基因克隆及常见问题分析
大白菜BrANT基因克隆及功能分析
大白菜BrANT基因克隆及功能分析大白菜BrANT基因克隆及功能分析引言大白菜（Brassica rapa L. ssp. pekinensis）是我国重要的蔬菜作物之一，具有较高的经济和营养价值。
然而，在种植大白菜的过程中，常常会受到多种生物和非生物胁迫的影响，导致产量和质量的下降。
了解大白菜对胁迫的反应机制对于提高抗逆性和品质改良具有重要意义。
BrANT基因作为转录调控因子，在植物对胁迫的应答过程中发挥着重要的作用。
本文旨在通过大白菜BrANT基因的克隆及功能分析，深入探究大白菜的逆境响应机制。
方法1. 大白菜BrANT基因的克隆我们首先利用大白菜转录组数据进行广泛的搜索，筛选出与转录因子相关的基因。
在此基础上，我们采用PCR方法进行BrANT基因的克隆。
首先设计一对特异性引物，然后利用大白菜的基因组DNA作为模板进行PCR扩增。
扩增产物经过电泳分离后，将目标片段进行提取纯化。
最后将纯化的DNA片段进行测序，验证所得片段是否为BrANT基因。
2. 大白菜BrANT基因的功能分析为了了解BrANT基因的功能，我们利用遗传转化技术将该基因导入拟南芥（Arabidopsis thaliana）中。
首先将BrANT基因的开放阅读框序列插入到植物表达载体中，然后通过农杆菌介导的转化方法将该载体转化到拟南芥中。
经过筛选后得到对BrANT基因进行过表达的转基因拟南芥植株。
接下来，我们对转基因和野生型拟南芥进行对比研究，探究BrANT基因在抗逆性方面的作用。
我们首先进行温度胁迫实验，将拟南芥植株暴露在40℃的高温条件下。
观察两组植株的生长情况、叶片形态和气孔开闭情况，分析BrANT基因的过表达是否改变了植物的热耐性。
此外，我们还进行干旱胁迫实验，通过控制水分供应来模拟干旱环境。
观察植株的叶片相对含水量、生长势和鲜重干重比等指标，评估BrANT基因在植物的耐旱性中的作用。
结果与讨论经过克隆和测序验证，我们成功获得了大白菜中的BrANT基因序列。
克隆常见问题指南
克隆常见问题汇总指南评价连接反应效率评价连接酶活性连接成功转化问题连接不成功连接酶失活连接酶有活性DNA 质量差DNA 末端不兼容克隆用内内切酶错误载体和插入片段均未磷酸化PCR 产物酶切不充分平末端化不充分酶污染载体自身环化载体酶切不完全非特异PCR产物被克隆酶污染抗生素浓度过低卫星克隆PCR 引物序列错误UV 损伤DNA 片段PCR 扩增保真性低详细叙述转化0.1ng的超螺旋载体DNA检测感受态细胞的转化效率。
通常情况下，感受态细胞转化产量至少为1x106转化子/ug超螺旋DNA，相当于0.1ng质粒DNA转化可能产生100个克隆。
1.1.2、T4DNA连接酶降低转化效率转化之前，用氯仿萃取或离心柱纯化使T4DNA连接酶失活。
1.1.3、连接酶没有热失活热失活连接酶可增加转化子产量。
1.1.4、转化时连接混合物过量每50ul感受态细胞最多可转化5ul连接混合物。
1.1.5、大肠杆菌无法忍受克隆的序列检查目标序列是否含有大肠杆菌强启动子或其他可能的毒性元件和反向重复等。
如果克隆基因表达产物对宿主有毒，需选择极低表达背景的启动子和使用低拷贝克隆载体。
1.1.6连接反应的连接酶过量根据载体和外源片段的浓度，选择说明书推荐用量的连接酶。
确保DNA无污染（如过量盐、EDTA、蛋白、酚等），否则会抑制连接效率。
连接前建议凝胶纯化载体和插入片段。
1.2.2、凝胶切割回收时，DNA被UV光损害凝胶切割回收DNA时请选用长波长的(UV360nm)切胶仪。
如果使用短波长的(254-312nm)切胶仪，需要缩短DNA在UV光下的曝光时间（几秒钟）。
UV光照射时，需将凝胶置于玻璃或塑料平板上。
此外，选择可见光染料可在普通光下观察标准琼脂糖凝胶中的DNA。
采用琼脂糖凝胶电泳检测载体的切割效率。
如果载体很难完全切割，可用胶回收试剂盒从凝胶中回收线性化的载体片段。
如果PCR反应有非特异性PCR产物或引物二聚体产生，需凝胶纯化目标PCR产物。
辣椒抗性基因克隆及分析研究
辣椒抗性基因克隆及分析研究辣椒是我国常见的食用农作物之一，在多个菜系中都有重要地位。
它既可以做成火锅底料，也可以拌凉菜、炒菜、腌菜等等。
因此，辣椒在我国的经济价值和文化价值都不可忽视。
然而，和其他植物一样，辣椒也面临着很多问题，如病害、虫害和环境压力等等。
提高辣椒的产量和品质、减少损失已成为研究者关注的问题。
抗性是防御外界侵害的一种重要机制，能够保护作物免受各种生物和非生物因素的危害。
因此，研究辣椒的抗性机制和抗性基因有着重要的意义。
一、辣椒抗性机制辣椒的抗性机制比较复杂，既包括植物体内的生物化学反应，也包括外部环境的因素。
其中，主要涉及到受体的激活、信号传递和基因表达的改变等环节。
具体来说，辣椒感知到外界的因素后，会启动一系列生物化学反应，激活一些信号分子。
这些信号分子会通过信号传递通路，最终导致一些关键基因的表达发生变化，从而提高辣椒对外界环境的抵抗力。
例如，辣椒中的黄酮类物质可以通过改变细胞膜的结构而减轻环境压力的影响；辣椒中的抗氧化物质可以合成并稳定自由基，从而减少外部环境对植物的损害；辣椒中的抗性蛋白则可以识别和结合外部环境的因子，从而启动一些保护机制。
当然，这些机制之间也存在相互作用和调节，形成了一个复杂的生物系统。
二、辣椒抗性基因克隆基因是控制生命活动的基本单位，可以通过基因的调控来实现对生物表现型的控制。
学术界广泛认为，观察某一种生物的基因表达，可以揭示其基因结构和调控机制，从而更好地理解其生理和生化过程，以及相应的功能。
