞肺癌中的应用
免疫组化双染实验结果对比直观，其诊断信息量比传统 单染高，尤其对于标本量少的组织更具有显著优势，给病理 医师带来了极大便利。随着免疫组化检测系统的发展，特别 是快捷型非生物素免疫组化检测放大系统的应用，其原理是 通过两种不同的显色剂在同一张切片上实现两种抗体的同
差异，但甲苯胺蓝染色试剂配制简单操作方便，染色时间仅 需 ２０ｓ～３ｍｉｎ，大大提高了染色效率，值得推广使用。在半 薄切片中，切片厚 ５００ｎｍ～１μｍ，甲苯胺蓝染色隐球菌轮廓 更清晰，可见细胞核结构和生芽增殖的孢子。新型隐球菌色 彩分明，容易 定 位，有 利 于 进 一 步 的 超 薄 切 片 和 电 镜 观 察。 此组病例新型隐球菌已通过电镜观察证实。
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网络出版时间：２０１９－７－３１５：５１ 网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０７３．Ｒ．２０１９０７０３．１５５０．０３２．ｈｔｍｌ
免疫组化双染技术在非小细胞肺癌中的应用
叶 敏，韩昱晨，项珍珍，徐波尔
关键词：肺肿瘤；非小细胞肺癌；双染技术；免疫组织化学 中图分类号：Ｒ３９２３３；Ｒ７３４２ 文献标志码：Ｂ 文章编号：１００１－７３９９（２０１９）０６－０７４１－０２ ｄｏｉ：１０．１３３１５／ｊ．ｃｎｋｉ．ｃｊｃｅｐ．２０１９．０６．０３２
·７４２·
临床与实验病理学杂志 ＪＣｌｉｎＥｘｐＰａｔｈｏｌ ２０１９Ｊｕｎ；３５（６）
①Ａ ②Ａ
①Ｂ ②Ｂ
肺癌中 ８０％为非小细胞肺癌，应用免疫组化双染技术 能进一步将其精准区分为肺腺癌、肺鳞癌、肺腺鳞癌具有重 要的诊断意义。病理诊断中常用的免疫组化标记区分肺癌 类型有 ＴＴＦ１、ＮａｐｓｉｎＡ、ｐ４０、ＣＫ５／６等，选择这四种特异性 较高的抗体来标记以及选择合适的显色系统，并且两组抗体 之间无交 叉 染 色，显 色 鲜 明，是 双 染 的 关 键。本 实 验 应 用 ＴＴＦ１和 ＣＫ５／６一组，ｐ４０和 ＮａｐｓｉｎＡ一组进行双染，ＴＴＦ １、ｐ４０选择过氧化物 酶 （ＨＲＰ）标 记 的 显 色 系 统，ＤＡＢ显 色， 细胞核呈棕 色；ＣＫ５／６、ＮａｐｓｉｎＡ选 择 碱 性 磷 酸 酶 （ＡＰ）Ｒｅｄ 显色，细胞质呈红色［３］。每组两种抗体不同的阳性定位和不 同颜色的表达，定位精确，对比明显［２］。此外，在一张组织切 片上能体现出两种不同抗原的类型，不仅可减少切片的需求 量，在诊断上更能直接和精确的区分肺癌的类型。此方法更 适合应用在标本量较少的组织和在组织学形态上难以区分 的病例。
多重荧光免疫组化技术的主要流程
多重荧光免疫组化技术的主要流程一、样品处理在进行多重荧光免疫组化实验前，首先需要处理样品。
对于细胞样品，可以通过离心、洗涤等步骤准备细胞悬液。
对于组织样品，需要进行固定、脱水、包埋等处理，以保持组织结构的完整性。
二、抗原解表抗原解表是多重荧光免疫组化实验的关键步骤之一。
通过将样品暴露在适当的条件下，如高温、酶解等，可以使细胞或组织中的抗原裸露出来，为后续的抗体结合提供条件。
三、抗体染色在多重荧光免疫组化实验中，需要使用多个抗体来检测不同的分子。
这些抗体通常是与特定荧光染料偶联的，以便在显微镜下观察到荧光信号。
在进行抗体染色前，需要对抗体进行充分的验证和优化，以确保其特异性和敏感性。
四、荧光显微镜观察在完成抗体染色后，需要使用荧光显微镜观察样品。
荧光显微镜可以通过激发荧光染料发出的荧光信号来获得高分辨率的图像。
通过调整显微镜的参数，如放大倍数、曝光时间等，可以获得清晰的荧光图像。
五、图像处理与分析在获得荧光图像后，需要进行图像处理和分析。
常见的图像处理软件可以用于调整图像的亮度、对比度、色彩平衡等，以提高图像的质量。
同时，可以使用图像分析软件对荧光信号进行定量分析，如计算荧光强度、定位分子的相对位置等。
六、结果解读根据实验结果进行结果解读。
多重荧光免疫组化技术可以同时检测多个分子的表达和定位情况，因此可以提供更全面的信息。
通过对荧光信号的定量分析和图像的解读，可以得出对样品中不同分子的表达和相互作用的结论。
