等温扩增技术在食源性致病菌检测中的应用进展
基于荧光探针重组酶介导等温扩增技术快速检测食源性单增李斯特菌方法的建立
分析检测基于荧光探针重组酶介导等温扩增技术快速检测食源性单增李斯特菌方法的建立郭 瑞1,2，赵林萍1,2，韩小改1,2，郭 毅3，任宝红1,2*（1.国家市场监管重点实验室（食品安全快速检测与智慧监管技术），河南郑州 450003；2.郑州中道生物技术有限公司，河南郑州 450001；3.河南省食品和盐业检验技术研究院，河南郑州 450000）摘 要：目的：建立一种基于荧光探针重组酶介导等温核酸扩增（Recombinant Enzyme Mediated Isothermal Nucleic Acid Amplification，RAA）技术的快速检测食源性单增李斯特菌的方法。
方法：针对单增李斯特菌hlyA基因的保守序列设计特异性引物和探针，通过构建含hlyA靶基因片段的重组质粒和不同浓度单增李斯特菌核酸，评价其灵敏度；通过检测大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌等菌液核酸，评价其特异性。
结果：所建立的荧光RAA法可在39 ℃、20 min内完成样本核酸的检测。
采用所建立的方法对质粒和核酸进行检测，质粒最低检出限为1 copy/μL，菌液核酸最低检测限为103 CFU·mL-1，且与其他菌株核酸无交叉反应。
结论：成功建立了一种基于荧光RAA法的单增李斯特菌核酸检测方法，该方法具有特异性强和快速的特点，可用于疑似污染单增李斯特菌食品的快速检测。
关键词：单增李斯特菌；重组酶介导等温核酸扩增；hlyA；核酸检测Establishment of a Rapid Detection Method for Foodborne Listeria monocytogenes Using Fluorescence Probe Recombinant Enzyme Mediated Isothermal Amplification Technology GUO Rui1,2, ZHAO Linping1,2, HAN Xiaogai1,2, GUO Yi3, REN Baohong1,2*(1.State Key Laboratory of Market Regulation (Food Safety Rapid Testing and Smart Supervision Technology), Zhengzhou 450003, China; 2.Zhengzhou Zhongdao Biotechnology Co., Ltd., Zhengzhou 450001, China; 3.Henan Institute of Food and Salt Industry Inspection Technology, Zhengzhou 450000, China) Abstract: Objective: To establish a rapid detection method for foodborne Listeria monocytogenes based on fluorescence probe recombinant enzyme mediated isothermal nucleic acid amplification (RAA) technology. Method: Specific primers and probes were designed for the conserved sequence of the hlyA gene of Listeria monocytogenes. The sensitivity was evaluated by constructing recombinant plasmids containing hlyA target gene fragments and different concentrations of Listeria monocytogenes nucleic acid; evaluate the specificity of E. coli, Salmonella, Staphylococcus aureus, Vibrio parahaemolyticus and other bacterial fluids by detecting their nucleic acid levels. Result: The fluorescence RAA method established can complete the detection of sample nucleic acid within 39 ℃and 20 minutes. The established method is used to detect plasmids and nucleic acids, with a minimum detection limit of 1 copy/μL. The minimum detection limit for bacterial nucleic acid is 103 CFU·mL-1, and there is no cross reaction with other strains. Conclusion: A fluorescence RAA based nucleic acid detection method for Listeria monocytogenes has been successfully established. This method has strong specificity and is fast, and can be used for rapid detection of food suspected to be contaminated with Listeria monocytogenes.基金项目：国家市场监管重点实验室（食品安全快速检测与智慧监管技术）科研项目（ZDSYS202305）。
环介导等温扩增技术检测食源性致病菌的研究进展
ｇ ｅ ｎ ｗｉ ｔ ｈ ｈ ｉ ｇ ｈ ｅ ｉｃ ｆ ｉ ｅ ｎ ｃ ｙ，ｓ ｔ ｒ ｏ ｎｇ ｓ ｐ ｅ ｃ ｉ ｉｃ ｆ ｉ ｔ ｙ ａ ｎ ｄ ｓ ｉ ｍｐｌ ｅ ｏ ｐｅ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ．Ｔ ｈｅ ｐ ｒ ｉ ｎ ｃ ｉ ｐ ｌ ｅ，ｃ ｈ ａ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｓ ｔ ｉ ｃ ｓ ，ａ ｐｐ ｌ ｉ ｃ ａ — ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ ｐ ｒ ｏ ｓ ｐ ｅ ｃ ｔ ｗｅ ｒ ｅ ｒ ｅ ｖ ｉ ｅ ｗｅ ｄ ｉ ｎ ｔ ｈ ｉ ｓ ａ ｒ ｔ ｉ ｃ ｌ ｅ ．Ｉ ｔ ｐ ｒ ｏ ｖ ｉ ｄ ｅ ｄ ａ ｔ ｈ ｅ ｏ ｒ ｅ ｔ ｉ ｃ ａ ｌ ｂ ａ ｓ ｉ ｓ ｆ ｏ ｒ ｆ ｕ ｔｈ ｒ ｅ ｒ ｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ．
． ． ． 肉品安全与检测． ． ．
由凌≯ 业
ＭＥＡ Ｔ １ ＮＤＵＳ ＴＲＹ
２ ０ １ ４年 第 ５期 总第 ３ ９ ７期
环 介导 等 温 扩 增 技 术 检 测食 源性 致病 菌 的研 究 进 展
彭乃才 中山市技 师学院食 品化 工 系 广 东中山 ５ ２ ８ ４ ０ ３ 徐 明悦
１ 环 介 导 等 温 扩 增 技 术
测。对 Ｌ Ａ ＭＰ的原 理 、 特点 、 应 用及 展 望进 行 综 述 ， 为后续研究提供理论依据 。 ຫໍສະໝຸດ 关键词 环介 导等温扩增技 术
食源性致病菌 检测
Ｒｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ ｐ ｒ ｏ ｇ ｒ ｅ ｓ ｓ ｏ ｆ ｄｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｎｇ ｆ ｏ ｏ ｄ— —ｂ ｏｒ ｎｅ ｐａ ｔ ｈｏ ｇ ｅ ｎ ｂ ｙ ＬＡ Ｍ Ｐ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎｏ ｌ ｏ ｇ ｙ
数逐 年 递增 ； 世 界范 围内 ７ ０ ％ 的食 源性 疾 病 是致 病
环介导等温扩增技术在我国食源性致病菌检测中的应用
环介导等温扩增技术在我国食源性致病菌检测中的应用发表时间：2014-04-25T14:20:34.623Z 来源：《中外健康文摘》2013年第42期供稿作者：李铭新[导读] 2000年日本学者Notomi在杂志上公开了一种新的适用于基因诊断的恒温核酸扩增技术，即环介导等温扩增技术，简称LAMP。
李铭新（沈阳市苏家屯区疾病预防控制中心辽宁沈阳 110101）【关键词】环介导等温扩增食源性致病菌快速检测【中图分类号】RA 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085（2013）42-0049-022000年日本学者Notomi在杂志上公开了一种新的适用于基因诊断的恒温核酸扩增技术，即环介导等温扩增技术，简称LAMP。
LAMP 技术是在65℃恒温下进行核酸快速扩增，利用两条特异性内引物和两条特异性外引物识别靶基因上的六个区域，其DNA聚合酶具有链置换活性，几十分钟即可完成核酸扩增。
该技术要求的设备简单、操作方便、肉眼即可判断结果，且所需时间短、特异性好、灵敏度高，适合基层普及推广，因此受到了世卫组织WHO、各国学者和相关政府部门的关注，国外LAMP技术已广泛应用各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测、食品化妆品安全检查及进出口快速诊断中。
