鹅细小病毒灭活苗佐剂筛选研究
鹅细小病毒感染雏鹅研究
鹅细小病毒感染雏鹅研究禽类MHC对细胞之间的相互作用实行免疫调节，其结构与疾病防控研究密切相关1。
MHC是编码与免疫应答直接相关的一类细胞膜糖蛋白基因群，存有高度多态性，能适合和抵抗绝大多数病原微生物2。
病原体驱动的选择是有利于MHC杂合子，表明MHC基因型和与宿主的抗病性或免疫应答水平密切相关。
MHCⅠ类等位基因与诸多疾病相关，并且复杂性和多态性使个体间的免疫应答有所不同3。
当前主要研究鸡和鸭的MHC，而鹅的MHC研究较少，鹅的MHCⅠ存有高度多态性4，MHCIIβ片段来自不同的MHCIIB基因座5，MHC基因间存有着复杂的功能及协同互作，为此本试验分析GPV感染雏鹅的MHC多态性变异，以期为进一步研究鹅的易感性及抗病机理奠定基础。
1.1试验动物随机选择生长一致、健康的3日龄雏鹅，由青岛农业大学莱阳五龙鹅实验基地提供。
1.2.1雏鹅处理将种毒GPVYZ经口腔接种6日龄的雏鹅，每只接种0.2mL，感染组雏鹅（YZ）。
同时对照组雏鹅（CK）接种等量的生理盐水，连续观察发病症状，分别采集肝脏。
1.2.2制备细胞悬液参照文献6的方法，收集鹅肝脏细胞膜。
1.2.3膜蛋白的提取参照文献7的方法，用TritonX-100抽提膜蛋白，丙酮沉淀，PEG6000浓缩，冷冻真空干燥粗膜蛋白。
1.2.4MHC的分离纯化PBS溶解粗蛋白样品，上样于经同样缓冲液平衡的SephadexG-200柱脱盐，梯度（0～0.6mol/LNaCl，PBS0.02mol/L）洗脱，收集合并活性蛋白部分，再上样于预先用pH值6.3100mmol/LPBS平衡的BioGelP-100凝胶柱纯化，用PBS（pH值6.3，100mmol）洗脱，收集纯化的MHC，冷冻真空干燥。
1.2.5蛋白质含量检测总蛋白含量，参照文献8，以BSA为标准，紫外法检测，总蛋白含量（mg/mL）=1.55×A280-0.76×A260，系数F1=1.115，系数F2=0.76；MHC的含量，参照鹅MHCⅠ/Ⅱ酶联免疫分析试剂盒（上海沪鼎生物科技公司LOT10-45-618）实行测定，λ=450nm。
免疫组化方法检测细小病毒在雏鹅体内分布规律研究
462020年第9期 吉林畜牧兽医·禽业专栏·QinYe ZhuanLan免疫组化方法检测细小病毒在雏鹅体内分布规律研究于昌贵天津市中升挑战生物科技有限公司，天津 300380摘 要：利用免疫酶组织化学染色法将雏鹅进行人工感染GPV，在不同阶段病毒抗原在体内的分布状况具有不同的特点，采用影像学技术对其予以定量分析后，雏鹅于感染1～21 d 可在各器官中检测到病毒抗原体，而其中在5 d 时，感染分布较为广泛，因此抗原出现染色效应的最大，待检组织中空肠具有较高的检出率，而病毒抗原因此广泛存在消化道的各种上皮细胞中，由此可知上皮细胞为GPV 重要的靶细胞。
关键词：鹅细小病毒；间接免疫酶组织化学法；染色强度鹅细小病毒（GPV）在细小病毒科中可诱发鹅细小病毒病，是一种可感染雏鹅或者番鸭的传染性疾病[1]。
此疾病多发于3～20 d 内出生的雏鹅。
目前，小鹅瘟在流行趋势以及发病特点上具有较为新颖的观点。
1 试验方法1.1 动物分组与病毒接种准备将66只14 d 雏鹅随机分为2组，观察组（感染GPV）40只，对照组26只。
观察组中对雏鹅予以肌肉注射0.1 mL、口服0.5 mLGVP 尿囊液；另一组予以统计量的生理盐水。
1.2 取样将GPV 感染的雏鹅进行不同时段取病变样本，将所有病变组织进行标记后可在-20 ℃予以保存。
1.3 免疫组化法的应用主要通过进行优化后的间接免疫酶组织化学法对其进行处理，可将样本进行切片在载玻片上固定后，进行胰蛋白酶修复以及洗涤切片，当完成标本制作后，在电风扇下将标本吹干或利用温箱烤干标本，若二甲苯表现出透明性状，则可予以树胶封片。
1.4 定量分析对染色样本的阳性强度检测，若强度表现高，则代表阳性征具有更强的效果，本次结果以“均数±标准差”表示。
2 感染原因与结果分析2.1 不同时段的器官组织病变动态分析检测组织诊断主要应用免疫酶组织化学染色后，在电子显微镜下对其进行切片，再对感染结果进行分析。