在进行多重荧光免疫组化实验时，还需要注意以下几点：1.选择适当的抗体和荧光染料，确保其特异性和互补性；2.控制实验条件的一致性，如温度、时间等，以保证实验的可重复性；3.合理设计实验对照组，如阳性对照、阴性对照等，以验证实验结果的准确性；4.注意光线的干扰，避免荧光信号的混杂和干扰；5.合理选择荧光显微镜参数，以获取清晰的图像。
多重荧光免疫组化技术是一种强大的工具，可以同时检测多个分子的表达和定位情况。
免疫荧光双标染色法意义
免疫荧光双标染色法意义在生物医学研究领域，免疫荧光双标染色法是一项重要的实验技术。
该方法通过同时检测两种不同的标记物，帮助科研人员更深入地了解细胞或组织中的复杂生物过程。
本文将详细介绍免疫荧光双标染色法的意义及其在科研中的应用。
一、免疫荧光双标染色法简介免疫荧光双标染色法是一种基于荧光标记的免疫组化技术。
它通过特异性抗原与抗体结合，利用荧光染料标记的抗体来显示细胞或组织中的特定分子。
与传统的免疫组化染色方法相比，免疫荧光双标染色法具有更高的灵敏度和更广的适用范围。
二、免疫荧光双标染色法的意义1.同时检测两种不同的标记物免疫荧光双标染色法最大的优势在于可以同时检测两种不同的标记物。
这在研究细胞或组织中的复杂生物过程时具有重要意义。
例如，在研究肿瘤细胞与免疫细胞相互作用的过程中，可以同时检测肿瘤标志物和免疫细胞标志物，从而更深入地了解两者之间的关系。
2.精确定位细胞内分子免疫荧光双标染色法具有较高的空间分辨率，可以精确定位细胞内分子。
这有助于揭示细胞内分子之间的相互作用和信号传递路径，为疾病发病机制的研究提供有力支持。
3.提高实验效率免疫荧光双标染色法可以在同一实验中同时完成两种标记物的检测，大大提高了实验效率。
此外，该方法操作简便，实验周期较短，有利于科研人员快速获得实验结果。
4.适用于多种样本类型免疫荧光双标染色法适用于多种样本类型，如细胞爬片、组织切片、细胞悬液等。
这为科研人员提供了广泛的实验选择，有助于研究不同类型的生物样本。
5.可视化细胞动态过程通过免疫荧光双标染色法，可以实时观察细胞内分子的动态变化，如细胞迁移、细胞凋亡等。
这有助于揭示细胞在生理和病理过程中的重要作用。
三、免疫荧光双标染色法在科研中的应用免疫荧光双标染色法在生物医学研究中具有广泛的应用，如：1.肿瘤研究：通过检测肿瘤标志物和免疫细胞标志物，研究肿瘤微环境中的相互作用。
2.神经科学研究：揭示神经元之间的联系和信号传递机制。
免疫组织化学染色技术
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荧光素-抗体标记
❖ FITC-IgG（蛋白）
技术类型
❖ 直接染色法 ▪ 荧光素直接标记在特异性抗体（Ab1)
❖ 间接染色法 ▪ 荧光素标记第二抗体（Ab2) ▪ 第二抗体针对第一抗体种属特异性的表 位（如羊抗鼠Ig或羊抗人Ig）
直接法
❖ 优点 ▪ 简单 ▪ 特异
实例：细胞鉴定
❖ 免疫细胞及其亚群（流式细胞术） ▪ T细胞 • CD3+
荧光素
❖ 异硫氰酸荧光素（FITC）
黄绿色荧光
520-530 nm
490-495 nm
荧光素
❖ 四乙基罗丹明（RB200）
橘红色荧光
625 nm
540 nm
荧光素
❖藻红蛋白（PE）
488-561 nm
578 nm
荧光素
❖别藻蓝蛋白（Allophycocyanin, APC ）
660 nm
650 nm
免疫组织化学染色技术
李会强 医学检验学院
Email:lihuiqiang1965@
组织化学染色技术
❖ Histochemistry Technique
❖ 观察对象
▪ 组织、细胞
❖ 使用工具
形
态
▪ 普通显微镜
与 结
▪ 荧光显微镜
构
苏木素 曙红
免疫组织化学染色技术
❖ Immunohistochemistry Technique ▪ 指用标记的特异性抗体在组织细胞原位 通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反 应，对相应抗原（目的蛋白）进行定性、 定位、定量测定的一项免疫检测方法。
标本类型
❖ 组织标本 ▪ 冰冻切片 ▪ 石蜡切片（脱蜡和水化）