1 LAMP技术的特点LAMP反应不需要预先进行双链 DNA 的变性，恒温下即能实现扩增反应，没有因温度循环造成的时间损失。
LAMP扩增反应1 h内即可完成。
环引物的添加使得时间更缩短到原来的1/2，20 ～30 min 即有扩增产物可被检测。
这对于快速诊断十分重要。
与传统PCR 相比，LAMP 能从低拷贝数样品中扩增出目的基因，检测率比传统PCR高出 1～2 个数量级，LAMP法和实时PCR敏感性相同，适用于低拷贝数样品的检测。
LAMP法中靶序列的 6 个区域与4条特异性引物均需匹配，否则核酸不能扩增，故特异性极高。
LAMP法扩增结果可用肉眼观察浊度或添加荧光染料观察颜色变化来判定，不需要对产物进行电泳，使结果可视化，操作更简单。
环介导等温扩增技术在食品安全检测领域的应用研究进展
环介导等温扩增技术在食品安全检测领域的应用研究进展范安妮;佘之蕴;张娟;周臣清;梁宇斌【摘要】环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近年发展起来的一种新型核酸检测技术其采用特异识别靶序列上6个位点的4条引物和一种具有链置换活性的DNA聚合酶,在等温条件下进行核酸扩增,与传统核酸检测技术(PCR法、实时荧光定量PCR法)相比,具有操作简单、特异性强、灵敏度高、可肉眼判读结果等优点核酸检测是食品安全检测技术的一个重要手段,本文综述了LAMP技术在食品微生物检测、转基因成分检测、过敏原成分检测和动物源性成分检测领域的应用研究进展,探讨了LAMP技术在食品检测领域的发展前景,以期为食品快速、高通量检测技术建立提供参考%loop-mediated isothermal amplification(LAMP) is a novel nucleic acid amplification method developed in recent years.The nucleic acid amplification is performed ender isothermal conditions by a set of four specially designed primers and a DNA polymerase with strand displacement pared with the traditional nucleic acid detection technology (PCR and real-time fluorescence quantitative PCR),it has the advantages of easy operation,high specificity,sensitivity and visual interpretation.Nucleic acid detectiou is an important means of food safety detection.This review summarized the application research progresses mainly focused on food safety detection,including food microorganisms testing,genetically modified organisms testing,food allergens testing and food derived ingredients testing.In addition,the perspectives of LAMP in food detectiou were discussed for better and high volume testing in food safety detection.【期刊名称】《食品工业科技》【年(卷),期】2018(039)010【总页数】5页(P330-334)【关键词】环介导等温扩增技术(LAMP);食品安全;检测;核酸扩增【作者】范安妮;佘之蕴;张娟;周臣清;梁宇斌【作者单位】广东产品质量监督检验研究院,广东顺德528300;广东产品质量监督检验研究院,广东顺德528300;广东产品质量监督检验研究院,广东顺德528300;广东产品质量监督检验研究院,广东顺德528300;广东产品质量监督检验研究院,广东顺德528300【正文语种】中文【中图分类】TS207.3核酸扩增是分子生物学研究领域的一项重要技术,目前已广泛应用于医学诊断、食品检测、动植物检验检疫等行业中。
环介导等温核酸扩增技术快速检测食源性致病菌应用进展
１／２—１／３。直接靠扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊度 进行判断是否发生反应。ＬＡＭＰ技术具有高特异性、 高效率和便捷等特点１４１。 １．２引物设计ＬＡＭＰ引物的设计比常规ＰＣＲ要 复杂。一个反应至少包括４条引物，包括一对内引物 （ＦＩＰ和ＢＩＰ）和一对外引物（Ｆ３和Ｂ３）；外部引物限 定了扩增片段的大小范围，同时也为内部引物提供 了模板，如果再增加一对环引物（１００ｐ ｐｒｉｍｅｒ），会明 显加快等温扩增的速度，大大提高检测效率，检测率 比没有加环引物的高７个数量级１５，６１。国外已建立
６１
要的食源性致病菌，感染导致肠炎疾病，发病率呈逐 年上升趋势。副溶血性弧菌致病因子是其携带的ｔｄｈ 和ｔｄｌ编码毒力基因，采用常规检测方法无法解决风 险监测和评估。徐芊等“７首次报道了利用ＬＡＭＰ技 术检测副溶血性弧菌，针对副溶血性弧菌不耐热溶 血素基因（ｔｌＩＩ）设计４条特异引物进行ＬＡＭＰ扩增， 对扩增反应进行优化，最佳反应时间为６０ｍｉｎ，反应 温度为６０℃，特异性为１００％，且副溶血性弧菌基因 组ＤＮＡ和纯培养物的检测灵敏度分别为９０ｆｇ和 ２４ｃｆｕ／ｍＬ，对模拟样品检测，检测限为８９ｃｆｕ／ｇ，整个 过程ｌ小时能完成检测。 ２．５阪崎肠杆菌检测２００２年国际食品微生物标 准化委员会（ＩＣＭＳＦ）把阪崎肠杆菌列为“严重危害 特定人群，危害生命或慢性实质性后遗症或长期影 响”致病菌［１８１，该菌能引起严重的新生儿脑膜炎、菌 血症和坏死性小肠结肠炎，并可能遗留严重的神经 系统后遗症，死亡率２０％一５０％Ｉｔ９ Ｊｏ贺楠等∞参照 阪崎肠杆菌标准株（ＡＴＣＣ５１３２９）１６ＳｒＲＮＡ基因设计 ４条特异性引物。方法最低检测限可达到 ０．３ｐｇＤＮＡ，当稀释度１０５时才检测不到扩增产物，而 ＰＣＲ方法稀释度１０２时就检测不到扩增物。而胡莲 霞ｍ１则以１６Ｓ。２３Ｓ ｒＲＮＡ间区序列作为靶序列，采 用带有２条环引物（ＬＦ和ＬＢ）的改良ＬＡＭＰ方法检 测婴儿配方奶粉中的阪崎肠杆菌，灵敏度为 ０．１０１ｃｆｕ／ｍＬ，人工污染阪崎肠杆菌的婴儿配方奶粉 的检出限为１．１ｅｆｕ／ｇ，而对照ＰＣＲ方法检测阪崎肠 杆菌的灵敏度为１０１ｃｆｕ／ｍＬ，人工污染阪崎肠杆菌的 婴儿配方奶粉的检出限为１ １００ ｃｆｕ／ｇ，改良ＬＡＭＰ 方法比较ＰＣＲ方法，其灵敏度提高了ｌ ０００倍，检测 耗时仅为ｌ～３ｈ。 ２．６金黄色葡萄球菌检测 金黄色葡萄球菌是一 种常见的致病菌，导致感染性疾病是其产生的肠毒 素造成的，且耐药性金黄色葡萄球越来越广泛。申 建维等勉荆用多重ＬＡＭＰ法同时扩增金黄色葡萄球 菌耐药基因ｍｅｃＡ和ｆｅｍＡ，在反应过程中，两种分子 信标荧光探针分别与ｍｅｃＡ和ｆｅｍＡ基因的扩增产物 序列互补结合，最后检测反应管中的两种荧光值。 结果显示该方法的检测下限为１０ｃｆｕ／ｍＬ，与传统的 Ｍ２Ｈ培养基苯唑西林药敏实验结果比较，灵敏度为 ９９．９％，特异度为９０．９％。适用于直接快速检测临 床标本中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。 ２．７单核细胞增生李斯特氏菌单核细胞增生李 斯特氏菌是一种能够引起人畜共患疾病的食源性致 病菌，ＷＨＯ已将其列为２０世纪９０年代食品中四大
环介导等温扩增技术在食源性沙门氏菌检测中的应用研究进展
环介导等温扩增技术在食源性沙门氏菌检测中的应用研究进展作者：魏桢元来源：《江苏农业科学》2020年第03期摘要：沙门氏菌是世界上最常见的食源性致病菌之一，全球每年沙门氏菌中毒事件居细菌性中毒事件首位。
环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种新型的核酸恒温扩增方法。
2005年首次报道了采用LAMP技术快速检测沙门氏菌的研究，在随后的十几年中，LAMP技术不断优化完善，并广泛应用于食品沙门氏菌的现场检测。
本综述阐述LAMP的技术原理和特点，归纳基于LAMP技术的不同平台在沙门氏菌快速检测中的应用，同时对LAMP技术假阳性率高的问题进行了探讨，并对LAMP技术的发展方向和研究趋势提出了几个设想。
关键词：环介导等温扩增技术;沙门氏菌;食源性致病菌;现场检测;研究进展中图分类号：TS207.4 ;文献标志码：A ;文章编号：1002-1302（2020）03-0080-06沙门氏菌是需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性菌，属于肠杆菌科。
非伤寒沙门氏菌对人体健康的影响很大。
据WHO食源性疾病监控计划统计，非伤寒沙门氏菌导致9 380万人感染，其中通过食源性导致8 030万人感染，每年有15.5万人因此而丧生[1]。
沙门氏菌感染对全球造成巨大的经济损失和负担。
在2010年美国由沙门氏菌感染导致的医疗成本、人员工资损失、过早死亡的成本高达27亿美元，这并不包括相关产品召回、疾病防控以及不可估量的相关生产厂商及农产品的商誉损失[2]。
在中国，70%～80%细菌性食源性疾病是由沙门氏菌感染引起的，其中90%的食物是肉、奶、蛋等畜产品[3]。
已经鉴定出的肠炎沙门氏菌血清型超过 2 500 种，但大多数人体感染是由有限数量的血清型引起的[4]。
