等温扩增技术在食源性致病菌检测中的应用进展

in a variety of fields due to its unique advantages like cheap, easy-to-operate, high sensitivity and specificity compared to traditional PCR. Isothermal amplification technologies have been widely used in the diagnosis of infectious diseases, genetic polymorphism analysis and epidemic prevention; there are also reports on its application in the detection of bacteria, viruses and other pathogens. Isothermal amplification technology in the field of food-borne pathogens and pathogen detection in the environment has shown an application potential, and it is expected to develop as an important method for the detection of food-borne pathogens. This paper gives a brief introduction of new methods such as loop-mediated isothermal amplification (LAMP), helicase-dependent isothermal amplification (HAD), nucleic acid sequence-based amplification (NASBA), nicking enzyme mediated isothermal amplification (NEMA), crossing priming amplification (CPA), strand displacement amplification (SDA), and smart amplification process technology (SMAP) etc. It provides reference and basis for the practical application of the detection of food-borne pathogenic bacteria.
KEY WORDS: isothermal amplification technology; food-borne pathogens; detection technology
基金项目 : 国家自然科学青年基金项目(31401585)、国家质检总局项目(2014IK101)、深圳市科技项目(JCYJ20120831160213584) Fund: Supported by National Scientific Foundation of China (31401585), General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine of the People’s Republic of China Program (2014IK101), and Shenzhen Science and Technology Innovation Plan (JCYJ20120831160213584) *通讯作者: 张恒, 博士, 高级工程师, 主要研究方向为纳米材料与食品安全。E-mail: yzhangheng@163.com *Corresponding author: ZHANG Heng, Doctor, Senior Engineer, Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shenzhen 518000, China. E-mail: yzhangheng@163.com
(Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shenzhen 518000, China)
ABSTRACT: Isothermal amplification technologies grow rapidly in recent years. These technologies are used
2源自文库
2.1
几种恒温扩增核酸技术
环介导等温扩增
环介导等温扩增 (LAMP) 环介导等温扩增是 Notomi
等[2]于 2000 年提出来的一种新的核酸扩增技术, 该方法实 现了在恒温下仅用一种类型的酶即可进行核酸的快速扩增 反应, 其原理[3]主要是基于靶基因 3’和 5’端的 6 个区域设 计 3 对特异性引物, 包括 1 对外引物、1 对环状引物和 1 对内引物, 3 种特异引物依靠链置换 BstDNA 聚合酶, 使得 链置换 DNA 合成不停地自我循环, 从而实现快速扩增, 其 技术原理见图 1。 环介导等温扩增已广泛应用于食源性致病菌的检测。 万进等 以沙门氏菌高度保守基因 fimY 基因为靶基因设 计两对引物(F3&B3、FIP&BIP), 建立 LAMP 反应体系。 对 体系特异性、Mg2+浓度、反应时间、反应温度进行了优化, 其检测灵敏度为 33 cfu/ 管 , 对 35 株临床菌株均检出达