介绍一种PAS与免疫组化双重染色技术2
介绍一种P AS 与免疫组化双重染色技术陈水平,郑 伟,肖志芸关键词:胃肿瘤;免疫组织化学;双重染色中图分类号:R 73512;R 44618 文献标识码:B 文章编号:1001-7399(2006)04-0497-01收稿日期:2005-09-06 修回日期:2005-11-09作者单位:福建医科大学病理学系,福州 350004作者简介:陈水平(1970-),女,实验师 用过碘酸-无色品红法与免疫组化SP 法双重染色可同时显示胃肿瘤中癌细胞成分及组织中腺体所分泌的黏液成分,能更好的进行鉴别诊断。
1 材料与方法1.1 材料 胃癌标本26例,经10%福尔马林固定,常规脱水、透明、切片石蜡包埋,切片厚3～4μm 。
1.2 试剂 (1)015%过碘酸水溶液:过碘酸015g,蒸馏水加至100m l 。
(2)无色品红液:碱性品红1g,蒸馏水200m l,1mol/L 盐酸20m l,偏重亚硫酸115g,活性碳115g 。
(3)免疫组化试剂:一抗(鼠抗人)CK 、生物素标记的二抗与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及底物色素混合液(SP )试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。
1.3 方法 ,先按SP 法进行免疫组化染色。
(1)高温修复(柠檬酸)2m in,冷却,P BS 浸洗3m in ×3次。
(2)3%的H 2O 237℃孵育10m in,P BS 浸洗3m in ×3次。
(3)正常羊血清37℃孵育10m in 。
(4)滴加一抗37℃孵育60m in,P BS 浸洗5m in ×3次。
(5)滴加二抗37℃孵育10m in,P BS 浸洗5m in ×3次。
(6)滴加三抗37℃孵育10m in,P BS 浸洗5m in ×3次。
DAB 显色5～10m in,自来水冲洗3m in 。
接着按过碘酸-无色品红法染中性黏液:015%过碘酸水溶液氧化10m in,流水冲洗2m in,入无色品红液于暗处加盖作用10～20m in,流水冲洗2m in,May 2er 苏木精复染2m in,水洗,1%盐酸分化,流水冲洗10m in 。
多重免疫荧光染色技术
多重免疫荧光染色技术多重免疫荧光染色技术是一种非常有用的实验方法，可以同时检测多个靶标分子的表达情况，从而深入了解细胞功能和疾病发生机制。
这种技术的应用范围非常广泛，包括生物医学研究、临床诊断以及新药开发等领域。
多重免疫荧光染色技术的原理很简单，利用不同荧光染料的发光特性，将不同的抗体与相应的荧光标记结合，然后将这些染色抗体同时添加到待测样本中。
这些抗体会与其特定的靶标分子发生特异性结合，形成荧光标记的复合物。
随后，通过荧光显微镜观察样本中的荧光信号，就可以得到多个荧光信号的叠加图像。
通过对不同荧光信号的强度和位置分析，可以准确地判断靶标分子的表达情况和定位信息。
多重免疫荧光染色技术有许多重要的应用。
在细胞生物学研究中，科学家们可以同时检测细胞中多个蛋白质的表达情况，以便更好地理解细胞内各种分子之间的关系和相互作用。
此外，通过对细胞表面的免疫分子进行染色，可以帮助研究人员识别和分类不同类型的细胞。
这对于研究免疫系统、肿瘤学以及器官发育等方面的科学家来说尤为重要。
在临床诊断中，多重免疫荧光染色技术也发挥着重要作用。
医生们可以使用该技术对患者的生物标本进行分析，以确定是否存在特定的疾病标记物。
例如，通过同时检测多个免疫细胞表面标志物，可以提供关于免疫系统功能状况的重要信息，有助于疾病的诊断和治疗。
此外，多重免疫荧光染色技术还在新药开发中发挥着关键的作用。
药物的研发中经常需要检测药物对分子靶点的影响，以评估药物的疗效和安全性。
多重免疫荧光染色技术可以提供对多个靶标分子的检测和定量，有助于研究人员对药物的作用机制进行全面分析。
在实施多重免疫荧光染色技术时，有一些关键的步骤需要特别注意。
首先，合理选择荧光标记和抗体的组合，确保它们能够同时工作并清晰地识别目标分子。
其次，正确的固定和处理样本，以保持细胞或组织的完整性和形态结构。
