用呼吸缺陷型酵母催化4-氯-3-羰基丁酸乙酯的不对称还原

用呼吸缺陷型酵母催化4-氯-3-羰基丁酸乙酯的不对称还原倪宏亮，姚善泾*(浙江大学化学工程与生物工程学系，浙江杭州 310027)摘要：通过紫外诱变，经2，3，5-氯化三苯四氯唑平板和非发酵型碳源培养基鉴定，得到6株面包酵母的呼吸缺陷型变异株。

考察了6株呼吸缺陷型酵母催化4-氯-3-羰基丁酸乙酯的不对称还原反应，分别测定了其中3株呼吸缺陷型酵母的线粒体复合体Ⅰ、Ⅰ+ Ⅲ、Ⅱ+ Ⅲ和Ⅳ的活性。

结果表明，4-氯-3-羰基丁酸乙酯的转化率在49~75%之间，产物收率在31~69%之间，对映体过量值最高可达72%，比正常酵母的54%提高了18%；3株突变株线粒体内复合体I-Ⅳ的活性与正常酵母相比都有不同程度的下降。

关键词：呼吸缺陷型；面包酵母；不对称还原；线粒体复合体；紫外诱变；4-氯-3-羰基丁酸乙酯Asymmetric Reduction of Ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate with Respiratory-Deficient Mutants of Baker’s YeastNI Hongliang, YAO Shanjing(Department of Chemical and Biochemical Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, Zhejiang,China)Abstract：Six respiratory deficient (RD) mutants of baker's yeast were induced with ultraviolet radiation, which were identified by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride plate and carbon sources without sugar. The characteristics of asymmetric reduction of ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate catalysed by six RD mutants were studied. And activities of four complexes, Ⅰ, Ⅰ+Ⅲ, Ⅱ+Ⅲ and Ⅳ, in electron transfer chain of three RD mutants were detected separately. The results showed that the conversions of ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate catalyzed by RD mutants were among 49%~75%, and yields were among 31%~68%, while enantiomeric excess (e.e.) of RD mutants increased to 72%, which was 18% higher than thatof natural baker's yeast. The activities of 4 complexes in RD mutants were all lower than in normal yeast.Key words:Respiratory deficient; Baker’s yeast;Asymmetric reduction; Mitochondria complex; Ultraviolet mutagenesis; Ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate1. 引言为了改变酵母催化不对称还原反应的立体选择性和催化速率不高[1]的状况，必须深入了解酵母内部的酶系构成和对酵母进行改造已十分必要，其中呼吸缺陷型酵母是一种比较好的选择。

呼吸缺陷型酵母指在酵母线粒体膜上组成呼吸链的*收稿日期：2007-11-5. 第一作者：倪宏亮，男，博士研究生；联系人：姚善泾. Tel: (0571)87951982; Fax: (0571)87951015; E-mail: yaosj@.基金项目：高等学校博士点学科专项科研基金(No：20050335131)资助 细胞色素c，a，b等蛋白质基因缺失突变，导致线粒体膜结构不完整和菌体氧化磷酸化功能缺失[2, 3]。

在刘立明等人的工作中，发现由于呼吸缺陷型光滑球拟酵母电子传递链的受阻，在糖酵解过程中产生的NADH会累积[9]，若将呼吸缺陷型酵母用于不对称还原反应，有可能加快氧化还原反应的进行。

在厌氧条件下，呼吸缺陷型酵母只能利用发酵型碳源生长[4]，其糖酵解酶系和醇脱氢酶系的活性很高，利用它可增加酒精产量[5, 6]。

而醇脱氢酶系是不对称还原反应的重要酶系之一，因此利用呼吸缺陷型酵母或许可以提高其立体选择性。

目前尚未有以呼吸缺陷型酵母用于不对称还原的报道。

本文将以经过纯化的市售面包酵母，通过紫外诱变得到呼吸缺陷型酵母，考察呼吸缺陷型酵母在催化4-氯-3-羰基丁酸乙酯不对称还原反应中的特性，为进一步研究酵母的不对称还原机理做一些探索性工作。

2.实验部分2.1 培养基配方YEPD培养基：酵母提取物（购自Oxiod公司） 10 g/L，蛋白胨 20 g/L，葡萄糖 20 g/L，pH7.0。

发酵型碳源培养基[7]：酵母提取物 3.0 g/L，蛋白胨 3.5 g/L，KH2PO4 2.0 g/L，MgSO4•7H2O 1.0 g/L，(NH4)2SO4 1.0 g/L，葡萄糖 20 g/L，pH5.5。

非发酵型碳源培养基[7]：1 %乳酸盐（替代葡萄糖），其他组成与发酵型培养基相同。

鉴别上层培养基[4, 8]：葡萄糖 5 g/L，2，3，5-氯化三苯四氯唑（triphenyl tetrazolium chloride，TTC，购自华东师范大学化工厂） 0.5 g/L，琼脂 1.0%（m/v）。