在辣椒中，研究人员发现了一些重要的抗性基因，例如WRKY、MYB、bHLH、NAC等等。
这些基因编码的蛋白质在植物抗性机制中起到了重要的作用。
随着分子生物学技术的不断发展，辣椒的抗性基因也得以逐步克隆和分析。
例如，研究人员通过PCR、RT-PCR、RACE、CRISPR等技术成功地克隆了一些关键的辣椒抗性基因。
这些基因不仅提供了揭示辣椒抗性机制的重要材料，还为植物遗传改良和种质资源保护奠定了基础。
克隆策略复习题及答案.doc
克隆策略复习题及答案一、填空题1.克隆策略有三层含义：① 采用什么样的技术路线将目的基因中克隆出来；②用什么方法将目的基因同载体连接；③通过什么方法将体外连接的DNA分子导入适当的受体进行扩增或表达。
2.假定克隆一个编码某种蛋白质的基因，必须考虑其表达的三个基本条件：①保持正确的可读框；②能够使其转录的启动子；③具有翻译的起始和终止信号。
3.现有的基因克隆策略大体上分为四类：功能克隆、定位克隆、表型克隆、电子克隆。
4.受体细胞的感受态是接受外源DNA的生理状态。
5.DNA重组连接的方法大致分为四种：①黏性末端连接；②平末端连接；③同聚物加尾连接；④接头/连接子连接。
6.将含有外源基因组一个酶切片段的质粒称之为含有一个基因组DNA克隆，各种此类质粒的集合体称之为构建了一个基因组DNA文库。
7.将含有一个mRNA的DNA拷贝的克隆称作一个cDNA克隆,源于同一批RNA制备物的克隆群则构建了一个cDNA文库。
8.在构建cDNA克隆之前，可以用差示杂交来富集一特殊的核昔酸序列。
做法是：用来自于能够产生目的蛋白的细胞mRNA分子同来自于另一类型细胞（不产生这种蛋白质，但亲缘关系密切）的过量mRNA 分子杂交。
9.一旦克隆了一个遗传定位的基因，就可以用染色体步移技术来鉴定基因组DNA文库中与之相邻的基因克隆。
10.只要知道基因组中某一特定区域的部分核昔酸组成，用聚合酶链式反应（PCR）可以将这段DNA进行百万倍的扩增。
11.SD序列是mRNA分子中同核糖体RNA结合的序列，其结构特征是AGGAGG的全部或一部分。
12.环状质粒的转化效率很低，通常是线性双链DNA转化效率的1% o13.cDNA技术是进行真核生物基因克隆的一种通用方法，因为它可以用mRNA为模板，通过反转录合成一个双链的、无内含子的基因，因而有利于在原核细胞中进行功能表达。
14.产生平末端的方法通常有：①平切的酶；②S1核酸酶切除黏性末端；③DNA聚合酶补平黏末端。
DNA片段的克隆及常见的问题
TA克隆载体简介 TA克隆载体简介
新开发的快速、高效PCR产物克隆的专用载体 新开发的快速、高效PCR产物克隆的专用载体 PCR
pCF-T：TA快速克隆载体 ： 快速克隆载体 pCF-Blunt：多克隆位点为平端，不带T，，其他序列与pCF-T 相 ：多克隆位点为平端，不带 ，，其他序列与 ，，其他序列与 适合平末端DNA片段快速连接 同，适合平末端 片段快速连接
主要内容
DNA克隆简介 克隆简介 DNA克隆的操作步骤 克隆的操作步骤 DNA克隆常见问题及解决方案 克隆常见问题及解决方案
TA克隆的流程 克隆的流程
I.高纯度的基因资源
杂交筛选或PCR扩增目的基因 II.杂交筛选或 扩增目的基因
III.目的基因的纯化 III.目的基因的纯化 IV.目的基因与T载体的连接、 IV.目的基因与T载体的连接、转化 目的基因与 V.目的基因的筛选及鉴定 V.
• •
根据Marker的量及其荧光的强弱，可大致对检测的DNA 根据Marker的量及其荧光的强弱，可大致对检测的DNA Marker的量及其荧光的强弱 样品进行定量。 样品进行定量。 使用此法还有一个突出优点， 使用此法还有一个突出优点，即它可令操作者直观地获 悉所检测DNA样品的完整性及其大小。 悉所检测DNA样品的完整性及其大小。 DNA样品的完整性及其大小
反应体系 目的PCR 片段 目的 对照插入片段（ 对照插入片段（700 bp, 50 ng/µl） ） pBS-T载体 载体 Ligase 10×Ligation Buffer × 无菌去离子水 2 – 7 µl —— 0.5-1 µl 0.5-1 µl 1 µl 补足到10 补足到 µl 阳性对照 —— 1 µl 0.5-1 µl 0.5-1 µl 1 µl 补足到10 补足到 µl
分子克隆实验技术的使用中常见问题
分子克隆实验技术的使用中常见问题分子克隆技术是一种常用的实验技术，被广泛应用于分子生物学研究、基因工程以及生物医学等领域。
然而，在使用分子克隆技术进行研究或实验的过程中，常常会遇到一些问题。
本文将就分子克隆实验技术的使用中常见问题进行探讨，希望能帮助读者更好地应对这些挑战。
问题一：选择合适的克隆载体在进行分子克隆实验之前，选择合适的克隆载体是非常重要的一步。
克隆载体通常是一种容易携带外源DNA片段的可重复扩增的质粒或噬菌体。
然而，在选择合适的克隆载体时，需要考虑多个因素：1. 大小：载体的大小要适中，不宜过大或过小。
过大的载体可能导致操作不便、扩增困难，而过小的载体则可能限制载入的外源DNA片段的大小。
2. 复制起源：克隆载体应该具有一个可靠的复制起源，这样才能确保在细胞中稳定复制。
3. 选择标记：载体通常会带有一些标记基因，例如抗生素抗性基因。
在使用克隆载体进行实验时，选择合适的标记基因很重要。
问题二：限制性内切酶消化反应优化限制性内切酶消化是分子克隆实验中的重要步骤，用于切割DNA，生成所需的片段，并为之后的操作提供合适的DNA末端。