最后，合理设置荧光显微镜系统的参数，以获得高质量的图像和准确的分析结果。
总之，多重免疫荧光染色技术在生物医学研究、临床诊断和新药开发等领域具有广泛的应用前景。
免疫组化EnVision二步法染色
石蜡切片免疫组化EnVision二步法染色第一组2组一、实验目的：1.掌握石蜡切片免疫组化EnVision二步法染色的原理、步骤及结果分析2.了解石蜡切片免疫组化EnVision二步法染色的临床应用二、实验原理：免疫组织化学技术是应用抗原与抗体接触后可形成“抗原－抗体复合物”的化学反应，以检测组织或细胞内抗原（或抗体）的技术。
EnVision二步法染色是通过一个葡聚糖分子，将多个抗小鼠或抗兔的二抗与多个辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）或碱性磷酸酶（AP)聚合在一起，形成一个免疫组化检测系统。
显色原理：将抗原抗体结合的部位显示出来。
常用ＤＡＢ（３’３－二氨基联苯胺）：阳性细胞染成棕黄色(ＨＲＰ显色剂)，苏木素复染，核淡兰色，显色反应稳定，不褪色，应用最广。
显色原理：酶－－催化剂Ｈ2Ｏ２－－底物ＤＡＢ－－供氢体反应原理：ＨＲＰ＋Ｈ2Ｏ２－－－－ＨＲＰ．Ｈ2Ｏ２ＤＡＢ↓(第一复合物)ＨＲＰ．Ｈ2Ｏ２－－－－ＨＲＰ＋Ｈ２Ｏ＋电子供体(氧化型)生成不溶于水和有机溶剂的有色终产物(棕褐色颗粒)和水，沉着在原来的位置上。
三、实验试剂与器材：试剂：二甲苯试剂，梯度乙醇（70%、80%、90%、100%、），蒸馏水，3%H2O2，柠檬酸盐缓冲液，PBS（磷酸盐缓冲液），鼠抗人CK，鼠抗人C-erbB-2，HRPanti-Mouse/Rabbit，DAB显色剂，苏木素试剂，1%盐酸乙醇，中性树胶，自来水器材：试剂缸、试剂瓶若干；载玻片及盖玻片若干；架子；石蜡切片；微波炉;37度恒温箱；显微镜四、实验地点：科技十楼，病理实验室五、实验时间：2011.12.21六、组员及分工：11120062申海涛，11120111黄冉冉，11120114谭辉，11120140谭丽，11120145张力，分别参与各步骤操作与计时。
七、记录人：黄冉冉八、实验步骤：1.二甲苯10minX 2 次2.梯度梯度乙醇水化，100%、90%、80%、70%由高到低每缸浸泡1min3.蒸馏水洗片刻4. 3%H2O2 去除内源性酶，室温10min5.蒸馏水洗3minX 2 次6.食管癌（CK）、乳腺癌（C-erbB-2）切片微波抗原修复（将切片放入柠檬酸盐缓冲液放入微波炉待煮沸后沸腾15min，室温冷却）7.蒸馏水洗3minX 2 次8.PBS洗3minX 2 次9.加鼠抗人CK（50微升）孵育1小时37°C，鼠抗人C-erbB-2（50微升）孵育1小时37°C10.PBS洗3minX 2 次11.（CK、C-erbB-2）：加HRPanti-Mouse/Rabbit孵育30min 37°C12.PBS洗3minX 2 次13.DAB显色（棕褐色），镜下控制；（镜下观察细胞膜染色即可冲洗）14.自来水冲洗5min15.苏木素复染，水洗16.1%盐酸乙醇分色2s，水洗17.梯度梯度乙醇脱水，70%、80%、90%、100%由低到高每缸浸泡2min18.切片风干后中性树胶封片九、实验结果与分析：食管癌CK：结果：低倍显微镜下观察染色阳性染色强，阳性颗粒定位性佳，组织结构清晰，除了出血部位和炎性区域有轻度背景外，多数组织片均无显著背景染色。
双重免疫荧光细胞化学标记方法
双重免疫荧光细胞化学标记方法双重免疫荧光细胞化学标记方法在同一细胞组织标本上需要同时检查两种抗原时要进行双重荧光染色。
一般均采用直接法，将两种荧光抗体(如抗A或抗B)以适当比例混合，加在标本上孵育后，按直接法洗去未结合的荧光抗体，抗A抗体用异硫氰酸荧光素（FITC）标记，发黄绿色荧光；抗B抗体用TM—RITC或RB200标记或PE标记，发红色荧光，可以明确显示两种抗原的定位。
在同一标本上有两种抗原需要同时显示(如A抗原和B抗原)，A抗原的抗体用FITC标记，B抗原的抗体用罗丹明标记，可采用以下染色方法：1．一步法双重染色方法先将两种标记抗体按适当比例混合(A+B)，按直接方法进行染色。