小鹅瘟灭活疫苗(TZ10株)的研制
小鹅瘟灭活疫苗（TZ10株）的研制小鹅瘟是导致雏鹅死亡的常见疾病之一,可造成巨大经济损失,严重危害养鹅业的发展。
现有弱毒活疫苗和小鹅瘟抗体的广泛应用,在我国小鹅瘟疫病防控过程中发挥了巨大的作用。
但活毒疫苗存在毒力返强的潜在危害,从而限制了其生产应用,因此研究小鹅瘟灭活疫苗显得尤为重要。
本研究对小鹅瘟分离毒株的生物学特性进行了系统研究,筛选出免疫原性好、繁殖滴度高的小鹅瘟野毒株作为灭活疫苗候选株,并开展了生产工艺、乳化工艺和免疫效力研究工作,以期制备出安全、高效的小鹅瘟灭活疫苗,为我国小鹅瘟疫病的防控和净化提供有力工具。
1、小鹅瘟病毒疫苗候选株的筛选为了研制与当前小鹅瘟流行株匹配的疫苗,本研究对从2009～2011年江苏省养鹅地区疑似小鹅瘟的临床样品中共分离了 5株鹅细小病毒(GPV),同时对分离株进行VP3基因测序并绘制遗传进化树,序列分析结果表明GPV分离株与国内大部分分离株属于同一分支,明显不同于国内疫苗株SY61和台湾主要分支。
对获得的毒株经有限稀释法纯化,并对纯化后的病毒进行繁殖性能、毒力、特异性及免疫原性等进行了测定,5株病毒均属于强毒株,其中 Gosling plague virus/taizhou/10(TZ10)株病毒含量最高(F10代:105.0ELD50/0.2ml以上),且其灭活抗原免疫鹅4周后的抗体水平最高,因此确定以TZ10株作为小鹅瘟疫苗候选株。
按照农业部颁发的《兽用生物制品(毒、虫)种种子批建立实验技术指导原则》各项要求,对纯化后的TZ10株F0代毒在鹅胚中连续传至30代,并分别对不同代次种毒进行了 AGP、鹅胚半数致死量(ELD50)测定、免疫原性、特异性实验及纯净性检验,建立了符合规定的小鹅瘟病毒TZ10株的基础种子批(F16～F20种毒)、规定了生产用最高限制代次(F25)。
2、小鹅瘟灭活疫苗生产工艺研究疫苗生产过程中,抗原的生产工艺决定了疫苗质量及生产成本,抗原的完全灭活和疫苗的乳化工艺分别是关系到疫苗安全、有效性和疫苗质量的关键步骤。
鹅细小病毒灭活疫苗的研制
鹅细小病毒灭活疫苗的研制
黄宇翔;李洪彬;刘力威;王志强;邹越;杨旭东;张军
【期刊名称】《中国家禽》
【年(卷),期】2015(37)7
【摘要】试验以现地分离的鹅细小病毒毒株,配以白油为佐剂研制鹅细小病毒灭活疫苗。
经检验不仅符合生物制品的要求,而且在实验室和田间试验中表现出了良好的效果。
种母鹅免疫后20 d可产生免疫保护性抗体,并可持续4个月以上,对种鹅免疫后3个月的后代雏鹅,母源抗体保护期可达14日龄;3日龄雏鹅免疫后20 d可产生保护性抗体并可持续3个月左右。
【总页数】4页(P53-56)
【作者】黄宇翔;李洪彬;刘力威;王志强;邹越;杨旭东;张军
【作者单位】黑龙江省兽医科学研究所
【正文语种】中文
【中图分类】S855.3
【相关文献】
1.猪细小病毒感染症蜂胶灭活疫苗的研制及应用研究总结报告
2.猪细小病毒病油乳剂灭活疫苗研制及应用研究
3.猪细小病毒-伪狂犬病病毒二联油乳剂灭活疫苗的研制
4.鹅细小病毒灭活疫苗种子批建立
5.鹅副黏病毒油乳剂灭活疫苗的研制
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鹅细小病毒的研究进展
鹅细小病毒的研究进展朱沿秋，兽医1班，学号：S2*******（动物医学院，四川农业大学）摘要：小鹅瘟是由鹅细小病毒引起的一种急性、亚急性烈性传染病, 是目前危害养鹅业的重要传染病之一。
近年来关于鹅细小病毒的研究有了许多新的发展和新的观点, 本文从鹅细小病毒的病原、致病机理、检测方法及防治等方面的研究进行阐述，以期为鹅细小病毒及小鹅瘟的防控提供参考。
关键词：小鹅瘟；鹅细小病毒；分子生物学；致病机理小鹅瘟（Gosling Plague，GP）是由鹅细小病毒（goose parvovirus，GPV）所引起的雏鹅的一种急性或亚急性的败血性传染病，是目前危害水禽业健康发展的最严重的传染病之一。