肠炎沙门氏菌是最常见沙门氏菌菌株之一，通常与鸡蛋、家禽及其产品的沙门氏菌病的爆发有关[5]。
在2016年全球食品致病菌测试量达到2.8亿份，市场价值超过180亿美元。
酶促恒温扩增技术(ERA)在食品安全检测领域的应用
酶促恒温扩增技术（ERA）在食品安全检测领域的应用随着全球经济的发展，进口贸易的增多，食品安全检测也日趋严格。
常用于食品安全检测的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)技术，是目前大部分检测机构及医学实验室都在使用的常规技术。
然而该技术需要昂贵且精密的控温设备，耗费较长时间，在现场检测中不具备优势，因此，我们需要更加简便的技术来提高检测效率。
等温核酸扩增技术的问世为现场快速检测带来新的曙光。
今天给大家介绍我们先达基因的酶促恒温扩增技术(ERA)。
本文对酶促恒温核酸扩增技术及其应用进行综述。
ERA 技术全称酶促恒温核酸扩增技术，是聚合酶链式反应(PCR)的一种替代品，也是一种全新的升级，可准确、快速、便携地进行核酸检测分析。
ERA 与PCR 扩增一样具有特异性，但速度快得多，结果通常在5～10 min 生成。
而且与PCR 不同的是，ERA 反应不需要热变性，因此不需要昂贵的热循环设备。
ERA对操作温度要求并不严格，反应在37～42℃的温度下工作最优，比其他等温扩增技术需要的温度要低，能在广泛的环境温度下工作。
ERA可以在多种应用中取代PCR，如传染病诊断、食品安全检测、水产畜牧疫病检测等等，它非常适合于现场、护理点和其他设备缺乏的环境，特别是对于检测速度需求较高的情况下。
一ERA 技术介绍1、反应原理酶促恒温扩增技术（ERA技术）是先达基因公司团队研发的具有全球自主知识产权等温核酸扩增技术，将来源于细菌，病毒和噬菌体的特定工具酶进行改造突变并筛选其功能，通过不同的核酸扩增反应体系进行优化组合，从而获得核心的酶促恒温扩增体系。
模拟生物体遗传物质自身扩增复制的原理，通过蛋白定向进化、DNA与核酶亲和力成熟等技术对重组酶、核酸内切酶、DNA聚合酶等多酶体系进行改造，建立ERA扩增反应体系，使之将单分子DNA/RNA的特异性区段在5-10分钟内扩增10^9倍。
2、引物设计ERA 引物设计原则：(1) 引物长度最长是35 bp，最好为29～32bp，过短会影响重组酶活性。
环介导等温扩增技术在食品检测中的应用
Ｆ Ｅ Ｎ Ｇ Ｔ ａ ｎ ｇ － ｋ ａ ｉ ， Ｊ Ｉ ＡＮ Ｇ Ｘｕ ｅ ， ＨＡＮ Ｗｅ ｎ — ｈ ｕ ａ
（ Ｔ ｈ ｅ Ｄ ｅ ｐ ａ ｒ ｔ ｍ ｅ ｎ ｔ ｏ ｆ Ｂ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ａ ｎ ｄ Ｃ ｈ ｅ ｍｉ ｓ ｔ ｒ ｙ ， Ｊ ｉ ｎ ｇ ｄ ｅ ｚ ｈ ｅ ｎ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｊ ｉ ｎ ｇ ｄ ｅ ｚ ｈ ｅ ｎ ３ ３ ３ ０ ０ ０ ， Ｊ ｉ ａ ｎ ｇ ｘ ｉ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
第３ ６卷第 １ ７期
环介导等温扩增技术在食品检测中的应用
冯唐锴 ， 江雪。 韩 文华 （ 景德镇学院 生物与化学工程系 ， 江西 景德镇 ３ ３ ３ ０ ０ ０ ）
摘 要： 环介 导等 温扩增技术是一种新兴的核 酸扩增技术 ， 被 广泛 用于生物特异性核酸片段 的检 测。该技术在食品
检 测 中扮 演着越 来越 重要 的角 色。 简介环介导等 温扩增技 术的基 本原理 ， 并对该技术在食品病原体检测和转基 因食
Ｆ ３ ｃ 和Ｂ ３ 为分别位于 Ｆ ２ ｃ 和Ｂ ２ 外侧长度为 １ ７ ｎ ｔ ￣ ２ ｌ ｎ ｔ
Ｂｌ ｃ
Ｂ２ｃ Ｂ３ ｃ
等技术 。 Ｌ Ａ ＭＰ 技术使 Ｄ Ｎ Ａ扩增 时间缩短 到 １ ｈ以 内， 且灵 敏度高 、 专 一性强 、 操作简便 ， 十分适合用 于食 品
环介导等温扩增技术在典型食源性致病菌检测中的应用进展
环介导等温扩增技术在典型食源性致病菌检测中的应用进展梁玉林;刘秀;丁梦璇;刘远远;尹建军
【期刊名称】《食品研究与开发》
【年(卷),期】2017(038)018
【摘要】环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是一种新颖的核酸恒温扩增方法.因其具有简单、快速、特异性强的特点,在国外已经成功应用于多个行业,并在其中发挥着越来越重要的作用.阐述LAMP技术在大肠杆菌O157、沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌4种食源性致病菌检测中的最新研究进展,将近年来针对4种细菌建立的LAMP方法中的靶基因、灵敏度和特异性进行汇总比较,对LAMP试验常见问题进行分析,展望其在中国食源性致病菌检测领域的研究和应用发展前景.
【总页数】6页(P219-224)
【作者】梁玉林;刘秀;丁梦璇;刘远远;尹建军
【作者单位】中国食品发酵工业研究院,北京100015;中国食品发酵工业研究院,北京100015;中国食品发酵工业研究院,北京100015;中国食品发酵工业研究院,北京100015;中国食品发酵工业研究院,北京100015
【正文语种】中文
【相关文献】
1.环介导等温扩增技术检测食源性致病菌的研究进展 [J], 彭乃才;徐明悦;卢可可
2.环介导等温扩增技术在肠杆菌科致病菌检测中的研究进展 [J], 何晓华;顿玉慧;卢力;李可;刘斌
3.环介导等温扩增技术及其在食源性吸虫感染检测中的应用 [J], 戴婷婷;周本江;王红
4.环介导等温扩增技术在致病菌检测中的应用 [J], 贺尔娜;蔡挺;张顺
5.环介导等温扩增技术在食源性沙门氏菌检测中的应用研究进展 [J], 魏桢元
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环介导等温扩增技术及其在病原微生物检测中的应用
环介导等温扩增技术及其在病原微生物检测中的应用循环介导温扩增技术（Cycling Primer Extension, CPE）是一种高效的分子生物学技术，主要用于基因、控制序列、表达调控物质和相关蛋白质之间的相互作用分析。
它常被应用于病原性微生物检测以及病毒基因分子变异分析等方面。
一、循环介导温扩增技术的原理循环介导温扩增技术是一种改良的PCR技术，它能将DNA模板扩增成上百万亿倍左右的数量，以满足分子生物学研究的需要。
该技术的基本原理是将待检测模板上特异性引物结合，并施加高温、低温及中间温度等三种温度环境，在低温下用引物扩增模板，并在特定温度中支配引物限制片段扩增，最后在v高温环境中扩增产物释放，从而通过三种温度环境积累构建双螺旋样的DNA桥梁而达到扩增的目的。
二、循环介导温扩增技术的优势（1）快速、灵敏：循环介导温扩增技术利用低温度和高温度振荡循环，大大提高了扩增速度，并且增强了信号效率，可以充分利用模板，进而提高检测灵敏度。
（2）省时省钱：循环介导温扩增技术使用到的耗材比PCR来得少，扩增速度更快，是一种省时省钱的技术。
（3）容易操作：CPE程序简单，操作过程相对PCR要简单，与实验室常规仪器一般可以完成，且实验室中的反应条件也相对简单，不存在PCR实验中的活性危险，也不存在贴壁细菌和操作技术考验棘手的问题。
三、循环介导温扩增技术在病原微生物检测中的应用（1）病毒检测：CPE技术可以快速灵敏地检测SARS-CoV-2病毒，从而帮助监测新型冠状病毒的传播趋势。
（2）细菌检测：CPE技术可以检测各种细菌产生的毒力因子，如真菌毒素和E. Coli有毒因子。
（3）NDM-1耐药基因及AMR的表型检测：NDM-1耐药基因和AMR 抗药菌的表型检测，可以快速确定环境中微生物的耐药基因断裂和AMR抗药菌表型，为后续的抗药策略的分析提供了依据。
四、总结循环介导温扩增技术灵活、方便，既可以用于病毒检测，也可以用于细菌检测，此外，它还可以用于耐药基因及抗药性表型的检测。
环介导等温核酸扩增技术快速检测食源性致病菌应用进展
灯下观 察可见梯 状条带 ，或直 接用焦磷 酸镁对扩增
产 物 沉 淀 通过 肉眼 进 行判 断 或 者 对其 浊 度 进 行检 测， 也可用荧 光染 料 Ｓ Ｂ ｒ ｎ 染 色 ， 紫外灯或 Ｙ ＲＧｅ Ｉ ｅ 在
约有 ２ ０ ５ 多种 ， 主要包 括致病 菌 、 病毒 和寄生虫导 致 的感染 性疾病 。据统计 ， 国 １９ ～２ ０ 年食源 性 我 ９２ ０ １
１２ ／ 。直接 靠扩增 副产物焦 磷酸镁沉 淀的浊度 ／ ～１３
进行判 断是否发 生反应 。Ｌ ＭＰ 术具有 高特异性 、 Ａ 技 高效率 和便捷等 特点 ¨ 。 】
１２ 引 物设 计 ．
Ａ Ｐ引物 的设 计 比常规 Ｐ Ｒ要 ＬＭ Ｃ
疾病 的主要危 害为微生 物 ， ３ ．％ ， 占 ８５ 以沙 门氏菌 、
副溶血 性弧菌 、变形杆菌 等为代 表引起 的感 染性疾 病患者是 化学污 染物引起 疾病 的 ２ 倍 】 ２０ 。自 ０２年 起 ， 国建 立 了国家食 源性病 菌监测 网络 ， 我 开展监测 食 品 中沙门氏菌 、 出血性 大肠 Ｏ１７ Ｈ 、 ５ ： ７ 副溶血 性弧 菌、 单核细胞增 生李斯 特 氏菌 、 阪崎 肠杆菌 、 黄色 金
显加快 等温扩增 的速度 ， 大提 高检测效 率 ， 大 检测率 比没有 加环 引物 的高 ７ 数量级 『 。国外 已建 立 个 ５ －
了 ＬＭ Ａ Ｐ引物设计 的在线 网站 （ｔ ：／ｐｉ ｒ ｐ ｒ ｈｔ ／ ｒ ｅ ｌ － ｐ ｍｅ ｘ ｏ
葡萄球菌 、 空肠弯曲菌 ７ 大类致病菌 ， 为食品安全和 风 险评估提供 了科学依 据 。但 目前食源 性致病 菌检 测仍 然 以传统 经典 的细 菌分离 、培养及 生化鉴定 为 主 ， 时长 ， 耗 操作 繁琐 ， 环境及 主观 因素影 响大 等 ； 受 生 化快 速鉴 定 方法 和 Ｐ Ｒ检 验等 不 仅需 要 价 格 昂 Ｃ