2．二步法双染色方法先用RB200标记的B抗体染色，不必洗去，再用FITC标记的A 抗体染色，按间接法进行。
结果：A抗原阳性荧光呈现绿色，B抗原阳性呈现橘红色荧光。
激光共聚焦扫描显微镜（laser confocal scanning microscope）用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。
由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。
系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。
调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。
激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量, 配合焦点稳定系统可以实现长时间活细胞动态观察。
主要用途：1．细胞及生物荧光样品观察分析。
2．绿荧光蛋白分析。
3．荧光原位杂交分析。
4．光切片扫描。
5．3D图像处理。
6. 时间序列拍摄成像.。
多重免疫组织化学染色
多重免疫组织化学染色
多重免疫组织化学染色是一种在一张切片或一个培养板孔中同时检测两种及以上的抗原的技术。
通过这种技术，可以显示这些抗原分子是否共存，以及它们之间的位置分布关系。
多重免疫组织化学染色的方法有多种，其中最常用的是荧光多重标记。
这种方法的操作相对简单，可用于超高分辨率成像，因而深受欢迎。
酶显色多重标记虽然反差更强且更耐保存，但使用率较低，主要原因是操作要求更高，新手需要练习才能做出美观的图像。
此外，多重荧光免疫组化技术（Multiplex immunohistochemical，mIHC）也称作酪氨酸信号放大（Tyramide dignal amplification，TSA）技术，是一类利用辣根过氧化酶（Horseradish Peroxidase,HRP）对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法。
该方法基于酪胺信号放大的多重顺次免疫染色技术，允许同时检测单个细胞或组织样本上的多个目标靶点，全面研究细胞组成、细胞功能和细胞间相互作用。
以上内容仅供参考，建议查阅相关论文获取更准确的信息。
免疫组化-双重染色
免疫组化双重染色方法和步骤：在生物医学和临床研究实践中，经常需要检测两种不同物质是否在同一样品中共存或同一种细胞中共存，因此出现了免疫组织化学双重染色。
此方法有几种类型，包括免疫酶组织化学和免疫荧光细胞化学法结合;同一切片的再度染色法(先对第一种抗原染色，阳性部位拍照，再用酸处理使抗原抗体解离，继之，对第二种抗原染色、拍照);两种酶标抗体3又重染色(分别用辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶标记第二抗体.用间接法分别显示A和B抗原，如两种一抗来自同一种属，常有重叠染色);不同种属来源的抗体双重染色。
目前，最常用的是最后一种方法。
不同种属来源的抗体双重染色，两种抗体间无交又反应.特异性较高，即使细胞内抗原量很少也能检测。
但是，当两种抗原存在于同一部位而其中之一浓度较高，占绝对优势时将妨碍另一种抗原染色，此种情况应分别染色，首先染色含量较少的抗原，再显示含量丰富的抗原。
在该方法中应用最多的是把SABC法或SP法的实验流程重复两次，其中两种不同特异性抗体(可以是小鼠或大鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体的任何两个组合)，与一抗对应的不同种属生物素化二抗和两种不同显色系统。
即可将不同部位或相同部位的两种抗原显示出来。
该方法用于石蜡切片时应考虑所选择的两个抗体的修复方法应该一致或一个抗体的修复对另一个抗体的染色结果没有影响。
试剂配制：1、3％过氧化氢甲醇：30％H2O210ml＋纯甲醇90ml→充分混匀。
2、0.3％过氧化氢甲醇：30％H2O21ml＋纯甲醇99ml→充分混匀。
