结核分枝杆菌荧光定量检测试剂盒研发步骤
结核杆菌核酸扩增荧光检测作业指导书
结核杆菌核酸扩增荧光检测作业指导书1．目的：保证TB DNA检测结果准确、可靠。
2．适用范围：TB DNA的TaqMan荧光定量检测，标本类型为血清。
3．负责人：操作人：4．原理：本试剂盒用一对结核杆菌特异引物和一条结核杆菌特异性荧光探针，PCR反应液，耐热DNA聚合酶（Taq酶），四种核苷酸单体（dNTPs）等成分，再用PCR体外扩增法检测结核杆菌DNA。
5．性能参数：检出低值＜1×103基因拷贝/ml。
6．标本要求：（1）标本类型：血清。
（2）标本采集：见标本采集手册。
（3）标本储存和运输：室温放置不超过8小时，4-8℃不超过72小时，-20℃保存期6个月，应避免反复冻融。
室温运输。
（4）标本拒收状态：细菌污染、严重溶血或脂血标本不能作测定。
7．容器和添加剂类型：无菌离心管和无菌真空管。
8．所需设备：ABI GeneAmp 5700、台式高速离心机、混匀器、冰箱（4℃、-20℃）、生物安全柜、紫外灯9．试剂：DNA提取液（500μl/管）2管；TB-PCR反应液（未贴标签管）20管；阳性定量质控标准品（1×108基因拷贝/ml）（50μl/管）1管；阴性质控品（250μl/管）1管。
10．校准程序（计量学溯源性）：送深圳市计量检测所校准。
11．程序步骤:：11.1标本处理：标本采集、保存和运送用无菌5ml玻璃管取受检者肺深部咳出痰液1~3ml，密闭，即为标本。
或直接抽取外周血2ml（抗凝）。
标本可立即用于测试，也可保存于-20℃待测，保存期为六个月。
标本运送应采用0℃冰壶。
11.2标本及质控标准品的处理痰液中加入4倍体积的4%NaOH室温放置10分钟后15000rpm离心5分钟。
去上清，沉淀加无菌生理盐水1ml打匀，15000rpm离心5分钟；再重复洗涤一次。
（知液标本直用淋巴细胞分离液分离沉淀）沉淀直接加50ulDNA提取液充分混匀,(提取液内含不溶于水的物质,取样时需用加样器充分混匀后吸取。
结核分枝杆菌核酸扩增荧光定量检测标准操作规程
结核分枝杆菌核酸扩增荧光定量检测标准操作规程采用一对PCR引物和一个荧光双标记的探针，该探针能与引物扩增区域中间的一段DNA模板发生特异性结合，从而将PCR技术和荧光检测技术结合起来，实现了对TB核酸的自动化检测；检测灵敏度为10个TB菌/毫升，反应管在PCR循环结束后无需开盖；采用了dUTP-UNG酶防污染采用一对PCR引物和一个荧光双标记的探针，该探针能与引物扩增区域中间的一段DNA模板发生特异性结合，从而将PCR技术和荧光检测技术结合起来，实现了对TB核酸的自动化检测；检测灵敏度为10个TB菌/毫升，反应管在PCR循环结束后无需开盖；采用了dUTP-UNG酶防污染系统。
可用于可疑结核病患者经处理的痰液标本结核分支杆菌核酸的定性检测，可用于结核病的辅助诊断。
1、储存条件及有效期本试剂盒贮存于-20℃的条件下有效期为12个月（请于有效期内使用）2、自备试剂 4% NaOH、灭菌生理盐水3、样本采集3.1 以清晨第一口痰为宜。
3.2 先用清水漱口，嘱患者用力咳出深部的痰于无菌样本保存管，密封送检。
4、样本存放 4.1 待测样本在2-8℃保存不应超过24小时。
4.2 -20℃保存不超过三个月；。
4.3 -70℃以下长期保存。
4.4 应避免反复冻融。
5、样本运输采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进行运输。
6、扩增试剂准备（PCR前准备区） 6.1 从试剂盒中取出TB PCR反应液、Taq 酶及UNG，室温融化并振荡混匀后，2,000rpm离心10sec。
6.2 设所需要的PCR反应管管数为n（n = 样本数 + 1管阴性对照 + 1管阳性对照），每个测试反应体系配制如下表： 6.21 Roche LightCycler ,Roter-Gene2000/3000仪器，准备相应数量的毛细管试剂TB PCR反应液Taq酶UNG 用量17.8 ul 0.2 ul 0.03 ul 计算好各试剂的使用量，加入一适当体积离心管中，充分混合均匀，2000rpm离心10sec，向设定的n个Roche毛细管(LightCycler)中或普通PCR反应管(Roter-Gene2000/3000)中分别加入18ul，转移至样本处理区。
结核分枝杆菌荧光定量检测试剂盒研发步骤
结核分枝杆菌荧光定量检测试剂盒研发步骤结核分枝杆菌是引起结核病的病原体之一，因其具有较强的传染性和致病性，早期准确、快速地检测结核分枝杆菌对于结核病的防控具有重要意义。
为了满足临床检测需求，研发结核分枝杆菌荧光定量检测试剂盒是非常必要的。
下面是研发结核分枝杆菌荧光定量检测试剂盒的一般步骤：1.确定检测指标：首先需要确定要检测的结核分枝杆菌的特异性指标，常用的指标包括结核分枝杆菌特异性区域的基因片段、结核分枝杆菌特异性抗原等。
根据已有的研究结果和实际需求，选择一个或多个特异性指标作为荧光定量检测试剂盒的靶点。
2.设计引物和探针：根据选定的靶点，设计特异性的引物和探针。
引物和探针的设计需要考虑其与目标序列的亲和力和特异性，同时需要避免与其他相关菌株的DNA序列发生杂交。
3.合成引物和探针：根据设计的引物和探针序列，通过化学合成的方式合成引物和探针。
合成的引物和探针需要经过质量检测，确保其纯度和特异性。
4.设计PCR反应体系：根据引物和探针的特点，设计PCR反应的体系，包括反应缓冲液的配制、核酸模板的添加量、引物和探针的浓度等。
优化PCR反应条件，确保其在荧光定量检测的条件下具有高灵敏度和特异性。
5.建立荧光定量PCR方法：使用设计的引物和探针以及优化的PCR反应体系，进行一系列实验优化步骤，包括PCR温度和时间条件的优化，反应体积的优化，引物和探针的最佳浓度等。
通过不断的试验验证，建立一个可重复、准确、灵敏的荧光定量PCR方法。