环介导等温扩增技术在病原微生物临床检测中的应用
㊃综 述㊃D O I :10.3969/j.i s s n .1672-9455.2024.07.031环介导等温扩增技术在病原微生物临床检测中的应用*廖 川1,梁丽娜1,黄少宇2,马梦霞3,李雪斌4综述,韦贵将1ә审校1.右江民族医学院附属医院医学检验中心/广西高校高发病临床分子诊断研究重点实验室/百色市高发病临床分子诊断与研发重点实验室,广西百色533000;2.广西壮族自治区田东县人民医院医学检验科,广西百色533000;3.右江民族医学院医学检验学院,广西百色533000;4.右江民族医学院附属医院神经内科,广西百色533000摘 要:病原微生物是威胁人类健康的重要因素之一,快速㊁准确的检测方法对于感染性疾病的诊断具有重要意义㊂环介导等温扩增(L AM P )是一种恒温扩增方法,具有反应时间短㊁操作简便㊁灵敏度高㊁特异度高㊁检测成本低等优点,因此被广泛应用于感染性疾病的快速诊断㊂基于这种情况,该文主要阐述了L AM P 的原理㊁特点及其在临床常见病原微生物检测方面的应用与研究进展㊂L AM P 技术现在已经被应用于病原微生物的检测,且具有较高的灵敏度及特异度,但该技术仍有易产生假阳性㊁引物设计复杂等不足之处㊂该文综述了近年来L AM P 技术在病原微生物感染中的应用与进展,并对其未来的发展前景进行了展望,以期在资源有限的环境中为病原微生物感染的快速诊断提供合理的研究方向㊂关键词:环介导等温扩增技术; 核酸检测; 病原微生物; 核酸扩增; 结核分枝杆菌中图法分类号:R 446.5文献标志码:A文章编号:1672-9455(2024)07-1003-06A p p l i c a t i o n o f l o o p -m e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n t e c h n i qu e i n p a t h o g e n i c m i c r o o r ga n i s m s c l i n i c a l d e t e c t i o n *L I A O C h u a n 1,L I A N G L i n a 1,HU A N G S h a o y u 2,MA M e n g x i a 3,L I X u e b i n 4,WE I G u i j i a n g1ә1.M e d i c a l L a b o r a t o r y C e n t e r ,A f f i l i a t e d H o s p i t a l o f Y o u j i a n g M e d i c a l U n i v e r s i t y fo r N a t i o n a l i t i e s /K e y L a b o r a t o r y o f C l i n i c a l M o l e c u l a r D i a g n o s i s a n d R e s e a r c h f o r H i gh I n c i d e n c e D i s e a s e s i n G u a n g x i U n i v e r s i t i e s /B a i s e K e y L a b o r a t o r y o f C l i n i c a l M o l e c u l a r D i a gn o s i s ,R e s e a r c h a n d D e v e l o p m e n t f o r H i g h I n c i d e n c e D i s e a s e s ,B a i s e ,G u a n g x i 533000,C h i n a ;2.D e p a r t m e n t o f M e d i c a l L a b o r a t o r y ,T i a n d o n g C o u n t y P e o p l e 's H o s p i t a l o f G u a n g x i Z h u a n g A u t o n o m o u s R e g i o n ,B a i s e ,G u a n g x i 533000,C h i n a ;3.S c h o o l o f L a b o r a t o r y M e d i c i n e ,Y o u j i a n g Me d i c a l U n i v e r s i t yf o r N a t i o n a l i t i e s ,B a i s e ,G u a ng x i 533000,Chi n a ;4.D e p a r t m e n t o f N e u r o l o g y ,A f fi l i a t e d H o s p i t a l o f Y o u j i a n g M e d i c a l U n i v e r s i t y f o r N a t i o n a l i t i e s ,B a i s e ,G u a n gx i 533000,C h i n a A b s t r a c t :P a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s m s a r e o n e o f t h e i m p o r t a n t f a c t o r s t h r e a t e n i n g h u m a n h e a l t h .R a pi d a n d a c c u r a t e d e t e c t i o n m e t h o d s a r e o f g r e a t s i g n i f i c a n c e f o r t h e d i a g n o s i s o f i n f e c t i o u s d i s e a s e s .L o o p-m e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n (L AM P )i s o n e o f t h e i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n m e t h o d s ,w h i c h h a s t h e a d v a n t a ge s of s h o r t r e a c t i o n t i m e ,s i m p l e o p e r a t i o n ,h igh s e n si t i v i t y ,h i g h s p e c i f i c i t y a n d l o w c o s t ,s o i t i s w i d e l y us e d i n t h e r a p i d d i a g n o s i s o f i n f e c t i o u s d i s e a s e s .B a s e d o n t h i s s i t u a t i o n ,t h i s p a p e r m a i n l y e l a b o r a t e s t h e p r i n c i pl e a n d c h a r a c t e r i s t i c s o f L AM P a n d i t s a p p l i c a t i o n a n d r e s e a r c h p r o g r e s s i n t h e d e t e c t i o n o f c o mm o n p a t h o g e n i c m i -c r o o r g a n i s m s i n c l i n i c .L AM P t e c h n o l o g y h a s b e e n a p p l i e d t o t h e d e t e c t i o n o f p a t h o g e n i c m i c r o o r ga n i s m s w i t h h i g h s e n s i t i v i t y a n d s p e c i f i c i t y ,b u t t h i s t ec h n o l o g y i s s t i l l p r o n e t o p r od u cef a l s e p o s i t i v e ,c o m p l e x p r i m e r d e -s ig n a n d o th e r s h o r t c o mi n g s .T h i s p a p e r r e v i e w s t h e a p p l i c a t i o n a n d p r o g r e s s o f L AM P t e c h n o l o g y in p a t h o -g e n i c m i c r o b i a l i n f e c t i o n i n r e c e n t y e a r s ,a n d o u t l o o k s i t s f u t u r e d e v e l o p m e n t p r o s pe c t i n o r d e r t o p r o v i d e a r e a s o n a b l e r e s e a r c h d i r e c t i o nf o r t h e r a p i d d i ag n o s i s o