1956 年，小鹅瘟病毒首次由中国学者方定一在江苏扬州市发现并分离，是一类无囊膜的DNA 病毒[1]。
1974 年，国际禽病学会( WPSA) 将其命名为Derzsys 氏病[2]。
近年来，1月龄以上鹅群发病的病例有所增加。
病鹅、带病鹅群及隐性感染的成鹅是该病的主要传染源。
小鹅瘟在我国各地均有流行，病鹅以精神委顿、食欲废绝、严重下痢和渗出性肠炎为主要特征[3-4]，有时出现神经症状，可经消化道和呼吸道传染，并可经卵垂直传播。
该病在许多国家出现报道，给全球养鹅业造成了严重危害[5-9]。
1 病原鹅细小病毒是细小病毒科（Parvoviridate）、细小病毒属（ParvovirusGenus）的成员、无囊膜的单链DNA病毒，病毒粒径约20nm，是目前已知的动物病毒中较小、较简单的病毒之一[10]，不能凝集禽类、哺乳动物和人类的红细胞。
其对外环境的抵抗力较强，56℃能耐受3小时，pH=3时仍稳定，对一些消毒药有较强抵抗力[11]。
抗原分析表明，国内外所有GPV 分离株属于同一个血清型[12]。
GPV 可在鹅胚、鸭胚及其细胞上适应和培养。
GPV 实验室感染雏鹅或雏番鸭后，病毒在体内呈广泛分布，尤其在肝、脾、哈德斯腺、胸腺和法氏囊中病毒含量较高[13,14]。
鹅细小病毒研究进展
鹅细小病毒研究进展马磊;董浩;蒋运博;段小波;谷松至;胡桂学【摘要】小鹅瘟是由鹅细小病毒引起的一种急性、亚急性烈性传染病,是目前危害养鹅业的重要传染病之一.近年来关于鹅细小病毒的研究又有了新的发展和新的观点,作者从鹅细小病毒分子生物学、检测方法、致病机理和抗原位点的定位等方面进行了阐述.%Gosling plague, one of important infectious diseases,is an acute, subacute, spirited contagion caused by goose parvovirus,which cause serious economic loss in goose keeping. In recent years, the research about goose parvovirus have made new development and new viewpoint. Molecular biology of GPV, detecting methods, pathogenesis and positioning of antigen epitope were expounded in this paper.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2011(038)006【总页数】4页(P165-168)【关键词】小鹅瘟;鹅细小病毒;致病机理;抗原表位【作者】马磊;董浩;蒋运博;段小波;谷松至;胡桂学【作者单位】吉林农业大学生命科学院,吉林长春130118;吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118;吉林农业大学生命科学院,吉林长春130118;吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118;吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118;吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118;吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118【正文语种】中文【中图分类】S852.65+9.2鹅细小病毒(goose parvovirus,GPV)是小鹅瘟(gosling plague,GP)的病原体,由于其传播快、病死率高,引起国内外学者的广泛重视。
鹅细小病毒非结构和结构蛋白B细胞线性抗原表位区的筛选的开题报告
鹅细小病毒非结构和结构蛋白B细胞线性抗原表位区的筛
选的开题报告
一、研究背景和目的：
鹅细小病毒是一种常见的禽类病毒，能够引发水禽的急性呼吸道疾病。
