生物检定法

SS误差
f
查F值表， 当F计算值大于P＝0.05或P＝0.01的查表值时，则P ＜0.05
或P＜0.01，即为在此概率水平下该项变异有显著意义。
5.方差分析(F检验)的步骤
建立检验假设：无效假设把处理间的方差μ12与误差的 方差假设相等即：H0：μ12=μ22 ；备择假设 HA： μ12≠μ22
令： R=PT/PS=dS/dT （1） （R为等反应效价的比值）
∴ PT= R·PS
（2）
求出R就可以求出PT
R=PT/PS=dS/dT （1）
（1）式两边取对数， lgR=lgPT/PS=lg(dS/dT)=lgdS-lgdT
令lgR=M, lgd=X, 则
对数效价比值：
lgR=M=lgdS-lgdT= XS-XT R=lg-1M= lg-1 (XS-XT) PT==R·PS=lg-1 M·PS 实际工作中S的剂量常按已知效价计 算，而T的剂量按标示效价或估计效 价（AT）来安排: PT= R·AT
1.什么是生物检定法？
待检药物 标准品
Leabharlann Baidu生物体
动物 组织 细胞 微生物
活性反应
被测物的相对效力
（效价或毒性）
有效性 安全性
2. 生物检定采用的实验方法
反映药品的生物 特异性和有效性 繁琐、误差大
类别
相对快速、重复性 好、不能反映药品 的生物特异性和有 效性
体内测定
(in vivo)
整体动物
体外测定
(in vitro) 离体器官、组织,微生 物, 酶和细胞
例如: 青霉素钠的效价为 1670 U/mg 庆大霉素的效价为 590 U/mg 洋地黄的效价为 10 U/mL
四.效价检定中的基本概念
（一）生物反应（生物检定的基础） （二）剂量与反应的关系 （三）等反应对比检定
（一）生物反应（生物检定的基础）
药物 胰岛素
肝素 抗生物 生物制品
生长激素
生物学定量法
AT是T的标示量或估计效价 PT是经检定的T的效价, 称“测得效价”
效价单位(效应浓度单位)
效价是表达药物效力强弱或活性物质含量的一种公 认的剂量单位。
效价单位（U）是衡量生物药物有效成分效力的具体尺度。
效价:用每毫升或每毫克中含有某种生物药物的效价单位数表 示药物效力或浓度单位 U/mg，U/mL
是指平均数的标准差, 即各均数之间差异的大小,用
SM表示,SM越小差异也越小。
会套用
七.生物统计知识 （实验设计及方差分析）
（一）实验设计的目的 （二）试验设计重要三原則 （三）生物检定常用实验设计 （四）实验可靠性检验（方差分析)
一.实验设计的目的
最少的代价获得最多的信息 可有效排除混杂变异对结果的影响 便于采用简化计算
(采用定型对称设计有利于有效性检验的简化)
2 某些有害杂质
限度检查
有害杂质限度检查
无菌、微生物限度、热原、细菌内毒素、 异常毒性、降压物质、过敏等 药典几百种
二 生物检定法的应用范围
4 中药质量控制
3 微量生理活性
物质测定
应用 范围
1 药物效价测定
2 某些有害杂质
限度检查
微量生理活性物质测定
一些神经介质，激素等微量生理活性物质，由于其很 强的生理活性，在体内的浓度很低，加上体液中各种物 质的干扰，很难用理化方法测定。
计算各处理组的方差及组内的方差，求出相应的F值。
计算所得的F值与F表中按一定自由度查得的F0.05或F0.01 进行比较
若处理组F＞F0.05（F0.01）则拒绝H0，接受HA，认为该处
理所引起的差异有显著（极显著）意义。
若处理组F＜ F0.05则接受H0，认为该处理所引起的差异
无显著意义。
而不少活性物质的生物测定法由于灵敏度高、专一性 强，对供试品稍作处理即可直接测定。
如乙酰胆碱，5-羟色胺等活性物质的测定。
二 生物检定法的应用范围
4 中药质量控制
3 微量生理活性
物质测定
应用 范围
1 药物效价测定
2 某些有害杂质
限度检查
中药质量控制
中药成份复杂，大部分中药的有效成份尚未 搞清，难以用理化方法加以控制，但可用一 些以其疗效为基础的生物测定方法来控制其 质量。
多组分生化药物制剂、激素类药物、生物制品: 由结构类似、而生物活性不同、比例不定的多种成份组 成，或其组分不明确、结构复杂，难用理化方法反映 其生物活性；