f p a th o ge n i c m i c r o b i a l i nf e c t i o n i n t h e e n v i r o n m e n t w i t h l i m i t e d r e s o u r c e s .K e y w o r d s :l o o p -m e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n t e c h n i q u e ; n u c l e i c a c i d t e s t ; p a t h o g e n i c m i c r o o r -g a n i s m ; n u c l e i c a c i d a m p l i f i c a t i o n ; m yc o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s ㊃3001㊃检验医学与临床2024年4月第21卷第7期 L a b M e d C l i n ,A pr i l 2024,V o l .21,N o .7*基金项目:国家自然科学基金项目(82260418,82060570);右江民族医学院附属医院高层次人才项目(R 202011701);广西壮族自治区百色市科学研究与技术开发计划项目(百科20232031)㊂ә通信作者,E -m a i l :w e i g u i j i a n g2021@163.c o m ㊂病原微生物是指能够引起人和动物疾病的微小生物,对人类健康具有极大的威胁㊂临床上很多常见疾病都是病原微生物感染导致的,如各种病毒性肝炎㊁结核病㊁新型冠状病毒感染等,这类疾病通常都具有一定的传染性,有的甚至可以造成世界范围的大流行㊂因此,临床迫切需要一种能够准确㊁高效㊁快速㊁简便地识别相关病原体的检测方法㊂随着分子生物学研究的不断深入,核酸扩增技术在诊断领域的应用越来越广泛㊂其中最具代表性的是聚合酶链反应(P C R),它能在短时间内对靶标完成指数级扩增,且具有较高的灵敏度和特异度[1],因此很多病原微生物检测都将其作为诊断的参考标准㊂然而,P C R需要经历变温过程,对设备和操作者要求较高,从而导致其在欠发达地区和现场实施检测上的应用受到一定的限制㊂而等温扩增技术的出现就很好地解决了这一问题,该技术在恒定温度下即可完成扩增反应,摆脱了对高精密热循环仪的依赖,有望取代P C R在诊断领域的地位㊂环介导等温扩增(L AM P)是由日本荣研株式会社N O T OM I等[2]于2000年研发,是一种较为成熟的等温扩增法,具有高效㊁快速㊁灵敏度高㊁特异性度强等优点,因此被应用于医学领域中细菌㊁病毒㊁寄生虫的检测[3-4]㊂1 L AM P的反应原理与特点1.1 L AM P的反应原理 L AM P的扩增过程可以分为两个阶段,即起始阶段和扩增循环阶段[2],扩增完成后可与多种技术相结合实现扩增产物的检测,不同的技术有不同的检测原理,如试纸条法㊁荧光法等,本文主要讲述L AM P的扩增原理㊂在扩增的过程中需要引物的参与,和其他扩增方法不同的是,L AM P 需要设计2对引物,即内部引物(F I P/B I P)和外部引物(F3/B3),通过这两对引物对靶基因的6个不同区域(F1-F1c㊁F2-F2c㊁F3-F3c㊁B1-B1c㊁B2-B2c㊁B3-B3c)特异性识别,因此L AM P具有极强的特异性㊂在起始阶段,当温度达到60~65ħ时,双链D N A处于解旋与结合的不稳态,其中上游内部引物F I P中的F2序列区段首先与模板目标区段的单链D N A中的F2c结合,在B s t D N A聚合酶的作用下自F2的3'末端延伸启动链置换D N A合成㊂外引物F3则与模板F3c结合并延伸,置换出由F I P链接的互补单链D N A,此单链的F1c与F1区段为互补结构,可通过自我碱基配对形成环状结构㊂以上述步骤中合成的5'端以茎环状结构的单联D N A为模板,下游内部引物B I P的B2序列区段与单链D N A模板的B2c 结合,在B s t D N A聚合酶的作用下启动链置换反应,自B2的3'末端开始延伸合成D N A㊂外引物B3则与模板B3c结合并延伸,置换出由B I P链接的互补单链D N A,此单链的F1与F1c区段互补,B1c与B1区段互补,形成哑铃状结构的单链D N A㊂哑铃状结构以3'末端的F1区段为起点,以自身为模板进行D N A合成㊂由此,哑铃状结构转变为茎环状结构,L AM P扩增进入循环阶段㊂循环阶段以起始阶段形成的单链D N A为模板,在内部引物与B s t D N A聚合酶的作用下,反复进行延伸和链置换反应,最终产生大量具有多个靶标反向重复序列的茎环D N A结构[2]㊂1.2 L AM P的特点 L AM P不需要进行高温变性,整个过程在60~65ħ反应60m i n即可完成㊂与其他核酸扩增法相比,L AM P具有更高的特异性和抗干扰性,因为它是通过2对引物特异性识别靶基因上的6个不同区域来启动反应㊂此外,L AM P的灵敏度也很高,能够在短时间内扩增出1ˑ107~1ˑ1010数量级的产物,比常规P C R高100倍左右[5],有报道指出L AM P最低可检测10个基因拷贝或更低的检测限[6]㊂而且L AM P对设备要求不高,一般的水浴锅即可满足需求㊂因此,L AM P具有高效㊁灵敏度高㊁特异性强㊁简便等优点㊂当然,L AM P也有其不足之处:首先,L AM P反应需要2对引物参与,因此对引物设计要求较高,如果引物设计不合理,就可能产生非特异性扩增片段影响结果的正确性㊂其次,由于L AM P 的灵敏度很高,在反应过程中易产生气溶胶污染,导致假阳性结果㊂最后,由于L AM P的扩增产物是长短不一且含有大量茎环结构的D N A双链,因此很难对其扩增产物进行定量分析㊂2 L AM P技术在病原微生物临床检测中的应用目前,临床上对于病原微生物感染的诊断方法主要有培养法㊁血清学方法及P C R㊂但这些方法都有其不足之处:培养法耗时较长;血清学方法特异度不高,易产生假阳性结果;P C R对设备和实验环境要求较高㊂而L AM P因其具有灵敏度高㊁特异性强㊁操作简便等优点,有望取代传统技术在病原微生物检测中的地位㊂2.1 L AM P技术在新型冠状病毒检测中的应用新型冠状病毒感染者主要表现为发热㊁咳嗽,严重者会休克甚至死亡㊂虽然目前已经上市了大量的疫苗,但对新型冠状病毒快速㊁准确㊁高效地诊断仍然是疫情防控的关键㊂实时反转录P C R因具有特异性强㊁灵敏度高等优点,被视为诊断新型冠状病毒感染的金标准[7],但它耗时较长,而且对设备和操作人员的要求也较高,因此在资源匮乏地区和现场实时检测新型冠状病毒的应用方面受到一定的限制㊂L AM P作为一种恒温扩增法,不仅操作简便,而且其灵敏度不低于反转录P C R[8],因此L AM P可以作为反转录P C R的替代方法以弥补其不足之处㊂目前,已经有大量基于L AM P的试剂盒被用于新型冠状病毒的检测,E i k e n 公司开发的L o o p a m p T M新型冠状病毒检测试剂盒基于N基因和R d R p基因设计,通过测量反应体系浊度确定检测结果㊂为了评估L o o p a m p T M新型冠状病毒㊃4001㊃检验医学与临床2024年4月第21卷第7期 L a b M e d C l i n,A p r i l2024,V o l.21,N o.7检测试剂盒的有效性,Y A N等[9]用该试剂盒检测新型冠状病毒,并使用L A-200浊度计对扩增产物进行实时检测,结果表明该反应能够在35m i n内检测到水平为10c o p y/μL的R N A㊂HU A N G等[4]针对新型冠状病毒的O R F1a b㊁S㊁N基因,将比色法与L AM P结合用于检测新型冠状病毒,该方法仅需30 m i n即可完成检测,通过肉眼判读结果,无须精密仪器,且灵敏度可达80c o p y/μL㊂此外,L AM P还可以和荧光检测[10]㊁微流控[11]等技术结合用于检测新型冠状病毒㊂这些方法的建立为新型冠状病毒快速㊁准确㊁高效地检测提供了新的思路,也为疫情防控做出了重大贡献㊂2.2 L AM P技术在结核分枝杆菌检测中的应用结核分枝杆菌是引起结核病的病原菌㊂2020年世界卫生组织(WHO)报告显示,我国结核感染人数位居世界第3位[12]㊂早期诊断并给予恰当的治疗是控制结核病传播的关键,因此,临床迫切需要寻找一种快速㊁准确㊁简单的检测方法㊂L AM P能在60~65ħ的条件下对结核分枝杆菌进行快速检测,1h即可完成试验[13]㊂贾枫等[14]通过临床试验对比了抗酸染色法㊁L AM P法和改良罗氏培养法检测痰标本中结核分枝杆菌的阳性率㊁灵敏度和特异度㊂结果表明L AM P法在结核分枝杆菌的诊断中具有快速㊁灵敏等优点㊂此外,L AM P对于一些罕见的肺外结核病的诊断也具有很高的价值㊂K H A N 等[15]以m p t64和p s t S1为靶点,建立了多靶点L AM P检测骨关节结核患者结核分枝杆菌的方法,结果表明多靶点L AM P在骨关节结核总病例中的灵敏度显著高于多重P C R和G e n e X p e r t㊂S H A R MA 等[16]采用I S6110和M P B64靶点对35例临床疑似胃肠道结核患者的回盲活检标本和30例非结核对照者的回盲活检标本进行结核分枝杆菌复合体L AM P检测㊂结果表明,L AM P检测胃肠道结核分枝杆菌的灵敏度明显高于I S6110P C R和培养法㊂此外,在结核病的诊断方面,仍有大量基于L AM P的新技术不断被开发出来㊂如将L AM P技术与基于纳米颗粒的侧流装置(L F D)[17]及微流控芯片[18]等技术的联合应用㊂由此可见L AM P在结核病的诊断发面也有广阔的前景㊂2.3 L AM