其主要病原是鹅细小病毒（EGPV），目前对其的预防和治疗仍然存在很大的挑战。
因此，研究EGPV的免疫原性对于开发有效的预防和控制方法具有重要意义。
本次研究旨在通过筛选EGPV非结构和结构蛋白B细胞线性抗原表位区，探究其免疫原性及作为候选疫苗的潜力。
二、研究内容和方法：
1. 分离EGPV非结构和结构蛋白。
2. 通过生物信息学分析，预测EGPV非结构和结构蛋白B细胞线性抗原表位区。
3. 进行 peptide microarray 实验，对预测表位进行筛选，并对阳性克隆进行验证。
4. 将验证出的免疫原性良好的表位区纳入后续免疫试验和疫苗设计中。
三、预期结果和意义：
该研究将筛选出EGPV的非结构和结构蛋白B细胞线性抗原表位区，为研究EGPV的免疫原性奠定基础。
预计将筛选出免疫原性较好的多个表位区，为后续的免疫试验和疫苗设计提供参考。
同时，该研究将深入了解EGPV的抗原特性，为新的疫苗
设计提供理论支持，促进EGPV的预防和控制工作的开展。
鹅细小病毒病的流行、诊断和预防
doi：10.19369/ki2095—9737.2020.06.062鹅细小病毒病的流行、诊断和预防隋欣（黑龙江省鸡西市动物疫病预防与控制中心，黑龙江鸡西158100）摘要：鹅细小病毒病也称为代尔塞病、鹅肝炎、小鹅瘟，是雏鹅和雏番鸭的一种高度接触性、致死性疾病。
在欧洲和远东的主要养鹅国家都有鹅细小病毒病的报道。
依据特征性的临床过程、发病日龄、大体病变和组织学病变，可初诊。
确诊需经过实验性的病毒分离。
活苗和油乳剂灭活苗用于预防该病％关键词：鹅；细小病毒病；流行；临床表现；病理变化；诊断；鉴别；预防中图分类号：S85&33文献标识码:B1病原鹅细小病毒是细小病毒科的一个成员，最近被证明与人依赖病毒属相关％鹅细小病毒，除与番鸭细小病毒具有密切关系之外，与其他禽类或哺乳动物细小病毒无相似性。
原发感染后，病毒主要在肠壁复制，在经过短暂的病毒血症后，进入心脏、肝脏和其他器官％2传播与流行感染禽经粪便排出大量病毒，直接或间接传播造成发病。
疾病暴发通常开始于感染种鹅经蛋传播给易感雏鹅。
有证据表明，亚临床感染的老龄鹅可能是病原携带者％在之前无该病的国家或地区出现鹅细小病毒病暴发时，感染种蛋通常是病毒的来源％血清学证据表明，欧洲的多种野鹅都存在有该病毒％尚未发现其他禽类带毒者或生物带毒者％3临床表现根据日龄的不同，易感雏鹅和雏鸭的临床症状差异较大。
1周龄之内的禽，病程发展快，伴随有厌食，在2〜5天内出现死亡。
孵化室感染的雏禽，死亡率可达100%。
日龄稍大的禽，病程较长，特征是鼻腔和眼有分泌物，出现腹泻，虚弱％眼睑和尾脂腺红肿％急性期幸存的雏禽表现有生长迟缓，羽毛脱落，皮肤发红，特别是背部皮肤％由于腹腔积液，雏禽常以企鹅状姿势站立％病毒对2〜文章编号：2095—9737（2020）06—0112—024周龄雏禽的致死率可达10%，但发病率可能更高％尽管成年禽可产生免疫应答，但是不表现任何临床症状％4病理变化大体病变有舌头和口腔覆盖有纤维蛋白性假膜、肝周炎、心包炎、肺水肿、肝营养不良和卡他性肠炎。
感染鹅细小病毒雏鹅病理学研究的开题报告
感染鹅细小病毒雏鹅病理学研究的开题报告
题目：感染鹅细小病毒雏鹅病理学研究
摘要：鹅细小病毒是一种引起雏鹅高死亡率的病原体，其感染会导致雏鹅的呼吸道、消化道、中枢神经系统等器官受到损害，严重影响其生长和发育。
本研究旨在探
讨鹅细小病毒感染雏鹅的病理学变化及其发生机制，为该病的防治提供理论依据和实
验基础。
研究内容：本研究计划选取一定数量的健康雏鹅和感染鹅细小病毒的雏鹅，观察并比较它们的病理学变化。
具体研究内容如下：
1.采集标本：收集健康雏鹅和感染鹅细小病毒的雏鹅的组织标本，包括肝脏、脾脏、肺、肠、脑等。
2.病理学检查：对收集到的组织标本进行病理学检查，观察各器官在感染后是否有炎症、水肿、坏死等病理变化。
同时，应对比健康雏鹅和感染雏鹅的病理学变化，
分析感染鹅细小病毒对雏鹅各器官的影响。
3.分子检测：通过PCR法检测感染鹅细小病毒的雏鹅组织标本中是否存在该病毒。
