《基因工程》-第七章 重组子选择筛选与分析

37℃ incubate 2 3
Prepare plasmid for next analysis
第三节 核酸分子杂交检测法 nucleic acid hybridization
一、 分子杂交定义与原理
分子杂交（molecular hybridization）：指具有 一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在 一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理，形成 异质双链的过程。 利用这一原理，就可以使用已知序列的单链核酸 片段作为探针，去查找各种不同来源的基因组DNA 分子中的同源基因或同源序列。
（2）插入失活筛选法 外源DNA片段插入载体DNA的BamHI位点，导致载体Tcr基因 失活，重组子具有AprTcs的遗传表型，而非重组子则为AprTcr， 重组子只能在Ap板上形成菌落而不能在Tc板上生长；非重组子 却在两种平板上都能生长。
β-galactosidase X-gal IPTG blue-coloured
（3）插入表达筛选法 插入表达法是利用外源目的基因插入特定载体后能激活筛 选标记基因的表达，由此进行转化子的筛选。例如pTR262质 粒载体，其Tcr基因的上含有一段噬菌体DNA的CI阻遏蛋白编 码基因及其调控序列，CI基因表达的阻遏蛋白可以抑制Tcr基因 的表达。当外源DNA片断插入CI基因的 HindIII 或 Bgl I 位点上 时，CI基因失活，Tcr基因因阻碍解除而得以表达，故阳性重组 子为Tcr表型，含有外源DNA插入片断的阳性重组子的转化菌才 能生长成菌落。
② 潮酶素磷酸转移酶(hygromycin phosphotransferase, HPT)基因 某些植物细胞株系（如水稻）对卡那霉素具有一定的抗性，利 用卡那霉素筛选NptII基因转化体时假阳性率高，这时可采用 Hpt报告基因进行筛选。潮霉素原是一种链霉菌的产物，通过 与70S和50S核糖体的结合来抑制许多原核生物与真核生物的 生长。HPT酶能催化ATP上的- 磷酸基团转移至潮霉素分子上 而使之失活。潮霉素是致癌物质，操作时应慎重。 ③ 氯霉素乙酰转移酶（chloraphenicol acetyltransferase, CAT）基因 氯霉素可选择性地与原核细胞核糖体50S亚基结合，抑制肽酰 基转移酶的活性，从而阻断肽键的形成并最终抑制细胞生长。 CAT基因催化乙酰辅酶A转核酸杂交方法： Southern blotting （ Southern 印迹杂交法） Northern blotting （ Northern 印迹杂交法） Spot blot hybridization(斑点杂交 ) colony hybridization（菌落杂交） Nucleic acid hybridization in situ（原位杂交） DNA array (DNA点阵) DNA chip (DNA芯片技术)
Use of PCR
√ √ √
1 2 3 4 5
Thermal cycler
PCR
√
M 1 2 3 4 5
Template: colonies
1 2 3 4
√
√
Denaturation at 95℃ 60s Primer annealing at 55℃ 45s Extension at 72℃ 120s
第二节 依赖于重组子结构特征分析筛选法
快速裂解菌落鉴定分子大小。根据有外源DNA片段插入的重组 质粒与载体DNA之间大小的差异来区分重组子和非重组子。 一、限制性核酸内切酶酶解分析法 从转化菌落中随机挑选出少数菌落，快速提取质粒DNA，然后 用限制性核酸内切酶酶解，通过凝胶电泳分析来确定是否有外 源基因插入及其插入方向等。
（3）利用抗除草剂基因筛选转基因植物细胞 Bar基因是1987年从水链霉菌中分离出来的，它编码的PPT- 乙酰 转移酶(PAT)能够解除非选择性除草剂的毒性。PPT是L-谷氨酸的 类似物，能强烈抑制谷氨酰胺合成酶(Gs)的活性，而谷氨酰胺合 成酶一旦受到抑制，将会导致植物体内氨的迅速积累，并使植株 死亡。 Bar基因的表达产物PAT通过对PPT的乙酰化从而解除 PPT的毒性，可以使转化植物细胞产生对除草剂的抗性。 3．利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞 在植物转基因研究中采用的氯霉素乙酰转移酶(Cat)基因和新霉素 磷酸转移酶(NptII)基因也可作为遗传选择标记用于哺乳动物转基 因细胞的筛选，除此以外，常用的标记基因还有：胸酰核苷激酶 基因(tk)、二酸叶酶还原酶基因(dhfr)及细菌的黄呤-鸟嘌呤磷酸 核糖基转移酶基因(ecogpt)等
《Princple and Technology of Genetic Engineering》
《基因工程原理》
1
第七章 重组子选择、筛选和分析
（ The Selection, screening and analysis of recombinants）