虽可用理化方法测定含量，但含量不能完全反映效价 （生物检定是反映产品质量的重要指标，具有专属性。 当前英国、美国及中国药典都有收载）
药典生物药物效价测定品种:
小鼠血糖降低法 小鼠惊厥法 家兔血凝时间法
微生物生长抑制法
动物保护力 活菌数和活病毒滴度
去垂体大白鼠体重法
（二） 剂量与反应的关系
生物反应类型
质反应：给药后,观察某一反应的某一程度出现 与否。如是否死亡、是否惊厥，是质的变化， 称质反应。
量反应：药物对生物体所引起的反应随着药物 剂量的增加产生的量变可以测量者,称量反应。
五 生物检定的常用方法
(一) 质反应的直接测定 (二) 量反应平行线测定法
六 生物检定的步骤
实验设计的选择 反应指标的测定 实验可靠性检验(方差分析) 相对效力的计算及可信限的估计
学习要求
特定的实验设计常用对称定型实验设计→看懂
生物统计方法常用定型公式或简算法计算→弄懂基本道理;
PT = R·AT
三.实验误差的估计（用可信限（FL）表示）
步骤： 误差项方差S2的计算 标准误SM的计算
可信限（FL）的计算
1.误差项方差S2的计算
S2=
(∑XS2 －
(∑XS)2
nS
)
+(∑XT2 －
(∑XT)2
nT
）
nS+ nT-2
nS、nT为标准品和供试品的反应个数
2.标准误SM的计算
如血压、血凝时间、血糖等。
剂量与反应的关系
某降压药： 剂量 降压作用 1μg 15mmHg 2μg 25mmHg 3μg 30mmHg
剂量与反应间一 般呈曲线关系
剂量与反应关系的直线化
剂量与反应间一 般呈曲线关系
将剂量取对数 (lgd)后可与反应
(y)成直线关系
生物检定中的剂量常用对数表示
R= PT/PS
等反应对比检定原理
对于量反应： ➢ S和T各自的对数剂量和反应应呈直线关系 ➢ S和T的两条直线应平行 S与T等反应时所对应剂量分别为：
lgdS= XS lgdT= XT M=lgdS-lgdT= XS-XT
等反应时: S和T中所含效价应相等，即：
dT·PT=dS·PS （S和T中所含效价单位数）
抗生素、细胞因子类、血液制品、疫苗、酶(含异构体)、 多肽激素(含异构体)。
肝素
天青A显色
比色法测定 ×
（但变性的肝素同时显色， 不能反应肝素活性）
所以: 肝素
抗凝血活性 √
二 生物检定法的应用范围
4 中药质量控制
3 微量生理活性
物质测定
应用 范围
1 药物效价测定
2 某些有害杂质
限度检查
药物效价测定
=
f
∑(yif
)2
f =n-1
自由度
3. 方差分析原理 组间变异
总变异
组内变异
S2总= S2处理 + S2误差
组间变异（处理效应）用组间方差表示； 组内变异（随机误差）用组内方差表示。
4 方差和F值计算方法
s2总= s2处理 + s2误差
SS总= SS处理 + SS误差
f总= f处理 + f误差
定量、半定量、定性 药品的生物效价、 安全检查、鉴别
3. 生物检定法特点
以药理学反应为基础 (定量药理学—剂量和反应的函数关系) 以标准品对比校验为手段
（在产生特定反应情况下，以供试品与标准品剂量比值推算供试品效价）
以生物统计学方法为结果判断的依据
真正的活性测定，与理化分析、蛋白结合试验不同； 但生物差异性大（实验误差大）、专业性强、实验 周期长，人力、物力消耗大，计算较繁。
2 随机区组设计
将分成8各区组（如来自8个窝的动物）的32个受试者随机分配到 A,B,C,D四个处理组各区组中的受试者被随机分配接受的不同处理
区组
一 二 三 四 五 六 七 八
处
理
A
B
C
D
1
4
3
2
5
6
8
7
10
9
12
11
16
14
13
15
19
18
17
20
23
22
21
24
28
27
26
25
30
31
29
32
采用特殊实验设计
(提高精度和灵敏度)
标准曲线法与量反应平行线4.4法测定 LMWH产品抗FXa效价比较
标准曲线法结果误差大,重现性差,波动大,缺乏可比性；当采 用量反应平行线原理的4·4实验设计,结合生物统计, 其结果较 平稳,误差小,重现性好。