2.2 紫外诱变呼吸缺陷型酵母的方法将纯化后的面包酵母(Baker’s yeast, Saccharomyces cerevisiae, 购自广东梅山-马利酵母公司，浙江大学生物工程研究所纯化保藏）在YEPD培养基中培养24 h，稀释至106倍，涂布于琼脂平板上，在35 w紫外灯下40 cm处，分别照射不同的时间；照射过的平板以锡箔纸包裹避光以防止光复活，置于30 o C恒温箱培养，待长出菌落后鉴定。

2.3 呼吸缺陷型面包酵母的鉴定在长出白色菌落的平板上，倒入鉴别上层培养基，30 o C恒温培养2-3 h，正常酵母菌落变成红色，呼吸缺陷型酵母仍为白色。

可初步确定白色菌落为呼吸缺陷型酵母，再分别接种到发酵型碳源培养基和非发酵碳源培养基中进一步鉴定。

在发酵型碳源培养基中生长而在非发酵碳源培养基中不生长的，则可以确定为呼吸缺陷型酵母（respiratory-deficient yeast ， RD yeast ），分别命名为RD-1~6。

2.4 酵母线粒体内复合酶活性的测定[9-11]酵母细胞线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ、Ⅰ+ Ⅲ、Ⅱ+ Ⅲ的测定：在30 o C 下按表1[9]所示条件进行，用酶在单位时间内的反应速率来表征酶复合体的活性。

表1. 线粒体复合酶活性检测方法aComplexpH 7.43mmol/L0.1mol/L3 6 10mmol/LC 0.1mmol/LH 2OOther conditionsⅠb 1.5 — 0.05 0.3 0.1 0.450.1 mol/L NADH0.3 mlⅠ+Ⅲc 1.5 0.3 0.05 — 0.4 —0.1 mol/L NADH0.3 mlⅡ+Ⅲd1.5 0.3 0.05 —0.4 —0.01 mol/L succinicacid 6μlaAll units shown in the table is ml. All experiments start with adding 0.3 ml mitochondrial suspension.； b Assay was monitored at 340 nm ；. c&d Measurement was done at 550 nm.eⅠ,Ⅰ+ Ⅲ, Ⅱ+ Ⅲ standed for different complexes in mitochondrial复合体Ⅳ测定：在1 ml 石英比色皿中加入0.1 mol/L ，pH 6.0的磷酸钾缓冲液0.25 ml ，0.1 m mol/L 还原型Cyt c 0.4 ml ，用可见光-紫外分光光度计Ultrospec ® 3300 pro （购自Amersham 公司）在550 nm 波长下连续监测1 min 至吸光值稳定后，加入线粒体悬浮液30μl 作为起动剂，在550 nm 与565 nm 波长处监测5 min ，每隔1 min 记录在两个波长下的吸光值。

3. 结果与讨论3.1呼吸缺陷型酵母的生长曲线利用分光光度仪测定在发酵型碳源培养基中不同酵母在600 nm 下透光率随时间变化的曲线，可以了解呼吸缺陷型酵母与正常酵母在生长发酵方面的差别。

得到6株呼吸缺陷型酵母和正常酵母的生长曲线，结果如图1所示。

1020304050604812162024Culture Time,hO D 600图1 面包酵母和呼吸缺陷型酵母在发酵型培养基中的生长曲线（生长条件：170 r/min,30 o C ）由图1可见，呼吸缺陷型酵母的生长速率和生长密度明显低于正常酵母，在相同时间内其细胞的密度也比正常酵母的低，这是因为呼吸缺陷型酵母通过发酵产乙醇来维持酵母的代谢，有氧条件下每分子葡萄糖经糖酵解产生6或8个ATP ，小于通过氧化磷酸化过程产生的30个ATP ，导致胞内能量代谢放慢，所以突变株生长较慢，通过镜检发现，呼吸缺陷型酵母的菌落形态较小。

3.2呼吸缺陷型酵母催化不对称还原反应将6株呼吸缺陷型酵母和正常酵母分别用于羰基的不对称还原反应，反应的条件为[1]：25 ml PBS 缓冲液中，加入2.0 g 湿菌体，50mmol/L 4-氯-3-羰基丁酸乙酯（Ethyl 4-chloro-3-oxobutyrate ，COBE ，购自Acros 公司），0.5 g 葡萄糖，在30 o C ，170r/min 摇床中振荡反应。

反应的进程及结果如图2、3所示。

C o n v e r s i o n , %Reaction Time, h图2 呼吸缺陷型酵母催化COBE 的转化率反应条件：c 0 (COBE) = 50 mmol/L, pH = 7. 0, m(glucose)=0.5 g, T=30 o C, t = 3hy i e l d ,%Reaction Time, h图3 呼吸缺陷型酵母催化COBE 的收率反应条件：c 0 (COBE) = 50 mmol/L, pH = 7. 0, m(glucose)=0.5 g, T=30 o C, t = 3h在相同反应时间内，正常酵母催化COBE 的转化率可达到100%，而6株呼吸缺陷型酵母的转化率在49%~75%之间；正常酵母催化反应的收率在87%，而呼吸缺陷型酵母的收率在31%~69%之间，由图中可以看出，呼吸缺陷型酵母反应速度较慢。