4.病理学变化机制研究：结合病理学检查和分子检测结果，分析鹅细小病毒感染雏鹅的病理学变化机制，探讨该病毒对雏鹅器官的损害机理。
预期结果：通过本研究，预计可以得到以下结果：
1.明确鹅细小病毒对感染雏鹅各器官的具体损害情况；
2.探讨鹅细小病毒感染雏鹅的病理学变化机制，为该病的防治提供理论依据和实验基础；
3.为鹅细小病毒的防治提供理论依据和实验基础。
关键词：鹅细小病毒；雏鹅；病理学；感染；发生机制。
免疫组化和PCR方法检测鹅细小病毒在感染雏鹅体内分布规律研究的开题报告
免疫组化和PCR方法检测鹅细小病毒在感染雏鹅体内分布规律研究的开题报告一、研究背景和意义鹅细小病毒是一种引起鹅细小病的病原体，对于养殖业产生了严重的危害。
针对该病的研究已有一定进展，但目前对于其在感染雏鹅体内的分布规律仍存在较大的不确定性。
因此，本研究旨在通过免疫组化和PCR方法检测鹅细小病毒在感染雏鹅体内的分布情况，为疫病的防治提供科学依据。
二、研究内容和方法本研究拟采用以下方法：1. 动物模型建立：选择健康2日龄的雏鹅，随机分为实验组和对照组，实验组采用鹅细小病毒进行感染。
2. 免疫组化检测：采用免疫组化方法检测不同组织中的鹅细小病毒抗原表达情况。
3. PCR检测：采用PCR方法检测不同组织中的鹅细小病毒DNA含量及其分布情况。
三、研究预期结果通过免疫组化和PCR方法检测，可了解鹅细小病毒在感染雏鹅体内的分布规律，包括其寄生在哪些组织和器官中，以及抗原表达和基因含量的差异等。
因此，本研究可以为探究鹅细小病的发病机制提供理论支持，并对疫病的及时防治提供依据。
四、研究进度安排本研究计划拟定为12个月，进度安排如下：第1-2个月：收集阅读文献，撰写开题报告。
第3-4个月：准备实验材料和介绍鹅细小病毒育苗。
第5-6个月：建立病毒感染动物模型。
第7-8个月：使用免疫组化方法检测实验组和对照组组织中的鹅细小病毒。
第9-10个月：使用PCR方法检测实验组和对照组组织中的鹅细小病毒。
第11-12个月：整理实验数据，撰写实验报告和论文。
五、预期成果和应用前景本研究通过免疫组化和PCR方法检测鹅细小病毒在感染雏鹅体内分布规律，对该疫病的发病机制和防治提供了新的理论支持。
此外，该研究还可以推动相关领域的研究发展，为养殖业的疾病控制和预防提供更加科学的依据。
广东省鹅细小病毒的分离及序列分析
广东省鹅细小病毒的分离及序列分析黄冠雄;许丹宁;杨舒展;郭斯璇;曾依翎;黄运茂;田允波;曹楠【摘要】从广东省鹅主要养殖区分离出2株鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV),分别命名为GDQY2017和GDYJ2017,纯化后测序分析.VP基因的系统发育分析结果表明,2株GPV单独形成一个分支,与疫苗株距离较远.选择压力分析结果表明,分离株的1位点有强烈的净化选择.氨基酸分析结果显示,与疫苗株相比,分离的GPV 菌株含有22个不同的氨基酸残基,并且具有阳性选择的位点(Arg116Gln).【期刊名称】《广东农业科学》【年(卷),期】2018(045)005【总页数】7页(P98-104)【关键词】鹅细小病毒;VP基因;流行病学;系统发育分析【作者】黄冠雄;许丹宁;杨舒展;郭斯璇;曾依翎;黄运茂;田允波;曹楠【作者单位】仲恺农业工程学院动物科技学院/广东省水禽健康养殖重点实验室,广东广州 510225;仲恺农业工程学院动物科技学院/广东省水禽健康养殖重点实验室,广东广州 510225;广东省出入境检验检疫局技术中心,广东广州 510623;仲恺农业工程学院动物科技学院/广东省水禽健康养殖重点实验室,广东广州 510225;仲恺农业工程学院动物科技学院/广东省水禽健康养殖重点实验室,广东广州 510225;仲恺农业工程学院动物科技学院/广东省水禽健康养殖重点实验室,广东广州510225;仲恺农业工程学院动物科技学院/广东省水禽健康养殖重点实验室,广东广州 510225;仲恺农业工程学院动物科技学院/广东省水禽健康养殖重点实验室,广东广州 510225【正文语种】中文【中图分类】S858.3鹅细小病毒（goose parvovirus，GPV）是鹅和番鸭的主要病原体，对雏鹅和雏番鸭有高发病率和高死亡率［1］。