在进行限制性内切酶消化反应时，常见问题包括：1. 酶切位点不兼容：选择合适的限制性内切酶对于成功完成限制酶切非常重要。
如果酶切位点与目标DNA不兼容，将无法成功进行酶切。
2. 消化条件优化：酶切反应的条件包括酶切酶的浓度、反应温度、反应时间等。
为了获得理想的酶切效果，有时需要进行反应条件的优化。
3. 反切和星切现象：反切是指限制性内切酶在不应该切割的位点上产生切割作用，而星切是指一个酶切酶在DNA样品中的多个不同位点发生非特异性切割。
这些现象可能影响目标DNA片段的纯化和选择。
问题三：插入片段的PCR扩增在分子克隆实验中，为了获得目标DNA片段，常常需要进行PCR扩增。
然而，PCR扩增过程中可能会遇到以下问题：1. 扩增特异性：选择合适的引物是 PCR 扩增的基础。
DNA重组-载体构建常见问题及解决方法
载体构建中常见问题及解决方法重组质粒构建是常用的分子生物学手段，是研究相关分子及蛋白功能的基础，是生化分子实验中最基本的方法，但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。
下面我总结一下自己的经验，以期能为虫友们提供借鉴，希望多少给大家一下借鉴。
所涉及内容如下：1)克隆基因的酶切位点问题2)目的片段的扩增3) 载体酶切的问题4) 连接片段浓度比的问题5）菌液的提取6）酶切鉴定7）表达鉴定一、克隆基因的酶切位点问题1、克隆位点选择的问题。
首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。
然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。
双酶切时尽量选择酶切温度相同，buffer一致，双酶切效率高的两个内切酶，二者最好是您实验室常用的酶。
2、保护碱基数目的问题。
在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。
但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。
这种忽视可能会大大影响后续的实验进展。
参考常用的酶切位点保护碱基，选择酶切时间短且酶切效率高的碱基数。
注释：1．如果要加在序列的5‘端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的5’端加上相应的碱基（黑色），相同如果要在3‘端加保护碱基，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的3’端加上相应的碱基（黑色）。
2．切割率：正确识别并酶切的效率3. 加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基二目的片段的扩增目的片段扩增失败的原因和可采取措施：1）无条带：引物设计错误，找人帮忙看看引物设计是否合理；退火温度不合适，设置梯度，选择最合适的退火温度；2）条带不单一：引物不特异，适当增长或引物序列长度；3）出现引物二聚体，适当提高退火温度或者重新设计引物。
三载体酶切的问题酶切效率直接影响后续实验的成功率，酶切过程的注意事项：1）酶切质粒浓度和纯度要好2）酶切温度和时间，如果两个酶的最适温度不同，建议单酶切，回收后在用另一个酶切，时间最好过夜切四连接片段浓度比的问题1）连接比例的确定：上一步酶切产物回收后，用琼脂糖凝胶电泳比较载体和目的片段的亮度，确定体积比，一般载体：片段=1:3~1:5；2）连接时间和温度：现在很多连接酶都比较高效了，室温2个小时就可以了，如果后续实验检测阳性克隆较少，可采用16℃过夜连接提高连接成功率；3）未避免后续菌落PCR的假阳性情况，建议连接转化时做对照组：酶切后的载体做自连接对照，如果对照组与实验组长出的克隆数相差不大则很可能存在载体自连或者没完全切开的情况，建议先不要做后续验证，重新从酶切开始，增加酶量及酶切时间、适当减少所切载体的量、改变连接比等；如果对照组没有克隆形成或鲜有克隆形成，则可继续进行后续验证。
大学基因工程题库及答案
大学基因工程题库及答案基因工程是一种利用分子生物学技术对生物体的基因进行操作和改造的科学。
以下是一些大学基因工程的题目和答案示例：1. 题目：简述基因工程的基本步骤。
答案：基因工程的基本步骤包括：(1) 目的基因的获取；(2) 载体的选择与构建；(3) 目的基因与载体的连接；(4) 转化受体细胞；(5) 筛选含有重组DNA的细胞；(6) 目的基因的表达与检测。
2. 题目：什么是基因克隆？请说明其在基因工程中的重要性。
答案：基因克隆是指将特定的DNA片段插入到载体中，然后在宿主细胞内进行复制和表达的过程。
基因克隆在基因工程中的重要性体现在：(1) 允许科学家研究和分析特定基因的功能；(2) 可用于生产药物和疫苗等生物制品；(3) 有助于理解基因表达的调控机制。
3. 题目：PCR技术在基因工程中的应用是什么？答案：聚合酶链式反应（PCR）技术在基因工程中的应用主要包括：(1) 快速扩增目的基因，为基因克隆和表达提供足够的DNA模板；(2) 用于基因突变的检测和分析；(3) 制备单链DNA模板，用于DNA测序；(4) 用于基因表达分析，如定量PCR。
4. 题目：转基因生物的安全性问题主要包括哪些方面？答案：转基因生物的安全性问题主要包括：(1) 环境安全性，即转基因生物可能对生态系统产生的影响；(2) 食品安全性，即转基因食品对人体健康的潜在影响；(3) 生物安全性，即转基因生物可能对非目标生物产生的影响。