3、免疫组化专用PBS（pH7.2—7.6）：NaCl8.5g＋磷酸氢二钠（无水）2.8g＋磷酸二氢钠（无水）0.4g溶于双蒸水并定容至1000毫升。
然后测pH值使之在7.2—7.6。
如果用的是含水磷酸盐，应加上分子式中水的含量。
4、0.3％TritonX－100（聚乙二醇辛基苯基醚）：TritonX－100是一种非离子型表面活性剂（或称清洁剂），分子量为646.86（C34H62O11）。
2024年全自动免疫组化染色仪市场发展现状
2024年全自动免疫组化染色仪市场发展现状引言全自动免疫组化染色仪是一种现代化的医疗设备，广泛应用于医学和生物学领域。
本文将介绍全自动免疫组化染色仪市场的发展现状，并分析其趋势及未来前景。
市场概况全自动免疫组化染色仪市场是一个快速发展的市场，随着人们对于医疗质量的要求不断提高，对于免疫组化染色技术的需求也日益增加。
免疫组化染色技术是一种检测组织样本中特定蛋白质表达的方法，广泛应用于肿瘤病理学、疾病诊断和药物研发等领域。
发展趋势全自动免疫组化染色仪市场的发展趋势主要体现在以下几个方面：技术创新随着科学技术的不断进步，全自动免疫组化染色仪的技术也在不断创新。
目前市场上已经出现了一些具有高分辨率、高灵敏度和高自动化程度的全自动免疫组化染色仪，可以实现对组织样本中蛋白质表达的快速、准确检测。
市场竞争全自动免疫组化染色仪市场竞争激烈，主要竞争者包括韩国的Roche，美国的Ventana Medical Systems，日本的横河电机等。
这些公司在技术研发、产品创新和市场推广方面都具有一定的竞争优势，不断推动市场发展。
医疗需求增加随着人口老龄化和疾病发病率的增加，对于免疫组化染色技术的需求也在不断增加。
全自动免疫组化染色仪作为一种快速、准确的检测手段，可以帮助医生更好地进行疾病诊断和治疗，因此受到了医疗机构的广泛关注和采购。
市场前景全自动免疫组化染色仪市场具有广阔的发展前景。
随着医疗领域对于高质量检测技术的需求不断增加，免疫组化染色技术将得到更广泛的应用。
全自动免疫组化染色仪作为一种关键设备，将在未来的市场竞争中占据重要地位。
此外，全自动免疫组化染色仪市场还存在一些挑战和机遇，例如： - 技术标准的制定与统一，使全自动免疫组化染色仪的检测结果更加准确可靠；- 市场竞争的加剧，推动产品的不断创新和升级； - 国内外市场的开拓和拓展，增强全自动免疫组化染色仪产品的国际市场竞争力。
结论全自动免疫组化染色仪市场在不断创新和竞争中快速发展，广泛应用于医学和生物学领域。
多重免疫组化和多重免疫荧光
多重免疫组化和多重免疫荧光1. 引言嘿，大家好！今天咱们聊聊两个在生物医学领域特别炙手可热的工具：多重免疫组化和多重免疫荧光。
听上去是不是有点儿像天文物理学的术语？其实，它们就是帮我们研究细胞和组织中的各种小秘密的高科技神器。
想象一下，你在翻开一本厚重的图鉴，每一页都藏着细胞的秘密，这些工具就像是你的小侦探，让你能看到那些你平时看不到的细节。
来，坐下来，咱们一起揭开这些神秘的面纱，看看它们是如何让科学研究变得既有趣又精彩的。
2. 多重免疫组化（IHC）2.1 什么是多重免疫组化？说到多重免疫组化，首先得弄明白啥是免疫组化。
免疫组化就像是给细胞穿上了“特定的衣服”，这些衣服是用来标记细胞中某些特定的蛋白质的。
好比你在一群人中找特定的朋友，你可以让他穿上你指定的颜色，这样你一眼就能找出来。
多重免疫组化就是在这基础上，把这种“标记衣服”升级为多套不同的颜色，能同时标记几种不同的蛋白质。
这就像你在一场大派对上，能够一下子识别出穿着不同颜色衣服的所有朋友，一下子就能知道他们的“身份”。
2.2 它怎么操作？在操作上，首先你得准备好一块组织切片，把它“煮”一遍，放进含有抗体的溶液中。
这些抗体就像是各式各样的小侦探，能识别并结合到你感兴趣的蛋白质上。
接着，再加入染色剂，它们会给这些抗体着色，使它们在显微镜下变得亮眼可见。
于是，你就能通过这些颜色，清晰地看到组织中不同蛋白质的位置了。
简单来说，就是把一个复杂的组织样本变成了一个五彩斑斓的地图，让你一目了然。
3. 多重免疫荧光（IF）3.1 多重免疫荧光的原理说到多重免疫荧光，这玩意儿和多重免疫组化有点儿相似，但又有它自己的独门绝技。