GPV属于单链线性DNA病毒，具有约5 100个核苷酸，含两个主要开放阅读框（ORF）和末端重复序列（ITR），左侧的ORF 编码主要参与病毒复制和转录调节的非结构蛋白，另一个ORF编码包含VP1、VP2和VP3的衣壳蛋白，3种蛋白具有相同的C端。
鹅细小病毒的分离鉴定及LAMP快速检测方法的建立的开题报告
鹅细小病毒的分离鉴定及LAMP快速检测方法的建立的开
题报告
一、研究背景
鹅细小病毒 (goose parvovirus, GPV) 是一种常见的鹅病毒，主要感染幼鹅，繁殖期鹅群及良种鹅，病死率高达 100%，严重影响了鹅养殖业的发展。
目前，GPV 的传统检测方法主要为病毒分离、鸭胚接种、酶联免疫吸附试验 (ELISA) 等，周期长、操作繁琐、耗费时间和经济成本高。
因此，需要建立一种快速、简便、特异、灵敏、准确的 GPV 直接检测方法，为临床诊断提供便利。
二、研究目的
1. 分离鉴定 GPV 病毒株。
2. 建立 LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) 技术快速检测 GPV 的方法。
三、研究方法
1.病毒分离与鉴定：用 RT-PCR 方法检测 GPV 病毒并对其进行鉴定，然后进行病毒分离，对分离后的病毒进行组织培养和电镜观察等手段进行病毒的形态和生物学特性的研究。
MP 技术的建立：采用 GPV 的特异性引物设计，优化反应体系，建立一种适用于 GPV 直接检测的 LAMP 技术。
MP 技术的验证：将建立好的 LAMP 技术与传统的病毒检测方法进行比较，评估其特异性、灵敏度、准确性等性能参数。
四、研究意义
1. 该研究将为 GPV 的快速检测提供新的方法，为 GPV 的防治提供科学参考。
2. LAMP 技术具有操作简便、成本低廉、检测时间短、特异性高等优点，能够有效地提高 GPV 的检测效率，降低鹅养殖业的经济损失。
3. 本研究具有推广和应用的价值，对提高我国鹅养殖业的发展质量和水平，减少养殖业的经济损失具有重要意义。
鹅细小病毒NS基因PCR和单抗竞争ELISA检测方法的建立及应用的开题报告
鹅细小病毒NS基因PCR和单抗竞争ELISA检测方法的建立及应用的开题报告一、研究背景及意义鹅细小病毒是一种造成鹅细小病毒病的病原体，主要影响脊髓前角神经元和肝脏，导致鹅的麻痹、瘫痪等症状，严重影响了鹅的生产效益。
当前鹅细小病毒采取的主要防控策略是疫苗接种，但由于鹅细小病毒存在分型多样性和致病性差异，一些病毒亚型的疫苗不能提供充分的保护效果，因此需要开发一些更为准确和可靠的检测方法，以便对病情进行及时、准确的诊断，指导疫苗种类的选择和免疫方案的制定。
目前已经开发出了多种针对鹅细小病毒的检测方法，其中PCR和ELISA技术应用广泛，但在检测鹅细小病毒时，存在一些技术难题，如病毒的分型多样性和多种病毒亚型造成的检测敏感性差异等问题。
因此，本研究将建立一种基于NS基因PCR和单抗竞争ELISA的鹅细小病毒检测方法，并对其应用进行探索和研究，为鹅细小病毒的诊断和防控提供更为可靠、准确的技术手段。
二、研究内容和方法1.建立鹅细小病毒NS基因PCR检测方法采集鹅细小病毒阳性样本，提取病毒RNA，分别设计NS基因PCR引物，对其进行PCR扩增，并进行电泳分析和序列分析，确定引物的特异性和灵敏度。
建立PCR检测方法后，对鹅细小病毒防控中常见的其他致病病毒进行检测，验证其特异性。
2.制备鹅细小病毒单抗通过对鹅细小病毒阳性样本进行病毒分离和纯化，制备鹅细小病毒单抗。
通过Western blotting和竞争ELISA等方法，验证单抗的特异性和稳定性。
3.建立单抗竞争ELISA检测方法制备ELISA检测试剂盒，包括鹅细小病毒抗原和鹅细小病毒单抗，以及辅助试剂。
对鹅细小病毒阳性样本进行检测，对其灵敏度、特异性等性能进行评价。
4.应用研究在鹅细小病毒疫苗接种区，采集鹅细小病毒阳性样本，对其进行NS基因PCR和单抗竞争ELISA检测，对检测结果进行比较和分析，探究两种检测方法的应用价值和优缺点。
