第十二组--染色体工程及其研究进展

特点
同种或异种精子进入卵内只起刺激卵子 发育的作用，不形成雄性原核和提供遗 传物质，其子代的遗传物质完全来自雌 核，只具有母本的性状
人工诱导雌核发育的方法
（1）精子遗传物质的失活
采用显微操作的方法直接 去除受精卵中雄性原核 采用物理辐射如γ射线、X射线和紫外线 等处理精子使精子的遗传物质失活。 采用化学物质如甲苯胺蓝、乙烯尿 素和二甲基硫酸等 除精子染色体遗 传活性
G-C特异性染色。染色体上DNA的碱基序列是不同的，因此这些特异性染料
和不同染色体上DNA结合的量和比例是不同的。结合这些染后，再经激光照 射，染色体就会呈现不同的荧光带。将特定染色体发出的荧光波长输入计算 机，通过计算机控制就可将发出同一波长的染色体收集在一起，从而实现染 色体的分离。
细胞分裂同步处理 染色体的荧光色素染色
内容
1 2 3
人工诱导多倍体
染色体显微操作技术 染色体介导的基因转移技术
44 人工染色体
5
雌、雄核发育
4 人工染色体
概念 人工染色体(artificial chromosome) 是指人工组建具有染色体功能的DNA分子,也 就是人们利用线性染色体稳定的功能序列构 建载体,重组后的DNA以线性状态存在,大大 提高了插入外援基因的能力,且可以像天然染 色体一样,在寄主细胞中稳定复制和遗传.
多倍体动物特点
1.多倍体育种技术方法简单、见效快，具有潜在的理论和应 用价值。 2.许多诱导的多倍体动物如两栖类、鱼类、贝类等都具有良 好的生存力和生长率。 3.种间杂种生长快，可以同时具有两个不同的种的优良特性 。
4.利用三倍体不育的特性，将生殖腺发育消耗的能量用于动 物生长，可以避免因繁殖季节及肉质下降而延误上市时间 或影响商品价值，缩短了养殖周期，减少了养殖成本，这 在鲍鱼、昆虫等方面已有应用。
1细胞同步化与染色体的分离
• 通常的方法是使细胞经有丝分裂阻断剂秋 水仙素处理而同步，再洗涤数次以去除残 存的秋水仙素和胰酶；然后移置低温中性 缓冲液中培育，以利于细胞破碎和保持染 色体的形状；同时，在分离缓冲液中加入 的己烯乙二醇可维系染色体的完整性，提 高钙离子的浓度则能防止染色体的解离； • 最后使细胞经注射针喷射而破碎，即可使 染色体释放出来。
多倍育种中存在的问题
准确的处理时间； 准确可靠的倍性鉴定方法的确定
诱导率、成活率及孵化率的提高
内容
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人工诱导多倍体
染色体显微操作技术 染色体介导的基因转移技术 人工染色体 雌、雄核发育
5
2 染色体显微操作技术
染色体的分离
染色体的微切割
染色体分离的基本原理
由于荧光染料Hoechst 只对A-T特异性染色，而染料Chromomycin只对
人工染色体
自主复制 DNA序列
端粒 着丝粒 DNA序列 DNA序列
三个关 键序列
染色体要确保在细胞分裂中保持稳定， 必须要能够自我复制和向子细胞中平均 分配
分
目的基因 基因载体
切 接
重组体
总 体 技 术 路 线
转 筛 表
正在研究和利用的人造微小染色体：
酵母人工染色体
YAC 研究与应 用 MAC BAC
生物学方法
动物通过杂交方法 尤其是种间杂交获 得异源多倍体。种 间杂交导致第二极 体不排出。 草鱼♀ × ♂三角鲂 (2n=48) (2n =48)
草鲂杂种 (3n=72)
多倍体鱼类生产
三倍体鱼类： 阻止第二极体的排出直接生产三倍体 四倍体个体与二倍体正常个体杂交 四倍体鱼类生产： 阻止受精卵的第一次卵裂
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微细胞制备
微细胞融合
染色体介导转移法
• 染色体介导转移法是指分离得
概 念
到相应的染色体后转入受体细 胞的一种技术。
染色体介导转移法实施步骤
诱发 细胞 同步 分裂
秋水仙素
阻断细胞分裂于 中期
破碎细胞
转移到受体 细胞中去。
适当的 分部
收集大量的 中期染色体
分离染色体
染色体的转移
受体细胞的分离与鉴定
L/O/G/O
染色体工程
主讲：巫凤娟 成员：雷翔云 吴亚磊
什么是染色体工程？
• 染色体工程（chromosome engineering）
是人们按照一定的设计，有计划地消减、
添加或代换同种或异种染色体，从而达 到定向改变遗传特性和选育新品种的一
种技术。
染色体结构
染色体变异