荧光是那种在黑暗中能发光的神奇物质，就像夜晚的萤火虫一样美丽。
通过给组织中的特定蛋白质标记上不同颜色的荧光染料，咱们可以在荧光显微镜下看到这些蛋白质的位置和分布。
而且这玩意儿能同时使用多种荧光标记，这样你就可以一睹多种蛋白质的“风采”了。
多重荧光免疫组化方法
多重荧光免疫组化方法多重荧光免疫组化方法（multiplex fluorescence immunohistochemistry）是一种应用免疫学和组织学原理的技术。
其主要思想是利用荧光染料对蛋白质在组织切片中的表达进行定量和定位的分析。
通常，多重荧光免疫组化技术可以同时检测多个标志物的存在和活性，从而为高通量的药物筛选、诊断和治疗提供了新的方法。
多重荧光免疫组化技术的应用范围非常广泛。
其中，肿瘤诊断是其主要应用领域之一。
该技术可以同时检测多个与癌症相关的蛋白质标志物在组织中的表达和定位，从而为早期和晚期癌症的诊断提供基础。
此外，该技术还可以用于药物研发和治疗。
通过快速、高效地分析药物影响的多个靶标，该技术可以加速新药开发过程并改善治疗策略。
多重荧光免疫组化技术的实现需要多种设备和试剂。
首先需要采集包含感兴趣蛋白质的组织样本，并经过固定、切片和染色等步骤处理。
然后，对标记物进行特定抗体或标志物的选择，并根据需要进行激光光谱分析，确定荧光染料的激发和发射波长。
最后，通过显微镜或成像系统观察、记录和分析图像。
因此，该技术需要较高水平的技术专长和设备支持，且数据处理较为复杂。
总之，多重荧光免疫组化技术是一种有效的细胞及组织分析方法，可以同时检测多个蛋白质标志物的表达和定位。
该技术有广泛的应用前景，包括肿瘤诊断、药物研发和治疗。
然而，其实现需要较高水平的技术专长和设备支持，数据处理较为复杂。
未来，多重荧光免疫组化技术将继续向高通量和高精度方向进行发展，并为多种领域提供更具协同性和可预测性的分析方法。
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大鼠垂体前叶GnRH相关肽阳性细胞(左, 蓝色)与促性腺激素细胞 (右, 棕色)为同一种细胞, 免疫酶(PAP法)双重染色.
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B. 双酶法: 1. 原理: a. 用两种无关的酶分别标记显示两种抗原, 常用的酶为HRP 和AKP, 或HRP和葡萄糖氧化酶. b. 两种一抗来源于不同种属的动物, 如兔和小鼠, 或同种动 物(如小鼠)的两种单克隆抗体, 但其Ig亚类不同, 如IgGl和 IgG2a. c. 两种二抗分别是抗兔IgG和抗小鼠IgG, 或抗小鼠IgGl和抗 小鼠IgG2a. 可以来自同种属动物或不同种属动物, 可以是 酶标抗体(一个用HRP, 另一个用AKP标记), 也可以是未标记 抗体(一个用兔PAP, 另一个用小鼠APAAP).
免疫荧光双重染色法: FITC绿色, TRITC红色, 混合色为黄色.
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B. 间接法: 1. 两种一抗不标记, 但来自 不同种属的动物如兔和豚鼠. 2. 两种来源于同种动物或不 同种动物的二抗(如羊抗兔 IgG和羊抗豚鼠IgG, 或羊抗 兔IgG和猪抗豚鼠IgG)分别以FITC和TRITC标记. 3. 染色程序: a. 先用第一种一抗和相应的标记二抗依次孵育切片, 显示第 一种抗原; 然后再用第二种一抗和相应的标记二抗依次孵育 切片, 显示第二种抗原. b. 将两种一抗混合后孵育切片, 再将两种标记的二抗混合后 孵育切片, 最后用荧光显微镜观察.
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c. 可避免抗体残留而引起的假性双标记, 不需中间洗脱处理. 由 于无交叉反应, 可将两重染色的同一层抗体混合同时使用并先 后显示两种酶的活性, 在同一张切片上获得不同颜色的反应终 产物, 如棕色和蓝色. 如两种抗原共存于同一个细胞, 则出现灰 紫色的混合色.
第一次用ABC法, 氧化法洗脱抗体. 对照试验证实此为假性双标.