三、预期结果和创新性本研究将建立一种基于NS基因PCR和单抗竞争ELISA的鹅细小病毒检测方法，并应用于鹅细小病毒疫苗接种区的样品检测中，研究其敏感性、特异性和可靠性等性能，以及与现有方法的比较。
猪细小病毒灭活疫苗安全性试验及佐剂的筛选_张超范
第6期
张超范，等. 猪细小病毒灭活疫苗安全性试验及佐剂的筛选
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为了解决这一问题，国内外学者通过实验证实豚鼠 可作为 PPV 疫苗的效检替代动物。Joo 等曾报道豚 鼠和兔子对 PPV 疫苗的血清学反应与猪相似[5]。潘 雪珠等证明了豚鼠对 PPV 灭活疫苗的抗体反应特异 敏感[6]。蒋玉雯等用豚鼠检测 PPV N 株弱毒苗，证 明其敏感性与猪一致[7]。因此，本试验选用成 年豚 鼠作为 PPV 灭活疫苗的效检动物进行 PPV-BQ 株灭 活疫苗的免疫效果比较试验。在 PPV 灭活疫苗研制 过程中，病毒含量与疫苗的免疫效果密切相关；灭 活剂和佐剂的类型同样影响灭活疫苗的免疫效果。 因此，本研究通过改进猪细小病毒的培养方法来提 高病毒含量，通过改进制苗工艺，最大程度降低牛 血清含量来减少灭活疫苗的副反应。制成疫苗以后 进行了大量有关灭活疫苗的动物安全性试验和佐剂 的筛选试验，为研制新型佐剂 PPV 灭活疫苗做了前 期准备工作。
母猪的繁殖障碍，还可与其他病原体协同作用引起 多种疾病，给养猪业造成很大的经济损失 。 [2-4]
猪细小病毒血清型单一、具有较高的免疫原 性 ， 疫 苗 接 种 是 控 制 PPV 感 染 的 有 效 措 施 。 检 测 PPV 疫苗的效力要求使用 PPV 血清学阴性的母猪， 由于其成本高，管理和操作比较费时费力，目前国 内能满足试验要求的 PPV 阴性母猪较难筛选得到 。
2结果
2.1 病毒培养工艺优化结果 采用同步接毒的方 式，病毒接种剂量为培养液体积的 2 %，ST 细胞接 毒后 24 h 换细胞生长维持液，不添加犊牛血清。结 果生产工艺改进组病毒含量比对照组增加 1 个～2个 滴度，并且血凝价较稳定，收毒后测定毒价，病毒
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中国预防兽医学报
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小鹅瘟（Gosling Plague，GP），又称为鹅细小病 毒病（Goose Parvovirus）或 Derszy’s 氏病［1］。主要感 染 30 日龄内的雏鹅和雏番鸭，引起渗出性肠炎、心 脏、肝和脾等实质器官病变的急性或亚急性败血性 传染病［2］。该病致病性强、发病率和致死率高、传 播性快。目前，用于主动免疫的生物制剂主要是 弱 毒 苗 ，用 于 被 动 免 疫 的 生 物 制 剂 主 要 是 抗 血 清。弱毒疫苗具有免疫剂量小，免疫原性好等优 点 ，但 雏 鹅 、鸭 用 弱 毒 疫 苗 容 易 受 母 源 抗 体 的 干 扰，使其不能发挥作用，免疫必须是依据母源抗体 的水平而确定初免时间。根据上述免疫学基本原 理，本试验采用本地区分离的番鸭源鹅细小病毒 强毒制成灭活苗，并进行了不同佐剂的筛选评估， 通过对比不同佐剂灭活疫苗的安全性及免疫效 果，初步确认复合佐剂为鹅细小病毒灭活苗最佳 免疫使用佐剂。
本试验制备的 5 种佐剂的鹅细小病毒 FB 株灭
将实验室保存的鹅细小病毒 FB 株 F3 接种 12 日龄的鸭胚进行增殖，将收集到的 F4 尿囊液采用 有限稀释法对鹅细小病毒 FB 株进行纯化，即鹅细 小病毒 FB 株 F4 尿囊液梯度稀释（10-3⁃10-8），感染 12 日龄鸭胚，37 ℃生化培养箱培养 10 天，收集 48 小时后死亡最大稀释度的鸭胚尿囊液，以此收集 的尿囊液以上述同样的方法接种鸭胚纯化 2 代，将 纯化后鹅细小病毒 FB⁃F7 株作为鹅细小病毒灭活 苗的种毒。将此种毒继续接种鸭胚进行病毒液的 增殖，收集尿囊液制备鹅细小病毒的半成品抗原， 测定小鹅瘟 FB⁃F7 株种毒 ELD50以及半成品抗原灭 活前 ELD50。 1.3 灭活苗的制备