染色体结构变异 染色体数变异 染色体易位 染色体缺失 染色体倒位 染色体重复
生物学方法
物理学方法
草鱼♀ × ♂三角鲂 •温度休克法 (2n=48) ( 2n =48) •水静压法
•细胞松驰素B
化学方法
草鲂杂种 •秋水仙碱 (3n=72)
多倍体倍性鉴定的方法
核体积测量 生化分析 二倍体/三倍体核体积之比为1:1.5，二倍体 与四倍体的核体积之比为1:1.74 如在关东系银鲫中，三倍体红血球的丙酮 酸激酶的含量含著高于二倍体 是鉴定多倍性的一个准确的直接方法
染色体的分离
染色体微切割最常用的方法有两种
采用特细的玻璃针（尖端直径约为 微细 玻璃 针切 割法： 0.17μm）在倒置 显微镜下对目的基因
所在染色体区段进行切割与分离。
将染色体标本在底部贴有特殊薄膜的培 养皿上制作，利用激光共聚焦扫描显微 显微激 光切割 法： 系统，依靠高能量激光照射非选择细胞 或染色体，使其受热蒸发，最后只留下
意义
多倍体动物具有生长速度快，成活率高及 抗病能力强等特点，所以人工诱导多倍体、 改善动物经济性状倍受重视。
人工诱导多倍体的途径
原种或杂种所形成染色体未减数的配子受
精而产生的。 （自然形成途径）
原种或杂种的合子或体细胞染色体数目加
倍而成的。 （人工诱导途径）
人工诱导多倍体的方法
Rasch等（1965）年首次证明了 三倍体脊椎动物可以通过杂交产生
5.某些多倍体动物肉质量、含氧量、抗病性等经济性状较二
动物雌雄核发育
——单倍体育种
雌核发育：是单性生殖的一种，指卵子依靠自己的细胞核
发育成个体的生殖行为。同种或异种精子进入卵内只起刺激 卵子发育的作用，不形成雄性原核和提供遗传物质，其子代 的遗传物质完全来自雌核，只具有母本的性状。
雄核发育：因经过紫外线、X射线和γ 射线处理的卵子与正
显微手术法
物理学方法
化学方法
人工诱导雌核发育的方法
（2）雌核染色体数目减少的阻止 阻止第一次有丝分裂或 第二极体的外排
利用温度、压力或化学方 法，如冷休克、热休克、 流体静水压、细胞松驰素B、 聚乙二醇处理等。
雌核发育的意义
雌核发育具有产生单性种群的能力 雌核发育能迅速地产生同源型二倍体克隆 广泛地用于进行基因——着丝点的定位研究
染色体转移技术的应用前景
• 与体细胞杂交一样，利用染色体转移进行基因定位也是细 胞工程的一项重要技术。由于体细胞转化子中某一染色体 或其片段的存在，与细胞专一性状表达相联系，因此可以 定位基因与特殊染色体或某一区段上. • 如小鼠的微细胞可被导入到另一品系的小鼠或仓鼠甚至与 人的HL细胞内，电泳检测显示存在着小鼠基因型的大分 子物质，如磷脂D，嘌呤核苷磷酸化酶和肽酶B。已经把 前两种酶的结构基因定位于小鼠的第14号染色体上，由于 提示该号染色体已经进入宿主细胞内并行使其功能。 • 另如分离的野生型中国仓鼠细胞的中期染色体在转移到小 鼠L-细胞内后，可探查到特异的供体基因产物HPRT，经 检定该基因的染色体片段也被整合到了受体小鼠的第14号 染色体上。
染色体变异
染色体数变异 细胞内以染色体组为基数进行的整倍 性变化 染色体组内的个别染色体数目有所增 减
内容
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人工诱导多倍体
染色体显微操作技术 染色体介导的基因转移技术
44 人工染色体
5
雌、雄核发育
1 人工诱导多倍体
概念
多倍体（polyploid）这个名词是由Winkler （1916年）首先使用的，它是指每个体细胞 中含有三个或更多染色体组的个体。
染色体介导的基因转移技术
微细胞介导的基因转移法
（Microcell mediated gene transfer，MMGT）
分类 分类
染色体介导的基因转移法
（Chromosome mediated gene transfer， CMGT）
微细胞介导的基因转移法
微细胞
含有一条或几条染色体，外有一薄层细胞质和一个完整质膜 的核质体
染色体计数
DNA含量测定
流式细胞仪
流式细胞仪 Flow Cytometry
它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散 细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参 量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中 分选出来。