5. 题目：基因编辑技术CRISPR-Cas9的原理是什么？答案：CRISPR-Cas9基因编辑技术的原理是利用一种来自细菌的RNA导向的核酸酶系统。
该系统由两部分组成：(1) 一段小RNA （sgRNA），它能够特异性地识别目标DNA序列；(2) Cas9蛋白，一种核酸酶，能够在sgRNA的引导下精确地切割目标DNA。
通过这种机制，科学家可以在特定的基因位点进行切割，实现基因的敲除、插入或替换。
6. 题目：基因治疗的基本原理是什么？答案：基因治疗的基本原理是将正常或修正后的基因导入到患者的细胞中，以补偿或修复缺陷基因的功能。
克隆技术及伦理问题分析
克隆技术及伦理问题分析克隆技术作为一项引人瞩目的科学成果，引发了广泛的讨论和争议。
它不仅有着潜在的医学和科学上的应用，还涉及到了伦理和道德的问题。
在本文中，我们将对克隆技术及其相关的伦理问题进行深入分析。
首先，我们需要了解克隆技术的定义和原理。
克隆技术是指通过人工手段复制出具有相同基因组的生物体。
目前，主要有两种克隆技术：胚胎克隆和体细胞克隆。
胚胎克隆是将一个成熟个体的细胞核移植到一个没有细胞核的卵细胞中，再将该卵细胞发育成胚胎。
体细胞克隆则是将一个成熟个体的细胞核转移到另一个个体的卵细胞中，使其发育成一个和捐赠细胞拥有相同基因组的生物体。
克隆技术在医学和科学上具有巨大的潜力。
它可以为疾病的治疗提供新的方法。
比如，克隆技术可以用于治疗某些疾病，如癌症、心脏病等，通过克隆患者自己的细胞，可以获得可供移植的器官和组织。
此外，克隆技术还有助于疾病的研究和药物的开发，通过克隆动物模型可以更好地了解疾病的发生机制和寻找治疗方法。
然而，克隆技术也引发了一系列的伦理问题。
首先，克隆技术涉及到破坏胚胎的问题。
在胚胎克隆过程中，为了获得胚胎和胚胎干细胞，通常需要牺牲一部分胚胎。
这引发了对胚胎和人类生命的尊重和保护的争议。
有人认为，胚胎是具有生命的，应该受到保护；而有人则认为，胚胎只是一团细胞，还没有形成一个完整的个体，因此并不具备与已经出生的人类同等的地位。
此外，克隆技术还带来了关于个体身份和人类多样性的问题。
通过克隆技术，可以复制出具有相同基因组的个体。
这引发了对个体身份和个性特征的认同和区分的讨论。
如果每个人都可以选择通过克隆技术复制自己或他人，那么人类社会将失去多样性和独特性。
这对于社会的可持续发展和文化的多样性可能会带来一定的负面影响。
此外，克隆技术还可能引发遗传上的问题。
由于克隆个体拥有相同的基因组，他们在抵御疾病和适应环境方面可能面临着相似的挑战。
这可能导致基因缺陷和易感性疾病在整个群体中的传播和扩散。
植物抗病性状关键基因的克隆及功能分析
植物抗病性状关键基因的克隆及功能分析植物的抗病性状是保持健康的重要途径。
许多研究表明，植物的免疫响应与特定的基因有关。
在最近的研究中，研究人员已经克隆了一些植物抗病性状的关键基因，并对它们进行了功能分析。
本文将探讨这些研究的进展和意义。
一、克隆关键基因研究人员通过利用系统发育学、转录组学等手段，克隆了许多与植物抗病性状相关的基因。
例如，研究人员克隆了拟南芥的RPS5基因，它是拟南芥抗菌性的主要基因之一。
当拟南芥感染革兰氏阴性菌Pseudomonas syringae时，RPS5基因会激活拟南芥的免疫反应，使其产生一种叫做PAMPs的抗病物质。
具有RPS5基因的拟南芥在受到Pseudomonas syringae的侵染时能够快速抵抗病原体，从而减少了植物的损失。
此外，还有一些其他的关键基因被克隆了出来。
如拟南芥的EDS1和PAD4基因，这两个基因在植物抗病反应中发挥了重要作用。
EDS1和PAD4在植物免疫反应的前线，调控着植物抗病反应中的许多关键基因，从而增强了植物的免疫能力。
二、功能分析研究人员通过功能分析揭示了植物抗病基因在免疫响应中的作用机制。
例如，在拟南芥的抗病性中，RPS5基因的激活能够诱导许多免疫反应的基因，促进植物产生抗病物质。
这些抗病物质可以诱导一系列转录因子的激活，从而增强植物免疫反应。
此外，在MOI1基因的研究中，研究人员发现 MOI1 参与调控 E3 Ligase RING-BOX1（RBX1) 的 Ub 结合活性及其对 PAD4和EDS1的泛素化，从而激活 PAD4 和 EDS1 的活性。
这表明了 MOI1 在调节植物抗病性中的重要作用。
三、意义与展望研究植物抗病基因的意义在于提高植物抗病能力，减少病害对植物生长和产量的损失。
未来，研究人员将继续探索植物抗病性状的分子机制，同时，通过基因编辑技术和基因组学方法，研究人员可以设计出更具抗病性的作物品种，以满足人们对食品的需求。
质粒基因克隆的方法和技巧
质粒基因克隆的方法和技巧生物学家们研究基因时，常常需要将基因从一个组织或生物体中分离出来，然后运用各种技术手段进行克隆。
其中，质粒基因克隆是最常用的一种手段。
本文将介绍一些常见的质粒基因克隆方法和技巧。
一、PCR扩增PCR（聚合酶链反应）是一种常用的DNA扩增技术，可在几小时内扩增出数百万甚至数十亿份DNA拷贝。
PCR反应通常由DNA模板、DNA聚合酶、引物和反应缓冲液等组成。
其中DNA模板可以是基因组DNA、质粒DNA或cDNA（反转录产生的DNA）；引物是一对设计合理的寡核苷酸序列，各自与要扩增的DNA段的两端互补，引导DNA聚合酶合成新的DNA链。
反应缓冲液含有适当的离子（如Mg2+），保证酶的活性和DNA合成。
PCR扩增是质粒基因克隆的第一步，可以得到需要的DNA段。
这个DNA段可以在后续步骤中被克隆到质粒中。