二.试验设计重要三原則
重复 随机 对照
如：试验某种降压药物的降压作用： 将20只雄性大鼠随机分成两组，每组10只，一组 作为空白对照，一组给予待测药物。
第二节 质反应的直接测定
以产生质反应的最低效量(MED)为反应指标（y） 一. 测定程序
将实验对象随机分成两组，S组与T组，分别测定两组 的MED（最小效量）—— y值
计算出M、R和PT 估计实验误差（用可信限（FL）表示）
二.M和PT的计算
R= PT/PS=dS/dT
按公式计算出M，再求算R和PT： R=lg-1M
主要内容
第一节 概 述 第二节 生物检定质反应的直接测定法 第三节 生物检定量反应的平行线测定法 第四节 生物检定法的应用
第一节 概 述
一.生物检定法简介 二.生物检定的应用范围 三.标准品 四.生物检定中的基本概念 五.生物检定的常用方法 六.生物检定的步骤 七.生物统计知识
一 生物检定法简介
例：催产素生物检定法——大鼠子宫法
3.交叉实验设计
处理在同一受试对象上重复观察，由于处理是在同 体上比较，从而避免了个体差异。
动物编号 1
2
3
4
第一次
S
T
S
T
第二次
T
S
T
S
S为标准品组，T为供试品组 平衡实验次序的影响。把不同因素不同水平均摊于受试 对象，去除试验时间次序和试验次序的影响
例:小鼠血糖法测定胰岛素效价
三.生物检定常用实验设计
完全随机化设计 随机区组设计 交叉实验设计
1 完全随机化设计
将10个观察对象随机分为两组：
动物号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 随机号 1 2 0 3 8 7 4 5 9 6 组别 甲 乙 乙 甲 乙 甲 乙 甲 甲 乙
单号为甲组，双号为乙组
例：洋地黄效价测定——鸽最小致死量(MLD)法
生化药物
肝素、胰岛素、缩宫素、绒促性素、硫酸鱼精蛋白、 精蛋白锌胰岛素、卵泡刺激素、黄体生成素、降钙素、 生长激素、升压素等21个品种（约占我国生化药的 10% ）
抗生素 生物制品
菌苗、疫苗、抗毒素、类毒素等
二 生物检定法的应用范围
4 中药质量控制
3 微量生理活性
物质测定
应用 范围
1 药物效价测定
（三）等反应对比检定**
（相对效力的计算）
将药物的供试品（T）和已知效价的标准品（S）对生物体 进行同时对比，以对T的效价（或毒力）进行检定的方法。 属于对比检定。
S— dS （标准品剂量）； PS （标准品效价） T— dT （供试品剂量）； PT （供试品效价）
常以产生等反应时的效价比值R得出
四 方差分析(F检验)
1. 方差分析的概念
用于推断多个总体均数有无差异(差异显著性)的检 验方法
如： 观察四种降压药对大鼠的降压效果 或观察四个剂量的降压药对大鼠的降压效果
2.方差S2 ：
是测量值在其总体均值周围分布状况的一种量度， 方 差表征随机变量分布的离散程度。
差方和SS
离均差
SS
方差S2 =
控制生物差异性的方法与措施:
生物来源、饲养或培养条件必须均一。 采用特定的实验设计,对影响实验误差的条件和
因子进行限制,减少实验误差。 用生物统计方法提高实验的可靠性。
4. 生物检定的必要性
多组分生物药物无适当理化方法进行检定； 理化方法不能反应其活性。
为理化分析的补充
多组分、组分不明确、组成不定、结构不清楚的药物
s2总= SS总/f总； s2处理 =SS处理/ f处理
SS误差=SS总－SS处理 f误差= f总－ f处理
s2误差=SS误差/ f误差
方差分析（F检验）:
以处理组方差(S2)与误差项方差（S2（误差））的比 值（称F值）来确定处理效应差异的显著性程度。
SS处理
处理效应方差S2
f
F值=
=
误差项S2
三 标准品与供试品及其表示
标准品（S）：系指用于生物检定中效价测定 的标准物质，以效价单位(U)表示。 PS表示S的效价
国家标准品：系指用国际标准品标定的用于定 量测定某一制品效价或毒性的标准物质，其生 物活性以国际单位（IU）或以单位（U）表示。
供试品（T）
供试品(T)是供检定其效价的样品,它的活性成分应 与标准品基本相同。