现代分子生物学技术发展迅猛, 以聚合酶链反应 (polymerase chain reaction, PCR)为代表的基于核酸的检测 技术发展更为迅速, 然而 PCR 技术一直无法摆脱对精密仪 器设备的依赖、高洁净度要求的操作条件、反应时间过长 等局限。此时以核酸等温扩增技术为基础的检测技术得到 了 迅 猛 的 发 展 。 等 温 扩 增 技 术 (isothermal amplification technology) 是一种核酸体外扩增技术 , 其特点是反应过程 始终维持在恒定的温度下 , 通过添加不同活性的酶和特异 性引物来达到快速扩增核酸的目的。与 PCR 相比, 核酸等 温扩增对仪器设备的要求大大降低, 反应时间也大大缩短。 在众多等温扩增技术中, 环介导等温扩增 (loop-mediated isothermal amplification, LAMP)目前已在一 定范围内得到了应用 , 其他一些新发展起来的等温扩增技 术 , 如链替代等温扩增 (strand displacement amplification, SDA)、依赖解旋酶等温扩增(helicase-dependent isothermal amplification, HAD) 、 滚 环 等 温 扩 增 (rolling circle amplification, RCA)、依赖核酸序列等温扩增 (nucleic acid sequence-based amplification, NASBA)、切刻内切酶核酸恒 温 扩 增 技 术 (nicking enzyme mediated isothermal amplification, NEMA)、交叉引物等温扩增(crossing priming amplification, CPA), SmartAmp 技 术 (smart amplification process technology), 也在不断发展与完善之中 [1]。围绕等 温扩增技术开发的食源性致病菌检测方法也应运而生 , 进 一步提高了对食源性病原微生物检测的效率和准确性。本 文综述了等温扩增技术在食源性致病菌检测中的应用现状, 通过对国内外等温扩增技术应用的比较和分析 , 探讨未来 等温扩增技术的发展趋势 , 希望对国内的食品安全检测技 术研发和产业发展提供参考。
双, 张
恒*
摘
要 : 等温扩增技术是近年来迅速发展的一类核酸扩增技术。 相比于 PCR, 该技术具有高特异性、 高敏感性、
简单、便捷及低成本的特点。目前, 核酸等温扩增技术在感染性疾病的诊断、基因多态性分析、疫情防治等方 面已经有广泛应用, 也有文献报道了其在细菌、病毒等病原体检测方面的应用。食源性致病菌和环境中的病原 体检测等领域中, 等温扩增技术展现了广阔的应用潜力, 有望发展成为食源性致病菌检测的重要方法。本文综 合国内外文献报道, 对环介导等温扩增、依赖解旋酶等温扩增、依赖核酸序列等温扩增、切刻内切酶核酸恒温 扩增、交叉引物等温扩增、链置换等温扩增、SmartAmp 技术等一系列等温扩增技术的原理、特性及其在食源 性致病菌检测中的应用情况做一综述, 从而为该技术在食源性致病菌检测的实际应用中提供参考和依据。 关键词: 等温扩增技术; 食源性致病菌; 检测技术
Progress on application of isothermal amplification for food-borne pathogen detection
ZHU Zhi-Hao, GE Li-Ya, TU Xiao-Bo, YU Chao-Ting, HUANG Xin-Di, BIAN Xue-Hai, QI Shuang, ZHENG Heng*
第 6 卷 第 12 期 2015 年 12 月
食品安全质量检测学报 Journal of Food Safety and Quality
Vol. 6 No. 12
Dec. , 2015
等温扩增技术在食源性致病菌检测中的应用进展
朱智壕, 葛丽雅, 涂晓波, 余超挺, 黄欣迪, 卞学海, 亓
(深圳出入境检验检疫局, 深圳 518000)
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食品安全质量检测学报
第6卷
1
引
言
100％。胡连霞等[5]采用改良环介导等温扩增技术, 以阪崎 肠杆菌(ATCC29544)的 16S~23S rRNA 间区序列作为靶序 列, 设计内、 外引物和环引物检测婴幼儿配方奶粉, 检出值 为 0.101 cfu/mL, 远高于 PCR 技术的检测灵敏度, 同时配 合 DNA 提取试剂盒, 1 h 就能完成检测。Sowmya 等[6]比较 了 PCR 法和 LAMP 用于检测金黄色葡萄球菌时的灵敏度, 发现 LAMP 的灵敏度是 PCR 的 100 倍。采用 LAMP 技术 检测其他食源性致病菌如单增李斯特[7]、副溶血性弧菌[8]、 大肠杆菌 O157[9]、霍乱弧菌[10]的方法也有见报道。另外, LAMP 结合 SYBR Green I 染料, 能实现可视化检测。胡兴 娟[11]等利用钙黄绿素的荧光显色指示剂作用 , 建立了可视 化的霍乱弧菌 LAMP 检测体系, 对 150 份水产品进行检测, 测出 2 份阳性样本, 与 PCR 结果一致。 LAMP 有较高的敏感性、特异性和抗干扰能力, 反应 体系稳定可靠 , 可通过肉眼观察有无荧光直接判定结果的 优点, 但不足之处是 LAMP 扩增是链置换合成, 靶序列长 度最好在 300 bp 以内, 对引物的要求比较高。
2.2
依赖解旋酶等温扩增
依赖解旋酶等温扩增技术(HAD)是由 Vincent 等[12]在
2004 年发明的一种新型核酸等温扩增技术, 该技术模拟体 内 DNA 复制的机制和过程, 在恒温条件下利用生物复制 系统的关键组分实现 DNA 的体外扩增。DNA 在解旋酶的 作用下解开双链 , 单链结合蛋白为单链提供结合模板 , 然 后在 DNA 聚合酶的催化下互补配对, 新合成的双链又在 解旋酶的作用下分解 , 进入新一轮的扩增反应 , 最终实现 核酸的指数式增长。此外，通过添加热稳定的逆转录酶 , HAD 已 成 功 用 于 RNA 模 板 的 逆 转 录 等 温 扩 增 (RT-tHDA)[13]。 依赖解旋酶等温扩增引物设计相对简单, 石琰璟等[14] 以副溶血性弧菌的 tlh 基因为目的片段设计特异性引物 , 成功建立了恒温条件下快速检测副溶血性弧菌的依赖解旋 酶 DNA 恒温扩增技术(HDA)的检测法, 进行了特异性和灵 敏度实验, 并与普通 PCR 方法进行了比较。该 HDA 检测 方法与普通 PCR 方法相当。副溶血性弧菌的 HDA 检测方 法不仅具有普通 PCR 高特异性、高灵敏度等特点, 且对仪 器要求更低, 用普通水浴槽即可进行反应。