二、限制性内切酶消化限制性内切酶是一类能够识别DNA上特定序列并切割其连接键的酶。
限制性内切酶消化是质粒基因克隆中的关键步骤之一，可用于选取需要的DNA段，并在质粒和外源DNA上留下相应的黏状末端，使其能够在后续步骤中进行连接。
限制性内切酶有很多种类，每种连接序列的位置和方式都不同。
常用的限制性内切酶包括EcoRI、BamHI、HindIII等。
在实验中，首先选取合适的限制性内切酶，然后将其加入到PCR扩增产物中，使其消化产生需要的DNA段。
三、DNA连接DNA连接是质粒基因克隆的核心步骤之一，它将PCR扩增产物和质粒按照一定的条件进行连接。
DNA连接的实验操作需要注意以下几点：1. 选择合适的连接酶连接酶有很多种类，如T4 DNA连接酶、冷冻鱼精 DNA连接酶等，不同的连接酶对序列的选择和理化条件有一定的依赖性。
一般情况下，选用经典的连接酶T4 DNA连接酶进行连接，使用较为广泛。
2. 确定连接工艺连接工艺包括单一限制性内切酶连接、双酶连接和No-vector 连接等。
单一限制性内切酶连接指只有PCR扩增产物和质粒中各有一段被同一限制性内切酶切割的DNA序列，这样就形成了两端互补的黏状末端，易于连接；双酶连接指使用两种限制性内切酶切割PCR扩增产物和质粒，可获得更高的连接效率；No-vector连接指切不含选择标记的空质粒，使PCR产物和空质粒直接连接，省去了其他操作。
TA克隆常见问题及解决方案
TA常见问题分析及其解决方案问题可能的原因建议1 转化后无菌产生转化过程有问题或感受态细胞失活可通过转化pUC18/19等未切割的可用于抗性筛选的质粒，检测感受态细胞的转化效率和转化操作是否正确插入2 对照DNA片段的阳性率低10×快速连接缓冲液稀释不当提供的T4 连接酶缓冲液为十倍浓度，10μl 反应体积加1μl T4 连接酶缓冲液连接反应存在问题连接缓冲液只有低的活性。
10×快速连接缓冲液含有ATP，温度波动ATP 易降解。
使用一次性分装的缓冲液，避免其反复冻化通过凝胶比较连接的和未连接的DNA 片段并检查分子量标准DNA 片段是否被连接成高分子量的片段，用大约20ng DNA 分子量标准（如Lambda DNA/Hind III 分子量标准）建立一个连接反应以检测连接酶及缓冲液的活力3 T 突出端丢失，引起载体平端连接，因而蓝色菌落数高于白色菌落数避免核酸外切酶的引入，降解T 突出端。
只使用无外源核酸酶的T4 连接酶插入片段与插入对照DNA相比，白色菌落的比例低。
如果使用的感受态细胞的转化效率很高（≥1 × 109 cfu/µg DNA），则是连接反应存在问题如果使用1×109 cfu/µg DNA 的感受态细胞，用试剂盒中的阳性对照进行连接实验，白色菌落的比例应为70－90％。
如连接反应没有优化或失败，虽然转化的总菌数很高（≥1×109 cfu/µg DNA 感受态细胞可获得高至300 个菌落），但白色菌落很少或没有。
参见以上“连接反应存在问题”中的建议对策采用插入对照DNA片段，连接转化时白色克隆菌数低于60％。
10×快速连接缓冲液稀释不当提供的T4 连接酶缓冲液为十倍浓度，10μl 反应体积加1μl T4 连接酶缓冲液T 突出端丢失，引起载体平端连接，因而蓝色菌落数高于白色菌落数。
避免核酸外切酶的引入，降解T 突出端。
克隆技术的原理及利弊分析
克隆技术的原理及利弊分析
克隆技术是一种基因工程技术，通过将一个个体的DNA复制并植入到另一个个体中，实现无性繁殖和复制个体的目的。
其主要原理是通过取出供体个体的细胞核，将其植入到受体个体的卵细胞中，然后刺激卵细胞进行分裂和发育，最终得到与供体个体基因完全相同的克隆个体。
克隆技术的利益包括：
1. 基因复制：克隆技术可以完全复制一个个体的基因，确保后代具有与原始个体完全相同的基因组，有助于保留珍稀物种或优良品种。
2. 医疗用途：克隆技术可以用于医疗领域，如制造组织器官或治疗疾病。
3. 科学研究：克隆技术可以帮助科学家更好地研究基因功能、疾病发生机制等。
然而，克隆技术也存在一些弊端：
1. 生命伦理问题：一些人对克隆技术存在道德和伦理上的担忧，认为克隆可能破坏自然生态平衡，侵犯生命权等。
2. 基因稳定性问题：克隆技术在基因复制过程中可能会引入突变，导致克隆个体的基因不稳定，存在健康隐患。
3. 社会问题：应用克隆技术可能引发社会问题，如个体身份认证、家族关系的模糊化等。
综上所述，克隆技术有其一定的利益和潜在的弊端，应在科技发展和伦理审慎的前提下加以合理应用。
有关克隆等生物学问题答疑
老师答疑问：克隆得到的生物与母体细胞中的DNA相同吗？线粒体中的基质和细胞质基质一样吗？答：克隆得到的生物DNA与母体一样，线粒体的基质与细胞质的基质不一样。
问：一只母鸡原来生过蛋，后来不生了，变成了公鸡，它是否能和别的母鸡产生下一代，它体内的染色体组成是否会改变呢？答：即使变成了能生育的公鸡，其体内的染色体组成不会改变。
问：炼钢工人处于高温环境中，身体大量排汗是为了（散发热量），以维持（体温）的恒定，大量的排汗又使人体丢失了（水）和（钠离子），从而使细胞内环境的渗透压变（高），PH 值变（低）。
影响正常的生命活动，因此要及时饮用盐汽水。
问：为什么是钠离子，而不是无机盐？为什么渗透压变高？为什么PH降低？答：在正常情况下，细胞不断的吸钾排钠，所以在细胞外液中阳离子以钠离子为主。
机体失水以后，细胞内液中离子浓度上升，故渗透压提高。
请问：如何计算染色体、染色单体和DNA分子在有丝分裂中的数目呢？答：数染色体，只要数着丝点，有几个着丝点，就有几条染色体。