P技术在沙门菌检测中的应用沙门菌是全球最主要的食源性致病菌㊂若误食含有沙门菌的食物可导致食物中毒,严重者会引发肠胃炎㊁败血症等症状,若不及时就医甚至会危及生命㊂因此该菌被世界卫生组织(WHO)列为具有中等乃至严重危害的食源性病原菌[19]㊂目前临床上主要通过传统的实验室方法在标本中检测沙门菌㊂但这些传统的实验室方法操作复杂㊁耗时较长,需要3d以上才能通过多个分析步骤获得结果㊂近年来,随着核酸检测技术的不断发展与完善,许多基于核酸扩增的技术已经被广泛使用,如P C R㊁实时P C R等,这些方法均能将检测时间缩短到3d以内[20]㊂其中P C R虽然灵敏度高,但需要配备训练有素的人员和复杂的热循环仪,这使得其难以在设备不足的实验室和资源匮乏的现场环境中应用㊂而L AM P作为一种新型的核酸扩增技术,在病原微生物的检测方面有其独特的优势㊂自2005年L AM P被应用于沙门菌的检测之后,已经开发出数十种基于L AM P的沙门菌检测方法,这给临床早期诊断沙门菌感染带来了新的希望㊂近年来,随着对L AM P技术的深入研究,大量的商业试剂盒被用于沙门菌的快速检测[21]㊂此外,还有一些基于L AM P的新技术被开发出来㊂试纸条作为一种简单㊁快速的检测方法,常与L AM P技术结合用于现场快速检测,朱传新等[22]建立了环介导核酸恒温扩增结合试纸条(L AM P-L F D)检测技术用于沙门菌的快速检测,30m i n内即可完成检测,其灵敏度与P C R相当,为10c o p y/μL㊂D R A Z等[23]将L AM P与酶联免疫吸附试验(E L I S A)联合用于检测沙门菌D型血清型菌株,检测灵敏度为1ˑ103C F U/m L,比P C R-E L I S A的灵敏度高10倍㊂D R A Z等[23]将L AM P与表面增强拉曼技术联合用于检测肠炎沙门菌,其灵敏度比常规P C R高10倍,达到了66C F U/m L㊂与P C R相比,L AM P不仅快速㊁简单,而且具有高灵敏度㊁高特异度等优点,因此, L AM P技术具有替代传统方法检测沙门菌的潜力㊂2.4 L AM P技术在金黄色葡萄球菌检测中的应用金黄色葡萄球菌是一种常见的机会致病菌,当机体免疫力降低时,它可以迁移到其他组织或器官造成感染,严重者甚至出现菌血症,具有较高的致死率㊂目前临床上金黄色葡萄球菌的常规检测方法是微生物培养法,这种方法虽然具有较高的灵敏度和准确性,但检测过程烦琐㊁耗时较长[24]㊂很多患者因此错过了最佳治疗期㊂因此,开发一种快速㊁可靠的检测方法来检测金黄色葡萄球菌是临床上迫切需要的㊂近年来,越来越多的分子诊断技术被用于病原微生物的分类鉴定,与培养法相比,分子诊断技术具有快速㊁准确㊁灵敏等优点,常见的分子诊断技术有P C R㊁重组酶聚合酶扩增技术(R P A)㊁L AM P等㊂其中P C R在金黄色葡萄球菌的临床标本检测中具有较高的准确率[25],然而,由于需要昂贵的设备和熟练的操作人员,P C R在资源匮乏地区的应用受到一定的限制㊂L AM P作为一种恒温扩增法,无须昂贵的设备和复杂的操作步骤㊂WU等[3]开发了一种基于L AM P 的可视化检测法,通过使用比色指示剂羟基萘酚蓝目视检测金黄色葡萄球菌,结果表明L AM P的检测限为每反应8c o p y或每反应400C F U㊂与常规P C R相比,L AM P将检测限降低至1/10㊂邹作成等[26]也设㊃5001㊃检验医学与临床2024年4月第21卷第7期 L a b M e d C l i n,A p r i l2024,V o l.21,N o.7计了基于n u c基因的L AM P可视化检测法,该方法的检测限可达5.6ˑ101C F U/m L,其灵敏度比常规P C R高出10000倍㊂L I M等[27]以金黄色葡萄球菌的s p a和a r c C基因为靶标,将L AM P与P C R对比,结果表明二者的特异度㊁阳性预测值和阴性预测值完全一致,L AM P的检测限为2.5n g/μL或1ˑ102 C F U/m L,而P C R的检测限为12.5n g/μL或1ˑ103 C F U/m L㊂由此可见,在检测金黄色葡萄球菌方面,与P C R相比,L AM P不仅具有同样的特异度和准确率,而且检测时间更短,灵敏度更高㊂因此L AM P是一种很有前途的快速检测金黄色葡萄球菌的方法㊂2.5 L AM P技术在乙型肝炎病毒(H B V)检测中的应用 H B V是一种环状部分双链D N A病毒,主要通过血液传播,由于H B V感染早期没有任何症状,且感染者血液内缺乏乙型肝炎表面抗原,H B V-D N A含量较低,因此很难在早期检测到H B V感染㊂E L I S A和实时定量P C R是目前临床检测H B V最常用的方法[28],然而E L I S A诊断乙型肝炎的灵敏度非常低[29],实时定量P C R作为E L I S A的替代方法,其灵敏度较高,但它对实验设备和环境要求也很高[30],在资源不足的情况下很难满足,因此,需要开发出一种快速㊁灵敏㊁特异㊁易于使用的H B V检测方法㊂C H E N等[31]通过使用L AM P检测H B V,该方法可以不用提取D N A直接检测血液中的H B V,其灵敏度为每反应10c o p y,与P C R相当㊂C HE N等[32]设计了一种L AM P与基于纳米颗粒的LF D用于临床上H B V的检测,在60m i n内即可完成结果的读取,其灵敏度为每反应7.5I U㊂MA I T Y等[33]同样将L AM P与L F D结合用于检测H B V,结果表明H B V-L AM P-L F D法检测H B V的灵敏度为92%,特异度为100%,检测限低至500p g/μL㊂为了更好地评估L AM P对H B V诊断的准确性,C H E N等[34]通过检索E m b a s e㊁C o c h r a n e L i b r a r y和P u b M e d数据库中使用L AM P检测H B V的研究,然后使用Q U A D A S-2工具提取数据并评估文献质量,分析发现L AM P检测H B V的灵敏度和特异度分别为0.91和0.97,阳性似然比㊁阴性似然比㊁诊断优势比分别为16.93㊁0.08和397.57㊂由此可见,与P C R相比,L AM P是一种简便㊁快速㊁有效的检测H B V的方法㊂因此, L AM P可以取代其他方法用于临床诊断H B V感染㊂2.6 L AM P技术在华支睾吸虫检测中的应用华支睾吸虫又称肝吸虫,是临床上常见的一种人类寄生虫,主要流行于中国㊁韩国和越南等国家[35]㊂感染早期无明显症状,随着病情的发展,患者会出现腹部不适㊁黄疸㊁发热㊁呕吐和腹泻等,甚至可能引发癌变,因此华支睾吸虫被WHO的国际癌症研究机构归类为Ⅰ类生物致癌物[36]㊂华支睾吸虫的准确诊断对于患者的治疗极为重要,目前临床上主要通过涂片镜检法和血清学方法来诊断华支睾吸虫,但镜检法阳性率较低,因此轻度感染病例可能会被遗漏;而血清学方法又无法判断是既往感染还是现在感染[37]㊂虽然已经开发出了几种基于P C R的检测方法,但它们的灵敏度和特异度波动较大[38]㊂近年来,L AM P也被用于华支睾吸虫的检测,R A HMA N等[39]将L AM P用于检测从韩国的华支睾吸虫疫区采集的人粪便样品,并使用K a t o-K a t z 方法和实时P C R作为参考标准,L AM P测定显示灵敏度为97.1%(95%C I:90.1%~99.2%),特异度为100.0%(95%C I:92.9%~100.0%)㊂此外,朱海等[40]以华支睾吸虫I T S2基因为靶标成功建立了一种可用于检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴的L AM P方法,该方法对华支睾吸虫成虫D N A的最低检出限可达到3.33ˑ10-4n g/μL,灵敏度和特异度与P C R法一致,均为100%,相对于P C R,L AM P不仅具有很高的灵敏度和特异度,而且操作更加简便㊁反应时间更短㊂因此,L AM P完全可以替代其他方法用于临床检测华支睾吸虫㊂3总结与展望3.1 L AM P的优势 L AM P是一种新型的恒温扩增技术,在模板㊁多条引物及链置换酶的参与下,无须温度循环即可快速完成扩增过程㊂与P C R相比, L AM P无须精密的控温装置,操作简便㊁快捷,更适用于资源条件有限的基层医院使用,在病原微生物的现场检测方面有非常广阔的前景㊂3.2 L AM P的不足近年来,L AM P技术发展迅速,但仍然面临着许多困难与挑战:(1)由于L AM P 技术灵敏度高,一旦开盖容易形成气溶胶污染,加上目前国内大多数实验室不能严格分区,假阳性问题比较严重,因此需要通过设置空白对照确定是否为假阳性,并且在实验过程中使用实时浊度仪,避免开盖导致的污染㊂(2)L AM P与其他恒温扩增法不同,它需要2对引物参与反应,因此引物设计比较复杂,有些疾病的靶基因可能不适合用L AM P方法检测㊂(3)由于L AM P技术发展时间较短,因此它的集成检测设备不够成熟㊁商品化应用有待加强㊂3.3未来展望随着L AM P技术的发展及其与多学科技术的联合创新,上述问题都将会得到解决㊂总之,L AM P技术作为一种新型核酸扩增检测技术,在现场快速检测和基层应用于诊断病原微生物感染的前景较广阔,但仍需要不断深入研究㊂参考文献[1]K E L L E R M,N A U E J,Z E N G E R L E R,e t a l.A u t o m a t e df o r e n s i c a n i m a l f a m i l y i d e n t i f i c a t i o n b y n e s t e d P C R a n dm e l t c u r v e a n a l y s i s o n a n o f f-t h e-s h e l f t h e r m o c y c l e r a u g-m e n t e d w i t h a c e n t r i f u g a l m i c r o f l u i d i c d i s k s e g m e n t[J].㊃6001㊃检验医学与临床2024年4月第21卷第7期 L a b M e d C l i n,A p r i l2024,V o l.21,N o.7P L o S O n e,2015,10(7):e0131845.[2]N O T OM I T,O K A Y AMA H,MA S U B U C H I H,e t a l.L o o p-m e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n o f D N A[J].N u-c l e i c A c id s Re s,2000,28(12):e63.[3]WU C,Z E N G Y,H E Y.R a 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食源性致病菌等温扩增检测技术的研究进展