教学目的与要求： 1 ) Genetic selection and screening methods 2) Screening clone banks by nucleic acid hybridization （Southern blotting，Northern blotting） 3) Immunological screening for expressed genes (Western blotting) 4) Analysis of cloned genes (Restriction mapping, DNA sequencing)
核酸分子杂交操作程序
制备待测核酸样品 制备核酸探针 标记核酸探针 加入标记核酸探针
分离、变性、转移、固化DNA片段
预杂交
杂交 漂洗去除未参与杂交的标记探针
检测杂交信号
• DNA:DNA
5’ A T G C C G A T 3’ T A C G G C 5’ A T G C G T A 3’ U A C G C A U 5’ A U G C U A C G 3’ U A C G A U G C
（2）利用生化报告基因筛选植物转化细胞
① -葡萄糖酸苷酶（-Glucuronidase, GUS）基因 作为一种水解酶，转化植物细胞所产生的-葡萄糖酸苷酶能够催化某些特殊反应的 进行，通过荧光、分光光度和组织化学的方法对这些特殊反应产物的检测即可确定 Gus报告基因的表达情况，以此区分转化子和非转化子。
② 荧光素酶（luciferase, LUC）基因 LUC是一种源于萤火虫的动物蛋白基因产物，能够催化生物发 光反应。1985年Luc 基因首次被克隆。该酶在激活因子Mg2+ 的作用下，可以与荧光素和ATP底物发生反应，形成与酶结合 的腺苷酸荧光素酰化复合物，经过氧化脱羧作用后，该复合物 转变成为处于激活状态的氧化荧光素，同时发射光子。 ③ 冠瘿碱（opine）合成酶基因 冠瘿碱合成酶基因主要包括胭脂碱合成酶基因和章鱼碱合成酶 基因两类，存在于土壤农杆菌Ti质粒的T-DNA区段。冠瘿碱合 成酶基因含有类似真核生物的启动子和poly(A)序列，植物细 胞中的表达产物可以催化一些特殊反应，通过电泳分离菲醌荧 光染料染色，可以方便地观察到反应产物的生成。
小结： 1．根据载体选择标记初步筛选转化子 （1）抗药性筛选法 （2）插入失活筛选法 （3）插入表达筛选法 2．利用报告基因筛选植物转化细胞 （1）利用抗生素报告基因筛选植物转化细胞 （2）利用生化报告基因筛选植物转化细胞 （3）利用抗除草剂基因筛选转基因植物细胞 3．利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞 4．营养缺陷型检测法 5．形成噬菌斑筛选法
2．利用报告基因筛选植物转化细胞 在植物转基因研究中，载体携带的选择标记基因（selective gene）经常称为报告基因(reportor gene)，常用的报告基因有 抗生素抗性基因以及编码某些酶类或其他特殊产物的基因等。
（1）利用抗生素报告基因筛选植物转化细胞 ① 新霉素磷酸转移酶（neomycinephosphotransferase-II, NPTII）基因 新霉素(neomycin)与卡那霉素(kanamycin)、庆大霉素和 G418 等均属于氨基环醇类的抗生素，它们的结构相似，能抑制原核 细胞核糖体70S起始复合物的形成，从而阻碍了蛋白质的合成， 进一步抑制了细胞的生长。NptII基因催化ATP上- 磷酸基团转 移到上述抗生素分子的某些基团上，从而阻碍抗生素分子与靶 位点的结合，并使抗生素失活。因此，在含有上述抗生素的选 择培养基上培养植物转化材料仅有携带NptII基因的转化植物细 胞才能存活下来。
4．营养缺陷型检测法 根据目的基因在受体细胞中表达产物的性质，筛选含目的基因的 克隆子。 5．形成噬菌斑筛选法 对于系统而言，外源DNA插入噬菌体载体后，重组DNA分子大 小必须在野生型DNA长度的78%~105%范围内，才能在体外包 装成具有感染活性的噬菌体颗粒，导入受菌体后，转化子在培养 基平板上被裂解形成噬菌斑，而非转化子能正常生长，两者很容 易区分。 取代型载体，则噬菌斑中的噬菌体即为重组子，产生噬菌斑。 使用插入型载体，筛选重组子可以利用载体上的筛选标记基因， 如lacZ’等。当外源DNA片段插入lacZ’基因内时，重组子噬菌 斑无色透明，而非重噬菌斑则呈蓝色。
二、利用PCR方法筛选确定重组子（Other genetic selection methods：PCR） 通过插入位点两侧已知序列互补的引物，以从初选出来的阳性 克隆中提取的少量质粒DNA为模板进行 PCR反应，通过对 PCR产物的电泳分析就能确定是否是重组子菌落。
图 7-4 转基因植株中Gus基因的PCR检测（PCR analysis of Gus in putative transgenic plantlets），M, DNA marker; P, 以PCAM-Gus1质粒为阳性对照; CK1,以水为模板的阴性对照; CK2,以未转基因植株为阴性对照; 1-6，转基因植 株。
2
第一节 转基因筛选和选择的方法 转化子：将导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细 胞称为转化子 重组子：含有重组DNA分子的转化子被称为重组子 阳性克隆子：如果重组子中含有外源目的基因则又称 为阳性克隆子或期望重组子。 克隆子的筛选或选择：经过各种方法将外源DNA分子 导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为克 隆子的筛选或选择。