染色体经过复制后，每条染色体就有两条染色单体组成，所以，从间期染色体复制后染色单体形成，一直到后期着丝点分裂前，一条染色体就有两条单体组成，而着丝点分裂以后，染色单体数就为0。
一条染色体在没有单体的情况下，就包含一个DNA分子，而在有单体存在的情况下，一条染色单体就包含一个DNA分子，此时的一个染色体就有两条DNA分子组成。
问：高尔基体是双层膜还是单层膜？答：从中学的教材来理解的话，高尔基体是单层膜结构，但在有一些参考书上认为它是双层膜结构。
a-ice问：若线粒体和叶绿体可用内共生假说解释，那么细胞核也是这样吗？核孔又是如何形成的？答：随着电子显微技术和分子生物学研究的进展，有不少证据支持线粒体和叶绿体内共生假说，但是到目前为止仍没有证据能说明细胞核是内共生而来。
在真核细胞起源上，有许多科学家支持质膜内褶而形成，认为真核细胞是由原核细胞通过变异和自然选择进化而来，真核细胞中细胞核是由质膜内褶而形成，祖先原和细胞质膜发生内褶扩大了代谢面积，这种有利的变异被自然选择所保留、累积，最后进化成真核细胞。
克隆技术及其伦理问题探讨
克隆技术及其伦理问题探讨克隆技术，作为现代生物科技的重要一环，引发了广泛的讨论和争议。
克隆技术是指通过人工手段复制一个有机体，使其基因与原有生物完全相同。
克隆技术的发展具有重大的科学意义和潜在的应用价值，但同时也引发了一系列伦理问题。
首先，克隆技术引发的伦理问题之一是人的自由与尊严。
人类的个体身份和独特性是我们所珍视的。
当克隆技术被广泛应用的时候，可能会导致大量相互之间基因相同的个体的出现。
这意味着人类失去了个体间的差异性，我们的自由选择和自由意志也将受到限制。
此外，克隆技术还可能使个体与自己的克隆之间产生心理和情感上的困扰，因为克隆与原始个体有着相同的外貌和基因。
第二个伦理问题是与克隆技术相关的社会和经济影响。
尽管克隆技术在某些情况下可能有很大的应用前景，例如治疗某些罕见病或拯救濒危物种等，但克隆技术也可能由于其昂贵的成本对社会造成不公平。
只有富人才能够承担克隆技术可能带来的高昂费用，这将进一步加剧社会阶层的划分。
此外，克隆技术也可能导致一些道德和道德困境，例如基因修改、优生学等方面的争议。
第三个伦理问题是克隆技术对基因多样性的影响。
基因的多样性对种族的生存和繁衍至关重要。
然而，克隆技术对基因多样性产生了不可逆转的影响，因为克隆的个体与原始个体拥有完全相同的基因。
这将会削弱人类整体的基因多样性，使人类更加容易受到环境变化和新出现的疾病的威胁。
此外，克隆技术还可能引发道德和法律上的问题。
例如，克隆技术可能导致个体人的人格权利受到侵犯，因为一个个体的克隆可能与原个体共享同样的人格权利。
这可能导致道德和法律之间的冲突，以及对个体权利和责任的重新定义。
为了解决克隆技术所引发的伦理问题，我们需要制定相关的法律和道德准则来规范和监督克隆技术的应用。
这些准则应包括限制克隆技术的使用范围，保护个体的自由和尊严，确保公平的社会分配，保护基因多样性，并确保克隆技术不会违反个体的人格权利。
此外，教育和公众宣传也是解决克隆技术伦理问题的关键。
耐药性基因的克隆和功能分析
耐药性基因的克隆和功能分析近年来，将基因从生物体中克隆出来并进行功能分析成为了生物学研究的重要手段。
其中，耐药性基因的克隆和功能分析更为重要。
随着抗生素的广泛使用和滥用，各种细菌对抗生素的耐药性越来越严重，甚至出现了多重耐药的菌株。
因此，研究菌株的耐药机制，进行耐药性基因的克隆和功能分析，对于设计和开发新型抗生素具有重要意义。
1. 耐药性基因克隆的主要方法目前，耐药性基因克隆的主要方法有限制性酶切和反转录聚合酶链反应（RT-PCR）等。
限制性酶切法是利用特定的限制性酶切酶在基因序列中特异性切割，将目标基因从源片段中割离出来。
限制性酶切方法操作简单，其主要优点是可以保持基因的原始信息和组织，不会产生基因异构体。
但是，其缺点是在进行PCR实验时，可能会产生非特异性的产物，从而干扰实验结果。
反转录聚合酶链反应（RT-PCR）是利用逆转录酶将RNA转录为cDNA，并通过聚合酶链反应扩增目标基因。
RT-PCR方法可以避免基因的割离和分离，可以直接从RNA中得到目标基因，并直接进行扩增。
这种方法的优点是具有高灵敏度和高特异性，并且测定基因表达水平的结果可重复性好。
但是，其缺点是需要进行大量的操作，包括RNA的提取、逆转录、扩增等，比较复杂，某些时候可能会存在准确性问题。
2. 耐药性基因功能分析的主要方法耐药性基因克隆之后，进行功能分析也非常重要。
主要方法有人工合成基因试验、构建基因敲除株、基因表达水平分析等。
人工合成基因试验是通过合成目标基因的人工DNA序列，将该序列转移到表达系统中进行酶活性分析或药物敏感性分析等试验。
该方法可以避免复杂的基因提取和克隆过程，保证所得到的基因序列是准确的。
但是，其缺点是基因只能表达出人工合成序列的酶活性，不能完全模拟真实的耐药性机制。
构建基因敲除株是利用CRISPR/Cas9等基因敲除技术，在细菌中引入敲除目标基因的突变，评价敲除后菌株对药物的敏感性变化。
该方法可以直接评估目标基因在菌株中的功能。
基因克隆及常见问题分析
生物信息学 分析等
测序检测
PCR或 或 PCR 酶切鉴定
质粒提取
重组克隆 筛选 筛选
连接克隆分类（以PCR产物克隆为例）
q 酶切连接克隆
PCR引物设计时引入载体上的酶切位点，PCR产物经双酶切后 定向克隆到目的载体上。这种方法的优点是定向连接克隆，筛选 方便。缺点则是PCR产物的酶切和判断比较困难，另外酶切连接过 程本身也相当地费时费力。
拓扑异构酶
Ø
1. 2. 3. 4.