多倍体动物的发展趋势
• 多倍体动物的生活力及生长能力强
Βιβλιοθήκη Baidu
• 多倍体动物的性腺发育及其应用
•
•
• 植物染色体工程 • 染色体数目倍性变化（单倍体、多倍体）
• • 染色体数目非倍性变化（单体、多体） 染色体代换：同种代换、异种代换
人工诱导多倍体动物
• 染色体加倍是多倍体育种的主要技术，主 要有生物学方法，物理学方法和化学方法 。 • 生物学方法主要是通过动物杂交的方法获 得异源多倍体。 • 多倍体动物不仅有良好的生存力和生长率 ，而且还具有较好的经济性状和潜在的价 值。
染色体转移技术的应用前景
• 自从1973年染色体转移技术首创以来，这一技术 正在不断的得到完善和发展，它不仅能将各种可 供选择的基因导入受体细胞，而且还可以用于确 定那个基因在染色体上的连锁关系，研究病毒 DNA的染色体整合现象以及从遗传角度去分析培 养细胞的成瘤表型。由于目前对于染色体转移的 细胞生物学机制尚不清楚，所以这一重要的课题 还有待于人们去开拓。只有当弄清了转移的作用 机理后，才能按照人们的意志把外源基因导入受 体的特定染色体上，从而达到改良高等生物的遗 传性状，并培育出新品种的目的。
2 中期染色体的转移
在分离中期染色体之后要解决的问题， 就是如何使这些中期染色体导入受体细胞。 前面已经说过，染色体可通过细胞的吞噬作用而进入受体细胞。 但在早期实验中的基因转移频率甚低，仅达到10-7 -10-6 。
而今由于技术上的改进，即可用磷酸钙和染色体一起沉淀， 再用二甲亚砜处理受体细胞， 或者采用磷酸酯与胆固醇制成的脂质体将染色体转入受体细胞内， 可使转移频率上升到10-5-10 -4
哺乳动物人工染色体 细菌人工染色体
人工染色体的应用
1 基因组物理图谱构建和图谱克隆
2 基因表达调控及其功能研究
3 基因组分析
4 乳腺生物反应器
5 医学领域的基因治疗
内容
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人工诱导多倍体
染色体显微操作技术 染色体介导的基因转移技术
44 人工染色体
5
雌、雄核发育
雌核发育
概念
雌核发育（gynogenesis）是单性生 殖的一种，指卵子依靠自己的细胞核 发育成个体的生殖行为。
雄核发育
概念
雄核发育（androgenesis）是指因 经过紫外线、X射线或γ射线处理的 卵子与正常的精子受精，再在适当 时间施以冷、热或高压等物理处理， 使进入卵子内的精子染色体加倍， 而发育为完全为父本性状的二倍体
“无父之鼠”
染色体工程的应用
• 动物染色体工程
• 染色体数目倍性变化（雄核、雌核、多倍体） 染色体数目非倍性变化（单体、多体） 人工染色体（真菌、细菌）
常的精子受精，再在适当时间施以冷、热或高压等物理处理 ，使进入卵子内的精精子染色体加倍，而发育为完全为父本 性状的二倍体
首先将两个不同品系的近交系进 行杂交。 交配后，在精核与卵核尚未融合 之前，从母鼠子宫内冲取受精卵，
并用极细的吸管将精核去掉。
在细胞松驰素B的处理下使雌核
加倍，形成二倍体细胞。
目的染色体。
内容
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人工诱导多倍体
染色体显微操作技术 染色体介导的基因转移技术 人工染色体 雌、雄核发育
5
3染色体介导的基因转移技术
概念
将与特定基因表达有关的染色体 或染色体片段转入受体细胞，使该 基因得以表达，并能在细胞分裂中 一代又一代地转递下去。该技术称 为染色体介导的基因转移技术，又 称为染色体转导。
二倍体细胞在体外培养到囊胚期 后，移植到养母的子宫内，使胚胎 继续发育，直至出生。
雌核发育的意义
• 为生产单性种群提供了可能。 • 能迅速地产生同源型二倍体。 • 提供某些致死突变种的生物品质。 • 在农牧渔业生产中，可人工控制性别繁殖。 • 广泛地用于进行基因-着丝点的定位研究。 • 可利用产生新的纯系来筛选除去有害的等位基因 。
雄核发育的意义
• 雄核发育的个体的生存率非常低，这是由于精子 基因型的纯合性、卵子由于照射的损伤和阻止第 一次卵裂处理的损伤等原因造成的。 • 但是仍旧在遗传学基础理论和育种中都有一定的 价值，利用雄核生殖的精子可用于冷冻基因库， 保存种质资源，对基因世代克隆系的建立，不同 种间核质的杂种的产生和YY雄性引起的性别控制 等也有特殊的意义