分析测试学报 FENXI CESHI XUEBAO(Joxmal of Instmmental Analysis)
Vol. 30 No. 7 974-89)
doi: 17. 3969/j. issm 1704 -4457. 2210. 07・ 010
食源性致病菌等温扩增检测技术的研究进展
ReseomS Progress of OotOermol Amplification TecSnipncs for Detection of Fooh-Pornc Bacteria
GE Hany , WU Mup-Cu , ZHANG Minp-zhox , YU Xiao-piny *
（Zhejiang Previucial Key Laboratom of BiomeWodgp and Inspectiou & Quara/iue ； Colleye of Life Scieuces : China Ji/ang U/versitp , HangzUop 310018 , Chiuv）
Abstract ： Rapih and reUable detection methohs for fooP-houie /athoyen are the hey poOts for fooh safety control. However ； trabi/onal ch/ure-Pased /mcedure for bacte/al ihentiCcation , generally taping 5 to 7 days and repuiPng shilled person and non-poUaVIe equipm//, is incompeto/ for 0（X1/of-care er ox-site detection. Thus : several isothermal amp/Ccatiox methohs characte/zed Uy —、匚（ nus and thermal cycle Oduudut were devedped to fulfill some specific needs for uoint-of-care er ox-site detection. In this review , mechanisms for isothermal amplification methohs : designated as Uop二UOod isothumdl amp/Ccatiox , ml/ng circle amp/Ccatiox , strand dispUcmut amp/Xcatiox , niching enzyme signal amplification , exoxncUxso 皿 dssistU amp/Ccatiox , were explained and compared 2 detail. Besides : some drawbachs shared Uy these methohs were Uigh/ghted , and ways to overcoming those drawbachs such as aboptiox of /mpidium monoazibe ； novot Uuorescant dye ； high -tOronph/ut pmWutout uuipmut and microUuidic chip were /mvibed based on the recent /uUlicatOns of the avthorU ymn/ and others. Key words: isothermal ampliCcatiox; bacte/al detection; point-of-care detection; ox-site detec tion ;fooh safety
重组酶聚合酶等温扩增技术在食品安全检测领域的应用
DOI：10.13995/kl.11-1802/ts.019291重组酶聚合酶等温扩增技术在食品安全检测领域的应用兰海鸥1!，柯义强1,2，马咸莹1!，程浩1!，丁功涛1!，李明生V，陈士恩1!，马忠仁1!，魏嘉V1(西北民族大学，生物医学研究中心，中国-马来西亚国家联合实验室，甘肃兰州，730030)2(西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州，730030)摘要重组酶聚合酶等溫扩增技术(recembinase polymerase amplification，RPA)是一种新型核酸等溫扩增技术。
该技术相对于PCR等其他核酸体外扩增技术具有灵敏度高、特异性强、检测时间短、操作简便等特点°RPA 技术在常溫下即可进行等溫扩增，其最适溫度在37~42［，RPA技术可在简单设备甚至恶劣环境对核酸的进行快速扩增，结合侧流层析技术荧“检测装置可对检测结果进行定性定量分析。
文章综述了RPA技术的原理，操作条件及其在食源性病毒、食源性致病菌、动物源性检测及转基因食'检测等方面的应用，为该技术进行更加A 入和广泛的研究提供参考。
关键词重组酶聚合酶等溫扩增技术；食品安全；检测技术随着全球经济的发展，进口贸易的增多，食品安全检测也日趋％常用于食品安全检测的酶链式反应(polymerase chain reection，PCR)技术，是目前大部分学实验在使用的常规技%然而该技术需要昂贵且精密的设备，耗费较长时间，在现场检测中不具势，因此，我要更加简便的率％等温核酸扩的为快速检测带来新的曙光％目前开发岀来的等温扩包括环介导等温扩(ioop-m?dia ed isoeh?emaiampiiiicaeion m?ehod，LAMP)、自主序列复制与依赖核酸序列性扩增技术(nucleic acid sequence-based amp/ficotion，NASBA)、单引物等温扩增(single peimeeisoeheemaiampiiiica-tion，SPIA)、链置换扩增技术(strand displacoment amp/ficytion，SDA)、信号介导的核糖核酸扩增技术(sigai-mediaeed ampiiiicaeion RNA eechnoiogy，SMART)&依赖解旋酶的等温扩增技术(helicose乙c penden eiso ehe ema iDNA ampiiiicaeion，HAD)、环扩(eo i ingciecieampiiiicaeion，RCA)、速等第一作者：硕士研究生(魏嘉副教授为通讯作者，E-mail：jiawei @)%基金项目：中国-马来西亚清真食品国家联合实验室，科技部援外项目"KY201501005)；中央基本科研项资金项目：利用RPA技术快速食品中花生过敏原方法的建立(319 20180127)；西北民族大学双一流和特色发展引导专项(100187 03，1001070204)；教“长江学者和创新团队计划”项目(IRT_17R88)；甘肃省科技计划资助(17YF1WA166)收稿日期：2018-11-12，改回日期：2019-04-16大(eapid isoeheemaideeeceion and ampiiiica-tion，RIDA)、切刻内切酶核酸恒温扩增(nicking enzyme mediated isothermal amp/ficytion，NEMA)和重组酶聚合酶扩增技术等［1］o对重组酶聚合酶等温核扩(eecombinase po yme ease amp iiicaeion，RPA)及其在食品安全检测方面的应用进行综述％RPA技术是聚合酶链式反应(PCR)的一种替代品,可快速、便捷行核分析［2］%RPA与PCR扩增一样具有特异性，但速度更快，通常在3~10mw 生成％与PCR不同的是,RPA反应不需要热变性，因此要昂贵的热循环设备％RPA对操作温度要求并不严格，反应在37~42［下工作最优，比其他等温扩要的温度要低，能在广泛的环度下工作［3］%RPA可以在多种应用中取代PCR，如传染病诊断和食品安全检测，它非常适合于现场、护理点和其他设备缺乏的环境，特别是对于检测速度需求较高的情况下％1RPA技术介绍1.1反应原理RPA技术的整个反应体系包含噬菌体重组酶UvsX及其辅助因子UvsY、寡｝引物、单链核酸结合(singie-seeanded DNA-bindingpeoeen，SSB)、DNA 聚合酶,DNA模板、ddH2。