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6. 具体操作步骤: a. 方法1: 第一次染色后, 除去抗体和酶而使有色反应终产 物留在抗原部位, 再用同样方法进行第二次染色. *. 切片处理, 抑制内源性酶及正常血清封闭同前. *. 用PAP法完成第一次染色, CN-H2O2显色. TBS洗两次, 每 次5~10分. *. 氧化法洗脱. TBS洗如上. *. 用PAP法完成第二次染色, 0.05%DAB-0.01%H2O2显色. TBS 洗如上. 甘油胶封片.
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一抗来自同种动物的单酶法免疫酶双重染色
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大鼠垂体前叶促性腺激素细胞(蓝色)和生长激素细胞(棕色), 免疫 酶(PAP法)双重染色.
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b. 方法2: 第一次染色后, 照相记录结果并记住照相视野的部 位. 用有机溶剂将反应终产物溶解除去, 并将第一次染色形成 的抗体复合物洗脱掉, 然后进行第二次染色. 对同一部位再一 次照相, 比较先后照相所得照片. *. 切片处理同上. *. 用PAP法完成第一次染色, CN-H2O2显色. TBS洗两次, 每次 5~10分. *. 以TBS封片, 照相(注意随时从盖片边缘补加TBS, 防止切片 干燥). *. 去盖片, TBS洗, 再用酒精-二甲苯-酒精处理, 除去CN蓝色反 应产物, DDH2O洗. *. 氧化法洗脱, 然后TBS洗两次如前. *. PAP法完成第2次染色, 0.05%DAB-0.01%H2O2或CN-H2O2显色. *. TBS洗同上, 封片. *. 找出第一次照相的部位, 再次照相.
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3. 观察: 同一个视野里. a. 对每一种荧光标记物(绿色或红色)使用不同的滤色板进行 观察和照相, 每张照片显示一种荧光, 比较两张照片. b. 两种荧光重叠照相, 则在一张照片上可发现分别含不同抗 原的细胞(呈绿色或红色), 如果两种抗原存在于同一个细胞 或结构, 则呈现两种红绿荧光的混合色, 如黄色.
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抗体, 酶和反应产物洗脱
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2. 染色的最佳条件: 先对两种待检抗原分别染色, 以决定合适的 抗体稀释度和反应条件等. 3. 双重染色的先后次序: a. 先显示含量较少的抗原. b. 先显示容易受染色过程和洗脱过程影响的组织抗原. c. 先用不太敏感的抗体. d. 先用DAB显色. 4. 对照试验: a. 单染对照. b. 在进行第二次染色前, 要证明第一次染色的各级抗体和酶活 性被完全除去, 而且洗脱后对第二个待检抗原无影响.
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5. 抗体洗脱: a. 酸洗法: pH2.2甘氨酸-HCl缓冲 液(可加入适量二甲基甲酰胺, DMF)1~4小时使抗原-抗体复合物 解离. b. 氧化法: 2.5% KMnO4: 5% H2SO4: DDH2O=1:4:10~260, 1分, 氧化除去 抗体, 0.5% Na2S2O5漂白液脱色. 第一次染色用CN显色, 并注意对 第二种抗原的影响. c. 甲醛蒸气法: 1升容器+3g多聚 甲醛+切片, 置80℃烤箱1~4小时, 蒸汽破坏抗体的Ig结合部位.
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三. 免疫酶双重染色 A. 单酶法: 1. 原理: a. 用一种酶如 HRP标记显示两种不同的抗原, 但用不同的 电子供体如 DAB和CN呈现不同颜色的反应终产物. b. 两种一抗来自同种属动物, 两重染色之间需将第一次 染色反应中的各级抗体和酶或各级抗体, 酶和反应产物 从组织上洗脱. c. 连续做两次染色, 所红色, 混合色为黄色.
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Y.W Lin. USP26 stained by Alexa Fluor 488 and Myc stained by Alexa Fluor 594 in COS7 cells. Nuclei were stained by Hoechst blue
免疫组化双重染色技术
二. 免疫荧光双重染色法: 用不同的荧光色素标记不同的抗 体, 染色后观察, 相应的抗原物质显示不同的颜色. A. 直接法: 1. 一步法: 将FITC (490~495→520~530nm, 黄绿色荧光)和TRITC (550→620nm, 红色荧光)分别标记的两种抗体按一定比例混 合, 使每个抗体均为最适稀释度, 然后孵育切片. 2. 二步法: 先后依次使用两种荧光抗体分别孵育切片.