作用机理 作用机理
酶与DNA结合使双链解旋； DNA 结合使双链解旋； 将一条链切开，并与切口两端结合阻止螺旋旋转； 将一条链切开，并与切口两端结合阻止螺旋旋转； 使另一条链经过切口，然后再将两端连接起来； 使另一条链经过切口，然后再将两端连接起来； 酶从DNA上脱落，两条链复原。 DNA
TIANGEN公司的Marker
Ø MD100系列
Ø Ø Ø 100 bp Ladder
单一条带混合而成 严格控制每条50ng 特别加亮的100ng
Ø MD200系列
Ø
Ø
单一质粒DNA或噬菌体 DNA单酶切而成 按比例计算每条带的质 量
DNA 克隆的几大要素
Ø 目的DNA片段 DNA Ø 克隆载体 Ø 连接酶 Ø 感受态细胞
2.
Ø
反应条件 反应条件
4 ℃或16℃过夜
Ø
对应载体
pBS-T、pGM-T
q 连接体系
反应组分 目的PCR 片段 对照插入片段（700 bp, 50 bp ng/μll ng/ ） ） T载体 T 载体 Ligase 10×Ligation Buffer 10 无菌去离子水 无菌去离子水 反应体系 2 – 7 μl —— 1 μl 0.51 μl 0.5 1 μl 补足到10 μl 阳性对照 —— 1 μl 1 μl 0.51 μl 0.5 1 μl 补足到10 μl 22－26℃ 22 26 快速连接 （5－30分 5 30 钟） 钟） 反应条件 4℃或者 4 或者 16℃过夜 16 过夜
基因克隆技术的使用中常见问题
基因克隆技术的使用中常见问题基因克隆技术作为现代生物科学中的重要工具，在许多领域中都发挥着重要作用。
然而，在基因克隆技术的使用过程中，也经常会遇到一些常见问题。
本文将探讨基因克隆技术使用中经常出现的问题，并提供解决方案。
首先，一个常见的问题是如何选择合适的载体。
在进行基因克隆的过程中，选择正确的载体对于成功完成克隆实验至关重要。
首先要考虑的是载体的大小是否适合所需克隆的基因。
此外，还需考虑载体的复制方式、转染效率和选择标记等因素。
解决这个问题的关键在于研究人员需要对不同的载体进行仔细比较和评估，选择最适合自己实验的载体。
其次，基因克隆技术中常见的问题是如何处理DNA片段。
在克隆过程中，将目标DNA片段与载体连接是一个关键步骤。
然而，DNA连接反应并不总是顺利进行。
一种常见问题是连接反应的效率低，导致难以获得想要的克隆产物。
解决这个问题的建议是优化连接反应条件，包括优化反应体系，调整连接反应的时间和温度等。
此外，还可以尝试不同的连接酶和缓冲液，以提高连接效率。
此外，基因克隆技术中常见的问题还包括如何识别重组克隆和筛选正碱基突变。
在基因克隆中，识别重组克隆和筛选正碱基突变是至关重要的。
一种常见的方法是通过PCR扩增和测序验证重组克隆和序列的准确性。
此外，在测序过程中，还需要确认序列中是否有正确的突变。
解决这个问题的关键在于研究人员需要仔细设计引物和选择适当的条件进行PCR扩增和测序。
另一个常见问题是如何处理低克隆发率。
在实际应用中，由于基因克隆技术的复杂性，克隆发率可能较低。
可能导致低发率的因素包括目标DNA片段的质量或浓度问题，连接效率的低下，以及环化和限制性内切酶切割的问题等。
解决这个问题的方法包括提高目标DNA片段的质量，优化连接反应，并使用高效转染和筛选方法。
最后，一个常见的问题是如何处理有毒基因。
在基因克隆过程中，有时需要克隆或操纵有毒基因。
然而，有毒基因对细胞的生长和生存能力可能造成不利影响。
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零背景载体
• • 携带致死基因
（无需抗性筛选）
13个酶切位点
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零背景载体—特点
• 零背景：使用携带致死限制酶基因，无需蓝白斑筛选 • 高效：高效连接酶，阳性率>95% • 通用：适合平末端/粘末端PCR产物 • 快速：室温连接5分钟（平末端）/10分钟（粘末端） • 耐受力强：可插入6bp-10kb 的片段
3.
抗生素使用错误
转化后立即涂板忘 记温浴
对 策
2. 3.
使用高效率的感受态细 胞（106以上） 复查质粒抗性，使用正 确的抗生素 转化后温浴45min左右， 让抗性基因得以表达
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DNA克隆常见问题之二
白斑少
原因
1. 2. 3.
4. 5.
A或T突出端丢失 插入片段与载体比例不适 PCR 产物中含有抑制连接 的成分 连接时间不够；温度太高 PCR 产物已经插入，但未 破坏lacZ 基因的翻译框
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克隆方法（以PCR产物克隆为例）
酶切连接克隆
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内容概要
DNA克隆技术简介 DNA克隆实验流程
DNA克隆的要素
DNA克隆常见问题与应对策略
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克隆实验的流程
网上检索 引物设计
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零背景载体—实验例
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零背景载体—平末端连接
混匀内容物，离心3-5秒
室温反应5分钟
将离心管置于冰上，进行后续的转化反应
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零背景载体—粘末端连接
A
70℃反应5分钟 冰上短暂冷却
B
室温反应5分钟 冰上短暂冷却
检查平板是否含IPTG/X-Gal 以及平板是否新鲜制备 复查抗生素的抗性 用于制备感受态的菌株，传 代次数不能太多（20代以内
未加IPTG/X-Gal或其失效 抗生素失活，敏感菌亦能
生长
3.
用于制备感受态的菌株退 化，丢失了某些重要
对 策
2. 3.