1 材料与方法 1.1 材料
番鸭源鹅细小病毒 FB 株鸭胚 F3 分离株由本 实验室分离并储存；甲醛购自芸荟生物；Montanide
ISA 71、Montanide ISA 201、Montanide ISA 763A、 IMS 1313 等佐剂由 SEPPIC 公司提供；复合佐剂由 广州俏灵儿公司提供；实验用鸭胚购自云城某孵化 场。 1.2 病毒增殖与纯化
· 34 · 试验研究
鹅细小病毒灭活苗佐剂筛选研究⁃刘佳佳，等
品制备灭活疫苗 250 ml。具体佐剂信息见表 1。
佐剂名称 71 201 763 1313 复合佐剂
表 1 试验佐剂信息表
佐剂类型 油包水
水包油包水 油包水 水包油 油包水
配比（佐剂：抗原） 70∶30∶00 50∶50∶00 70∶30∶00 50∶50∶00 3∶02
2 结果与分析 2.1 种毒以及半成品抗原灭活前 ELD50测定
利用 Reed⁃Muench 法计算鹅细小病毒 FB 株⁃F7 种 毒 以 及 半 成 品 灭 活 前 ELD50，结 果 为 均 104.5 ELD50/0.2 ml。 2.2 不同佐剂配置疫苗的物理性状
Montanide ISA 71、Montanide ISA 763 和复合佐 剂为油包水性佐剂，疫苗外观为乳白色，为均质乳 剂，滴入水中呈乳滴状不会扩散；201 佐剂为水包 油 包 水 性 佐 剂 ，疫 苗 外 观 亦 为 乳 白 色 ，为 均 质 乳 剂，滴入水中呈乳滴状不会扩散；1313 佐剂水佐 剂，疫苗外观为米黄色，为均质悬液，滴入水中能 迅速的与水混匀。 2.3 不同佐剂配置疫苗安全性试验
将鹅细小病毒 FB 株半成品尿囊液用 2‰的甲 醛进行灭活，经检验合格后，按照不同佐剂灭活疫 苗的相关规定方法进行制备与检验，每个佐剂样
收稿日期：2018⁃11⁃11 作者简介：刘佳佳（1988⁃），女，山东人，硕士，主要从事禽病防控。E⁃mail:1255370172@ *通讯作者：鲁俊鹏（1980⁃），男，山东人，博士，主要从事禽病防控。E⁃mail: junpenglu@
每个佐剂样品鹅细小病毒 FB 株灭活疫苗分别 以 0.2 ml/只剂量，胸肌注射 7 日龄雏番鸭 15 只，于 接种后的 1 周、2 周、3 周和 4 周静脉采血 10 只鸭进 行鹅细小病毒血清中和抗体效价检测。 1.6 中和抗体的检测
按照 2015 版中国兽药典细胞中和抗体测定标 准方法进行操作。血清用前 56 ℃灭活 30 分钟，按 照 Reach⁃Muench 法计算出能保护 50%细胞孔不出 现 CPE 的血清稀释度为该血清的中和抗体效价。
广东畜牧兽医科技 2019 年（第 44 卷）第 2 期
试验研究 · 33 ·
鹅细小病毒灭活苗佐剂筛选研究
刘佳佳，苏晓娜，王占新，覃健萍，曾凡桂，鲁俊鹏* （温氏食品集团股份有限公司，广东省畜禽健康养殖与环境控制企业重点实验室，
广东新兴 527439）
摘 要：本研究以纯化后的番鸭源鹅细小病毒（GPV）现地分离株 FB 株⁃F7 鸭胚培养毒株作 为灭活苗研究种毒，接种 12 日龄鸭胚，获得较高滴度的鸭胚病毒液用于灭活疫苗的制备。灭 活的病毒液半成品抗原分别用赛比克公司的 Montanide ISA 71、Montanide ISA 201、Montanide ISA 763、IMS 1313 和复合佐剂 5 种佐剂制备了鹅细小病毒灭活疫苗，分别进行了雏番鸭安全性 试验及免疫效果对比试验。通过对比不同佐剂小鹅瘟灭活疫苗的安全性及免疫效果，初步确 认复合佐剂为鹅细小病毒 FB⁃F7 株灭活苗最佳免疫佐剂。
备注 质量比 质量比 质量比 质量比 体积比
1.4 鹅细小病毒 FB 株灭活苗安全性检验 将制备好的各佐剂鹅细小病毒 FB 株灭活苗接
种 1 日龄的雏番鸭进行安全性检验，每只胸肌注射 1 ml，观察 2 周，如鸭只没有异常反应且注射部位 未出现炎症反应，则表明该佐剂鹅细小病毒 FB 株 灭活疫苗对鸭只安全。 1.5 雏番鸭免疫效力试验