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现代分子生物学技术发展迅猛, 以聚合酶链反应 (polymerase chain reaction, PCR)为代表的基于核酸的检测 技术发展更为迅速, 然而 PCR 技术一直无法摆脱对精密仪 器设备的依赖、高洁净度要求的操作条件、反应时间过长 等局限。此时以核酸等温扩增技术为基础的检测技术得到 了 迅 猛 的 发 展 。 等 温 扩 增 技 术 (isothermal amplification technology) 是一种核酸体外扩增技术 , 其特点是反应过程 始终维持在恒定的温度下 , 通过添加不同活性的酶和特异 性引物来达到快速扩增核酸的目的。与 PCR 相比, 核酸等 温扩增对仪器设备的要求大大降低, 反应时间也大大缩短。 在众多等温扩增技术中, 环介导等温扩增 (loop-mediated isothermal amplification, LAMP)目前已在一 定范围内得到了应用 , 其他一些新发展起来的等温扩增技 术 , 如链替代等温扩增 (strand displacement amplification, SDA)、依赖解旋酶等温扩增(helicase-dependent isothermal amplification, HAD) 、 滚 环 等 温 扩 增 (rolling circle amplification, RCA)、依赖核酸序列等温扩增 (nucleic acid sequence-based amplification, NASBA)、切刻内切酶核酸恒 温 扩 增 技 术 (nicking enzyme mediated isothermal amplification, NEMA)、交叉引物等温扩增(crossing priming amplification, CPA), SmartAmp 技 术 (smart amplification process technology), 也在不断发展与完善之中 [1]。围绕等 温扩增技术开发的食源性致病菌检测方法也应运而生 , 进 一步提高了对食源性病原微生物检测的效率和准确性。本 文综述了等温扩增技术在食源性致病菌检测中的应用现状, 通过对国内外等温扩增技术应用的比较和分析 , 探讨未来 等温扩增技术的发展趋势 , 希望对国内的食品安全检测技 术研发和产业发展提供参考。
第 6 卷 第 12 期 2015 年 12 月
食品安全质量检测学报 Journal of Food Safety and Quality
Vol. 6 No. 12
Dec. , 2015
等温扩增技术在食源性致病菌检测中的应用进展
朱智壕, 葛丽雅, 涂晓波, 余超挺, 黄欣迪, 卞学海, 亓
(深圳出入境检验检疫局, 深圳 518000)
2.2
依赖解旋酶等温扩增
依赖解旋酶等温扩增技术(HAD)是由 Vincent 等[12]在
2004 年发明的一种新型核酸等温扩增技术, 该技术模拟体 内 DNA 复制的机制和过程, 在恒温条件下利用生物复制 系统的关键组分实现 DNA 的体外扩增。DNA 在解旋酶的 作用下解开双链 , 单链结合蛋白为单链提供结合模板 , 然 后在 DNA 聚合酶的催化下互补配对, 新合成的双链又在 解旋酶的作用下分解 , 进入新一轮的扩增反应 , 最终实现 核酸的指数式增长。此外，通过添加热稳定的逆转录酶 , HAD 已 成 功 用 于 RNA 模 板 的 逆 转 录 等 温 扩 增 (RT-tHDA)[13]。 依赖解旋酶等温扩增引物设计相对简单, 石琰璟等[14] 以副溶血性弧菌的 tlh 基因为目的片段设计特异性引物 , 成功建立了恒温条件下快速检测副溶血性弧菌的依赖解旋 酶 DNA 恒温扩增技术(HDA)的检测法, 进行了特异性和灵 敏度实验, 并与普通 PCR 方法进行了比较。该 HDA 检测 方法与普通 PCR 方法相当。副溶血性弧菌的 HDA 检测方 法不仅具有普通 PCR 高特异性、高灵敏度等特点, 且对仪 器要求更低, 用普通水浴槽即可进行反应。
KEY WORDS: isothermal amplification technology; food-borne pathogens; detection technology
基金项目 : 国家自然科学青年基金项目(31401585)、国家质检总局项目(2014IK101)、深圳市科技项目(JCYJ20120831160213584) Fund: Supported by National Scientific Foundation of China (31401585), General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine of the People’s Republic of China Program (2014IK101), and Shenzhen Science and Technology Innovation Plan (JCYJ20120831160213584) *通讯作者: 张恒, 博士, 高级工程师, 主要研究方向为纳米材料与食品安全。E-mail: yzhangheng@ *Corresponding author: ZHANG Heng, Doctor, Senior Engineer, Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shenzhen 518000, China. E-mail: yzhangheng@
in a variety of fields due to its unique advantages like cheap, easy-to-operate, high sensitivity and specificity compared to traditional PCR. Isothermal amplification technologies have been widely used in the diagnosis of infectious diseases, genetic polymorphism analysis and epidemic prevention; there are also reports on its application in the detection of bacteria, viruses and other pathogens. Isothermal amplification technology in the field of food-borne pathogens and pathogen detection in the environment has shown an application potential, and it is expected to develop as an important method for the detection of food-borne pathogens. This paper gives a brief introduction of new methods such as loop-mediated isothermal amplification (LAMP), helicase-dependent isothermal amplification (HAD), nucleic acid sequence-based amplification (NASBA), nicking enzyme mediated isothermal amplification (NEMA), crossing priming amplification (CPA), strand displacement amplification (SDA), and smart amplification process technology (SMAP) etc. It provides reference and basis for the practical application of the detection of food-borne pathogenic bacteria.
Progress on application of isothermal amplification for food-borne pathogen detection
ZHU Zhi-Hao, GE Li-Ya, TU Xiao-Bo, YU Chao-Ting, HUANG Xin-Di, BIAN Xue-Hai, QI Shuang, ZHENG Heng*
(Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shenzhen othermal amplification technologies grow rapidly in recent years. These technologies are used
4788
食品安全质量检测学报
第6卷
1
引
言
100％。胡连霞等[5]采用改良环介导等温扩增技术, 以阪崎 肠杆菌(ATCC29544)的 16S~23S rRNA 间区序列作为靶序 列, 设计内、 外引物和环引物检测婴幼儿配方奶粉, 检出值 为 0.101 cfu/mL, 远高于 PCR 技术的检测灵敏度, 同时配 合 DNA 提取试剂盒, 1 h 就能完成检测。Sowmya 等[6]比较 了 PCR 法和 LAMP 用于检测金黄色葡萄球菌时的灵敏度, 发现 LAMP 的灵敏度是 PCR 的 100 倍。采用 LAMP 技术 检测其他食源性致病菌如单增李斯特[7]、副溶血性弧菌[8]、 大肠杆菌 O157[9]、霍乱弧菌[10]的方法也有见报道。另外, LAMP 结合 SYBR Green I 染料, 能实现可视化检测。胡兴 娟[11]等利用钙黄绿素的荧光显色指示剂作用 , 建立了可视 化的霍乱弧菌 LAMP 检测体系, 对 150 份水产品进行检测, 测出 2 份阳性样本, 与 PCR 结果一致。 LAMP 有较高的敏感性、特异性和抗干扰能力, 反应 体系稳定可靠 , 可通过肉眼观察有无荧光直接判定结果的 优点, 但不足之处是 LAMP 扩增是链置换合成, 靶序列长 度最好在 300 bp 以内, 对引物的要求比较高。