为佳）
因子
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DNA纯化常见问题及对策
• 凝胶回收无产物或者回收率低 • 回收DNA质量不好
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DNA纯化常见问题及对策
凝胶无回收产物或回收率低
1、胶块太大，未全部溶解 2、起始量少 3、电泳缓冲液老化，PH值 升高 4、使用去离子水进行洗脱 5、洗脱缓冲液用量过少 6、洗脱缓冲液未加在离心柱 中心 1）将胶块切小，增加溶胶时间或是溶胶 液体积 2）增加回收起始量 3）使用新配制的缓冲液进行制胶和电泳 4）最好用试剂盒配备的洗脱液进行洗脱 5）根据起始量使用合适体积的洗脱液 6）应加在离心柱正中间，并放置1～2分 钟，再离心
DNA克隆常见问题之四
阳性克隆率低
原因
1. 2. 3. 4.
1. 2.
PCR产物不纯，非目的条带 亦被克隆 PCR部分产物发生A尾丢失 PCR所用酶不在产物3’端加 A或只是部分加A 片段与载体比例不适
对 策
3.
4.
重新纯化PCR产物 PCR扩增后，尽量少放置，直 接进行后续的回收连接，以防 A尾丢失 除Taq酶外，使用其它酶扩增 的产物在用于TA克隆时都建议 先加A, 再连接 调整片段与载体的比例，控制 在1:3-1:8之间
反应条件
4 ℃/16℃过夜；37 ℃ 1-2h
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DNA 克隆的要素
• • • • 目的DNA片段 连接酶 克隆载体 感受态细胞
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T载体
•
•
Amp抗性
19个酶切位点
• 多种试剂盒满足 您的实验需求
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1.
对 策
2.
3. 4.
使用新扩增的PCR产物，避免 引入核酸外切酶 与片段载体的比例：1:3-1:8 再次纯化PCR产物进行连接 适当延长连接时间；连接温度 过高（>28℃）可使背景 增加 室温连接时勿超过26℃
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DNA克隆常见问题之三
只有白色菌落
原因
1. 1. 2.
TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD.
内容概要
DNA克隆技术简介 DNA克隆实验流程
DNA克隆的要素
DNA克隆常见问题与应对策略
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DNA 克隆的目的
目的基因的序列测定及筛选 增加目的基因的拷贝，降低后续实验的难度
PCR特异性好（单带）
超薄/普通/大量DNA产物 纯化试剂盒 寡核苷酸DNA产物纯化 试剂盒 N96 DNA产物纯化试剂盒 通用型DNA产物纯化试 剂盒
PCR特异性差（多带）
超薄琼脂糖凝胶DNA回 收试剂盒 普通琼脂糖凝胶DNA回 收试剂盒 大量琼脂糖凝胶DNA回 收试剂盒 通用型琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒
扩增片段末端
粘末端
适合克隆类型 零背景克隆 TA克隆 零背景克隆 TA克隆
零背景克隆
克隆前处理 平端化（平端化酶） 无 无 加A（加尾酶）
平端化（平端化酶）
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目的DNA片段纯化
纯化原因：多余引物、多余dNTP、多余镁离子等，可 能会影响后续连接反应，建议纯化。
• • • • 目的DNA片段 连接酶 克隆载体 感受态细胞
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感受态细胞
感受态细胞的种类：野生型、化学转化型、电转化型 感受态效率的测定： 产生菌落的总数
转化效率＝
铺板DNA的总量
保存：-70℃冻存，避免反复冻融
800免费电话：800-990-6057
TIANGEN感受态细胞
分光光度法
受缓冲体系、样品稀释度、 核酸二级结构、仪器本身等影 响
DNA marker 定量法
EB分子插入DNA分子碱基间， 50ngDNA即可显现清晰条带， 定量方便直观
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TIANGEN公司的Marker
800免费电话：800-990-6057
DNA 克隆的要素
TIANGEN六种PCR耐热聚合酶
高扩增效率
高扩增、高保真
高保真
Pfu
Long Taq
长片段扩增
高扩增、高保真、 高特异性
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高特异性
不同DNA聚合酶PCR产物对比
DNA聚合酶 Taq HotMaster Taq
Pfu Taq Plus Long Taq Taq Platinum 平末端 粘末端+平末端 粘末端+平末端 粘末端+平末端 TA克隆 加A（加尾酶）
转化操作流程
连接产物混合
冰浴30 min 42度 1-2 min 37度复苏培养
37度过夜培养
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设计实验
1）未转化的感受态细胞＋非抗性平板 2）未转化的感受态细胞＋抗性平板 3）转有PUC19的感受态细胞＋抗性平板
检查感受态细胞活性 检查是否有杂菌 检查细胞转化效率
研究基因表达
其他（如点突变、SNP等）
800免费电话：800-990-6057
克隆方法（以PCR产物克隆为例）
TA克隆—蓝白斑筛选
非定向连接克隆，连接效率高，操作简单，易于长期保存。 可进行测序后对正确克隆扩大培养。
800免费电话：800-990-6057
克隆方法（以PCR产物克隆为例）
零背景克隆—无需蓝白斑筛选
• • • • 目的DNA片段 连接酶 克隆载体 感受态细胞
800免费电话：800-990-6057
T4 DNA连接酶
作用机理
催化相邻DNA链的5’-P末端和3’OH末端以磷酸二酯键结合的反应， 需ATP作辅酶。 本酶不仅可以催化粘末端/平末端 之间的DNA的连接，也可以催化 DNA与RNA之间以及少数RNA之 间的连接。
共10分钟
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载体与片段的最佳比例
载体与插入片段最佳摩尔比1:3-1:8
插入片段的量 ＝ （ng）
加入载体的量 （ng）
×
插入DNA片段 长度（kb）
载体DNA片段长度（kb）
× 插入片段和载 体的摩尔比
800免费电话：800-990-6057
DNA定量方法
TOP10 DH5α
BL21 BL21plys
化
IPTG,X-gal
800免费电话：800-990-6057
800免费电话：800-990-6057
DNA克隆相关产品
DNA聚合酶
目的片段
DNA纯化试剂盒
凝胶回收试剂盒 DNA Marker
DNA 克隆
载体
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
pGM-T连接试剂盒 pGM-T载体 pGM-T克隆试剂盒 pGM-T平末端加A试剂盒
零背景快速连接试剂盒 感受态细胞 转
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酶切法
用特异引物以转化细胞为 模板进行扩增
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内容概要
DNA克隆技术简介 DNA克隆实验流程