6.确定标准曲线和阈值：通过使用已知浓度的结核分枝杆菌标准品，进行一系列PCR反应，并测量荧光信号强度。
根据PCR反应体系中添加的结核分枝杆菌标准品的浓度和相应的荧光信号强度，绘制标准曲线。
根据标准曲线的斜率和y-截距，确定荧光信号阈值，用于定量测定未知样品中的结核分枝杆菌浓度。
7.优化试剂盒成分：根据已建立的荧光定量PCR方法，进一步优化试剂盒的成分，包括引物和探针的最佳浓度、反应缓冲液的配制等。
结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法的建立与应用
结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法的建立与应用目的建立结核分枝杆菌的荧光定量PCR检测方法,探讨荧光 PCR检测痰标本中结核分枝杆菌的应用价值。
方法根据结核分枝杆菌基因保守序列设计引物和探针，并构建标准品。
对102例培养涂阳的结核痰液标本和45例非结核感染者的痰标本，应用荧光定量PCR法、痰涂片抗酸染色法检测结核分枝杆菌。
结果荧光定量 PCR、抗酸染色法检测结核分枝杆菌的特异性分别为100%、30%。
结论荧光定量PCR 是一种快速、敏感性高、特异性强的结核分枝杆菌辅助诊断方法,具有重要的应用价值。
【关键词】结核;分枝杆菌;抗酸染色;荧光定量PCREstablishment and application of fluorescence quantitative PCR for detection of Mycobacterium tuberculosis.ZHU Yu-lan, WANG Dian-peng, GAO Zhao-xian, et al.International Travel Agency Health Care Center, Shenzhen Entry and Exit Inspection and Quarantine Bureau,Shenzhen 518033, Guangdong, P. R. ChinaAbstract：Objective To constitute a method for detection of Mycobacterium tuberculosis by fluorescence quantitative PCR and evaluate the application value of fluorescence quantitative PCR in detection of Mycobacterium tuberculosis insputum. Methods The primers and probe were designed and constitute a standards. The suptum samples from 102 tuberculosis patients and 45 non-tuberculosis patients were detected by fluorescence quantitative PCR and acid-fast stain. Results The positive rates and specificity of fluorescence quantitative PCR, acid-fast stain,were100% and 30% respectively. Conclusion Fluorescence quantitative PCR is a rapid method for diagnosis of tuberculosis, which shows a high specificity and sensitivity. It is a useful tool for diagnosis of tuberculosis in the future.Key words：Tuberculosis; Mycobacterium tuberculosis; Acid-fast stain; Fluorescence quantitative PCR结核病是严重危及全球的公共卫生问题之一，自1985年以来结核病疫情在全球范围内急剧上升，据世界卫生组织报道，目前全球有近1/3的人感染了结核杆菌，即20亿人口感染了结核杆菌，其中活动性肺结核病人约2 000万，每年新增结核病人约800～1 000万，每年约有300万人死于结核病［1～3］。
结核分枝杆菌抗体检测（胶体金法）规程操作
结核分枝杆菌抗体检测（胶体金法）规程操作结核分枝杆菌抗体检测(胶体金法) 规程操作1、检验目的本试剂盒可定性检测人血清中结构分枝杆菌抗体，用于临床结构病的辅助诊断。
2、检验原理本试剂盒利用斑点免疫胶体金渗滤技术（DIGFA），将结核分枝杆菌特异性膜蛋白抗原分离纯化，点样并固化在硝酸纤维素膜上，膜上TB抗原捕获人血清样品中结核分枝杆菌抗体，被捕获的结核IgG 抗体可用葡萄球菌A蛋白（SPA）胶体金缀合物标呈色（SPA能与IgG 特异性结合），形成红色斑点，根据是否出现红色斑点即可判断阴、阳结果从而判断是否存在结核分枝杆菌抗体。
3、样本要求必须使用新鲜血清标本，血浆标本必须用玻璃棒剥离纤维蛋白，保证血清无混浊沉淀。
4、试剂4.1试剂名称：结核分枝杆菌抗体诊断试剂盒（胶体金法）4.2生产厂家：上海奥普生物医药有限公司4.3包装规格：20人份/盒4.4贮存条件及有效期：2-8℃干燥处保存，有效期12个月。
5、检验方法：5.1在反应板的反应孔中间，加入2滴封闭液，等待薄膜吸入；5.2 取40μl新鲜的血清标本，加入反应孔中间，等待薄膜吸入；5.3 在反应孔中间加入6滴洗活液，等待薄膜吸入；5.4 在反应孔中间加入2滴金标液，等待薄膜吸入；5.4 在反应孔中间加入6滴洗涤液，等待薄膜吸收，目测结果；6、结果判断6.1 阳性——质控点显示红色，反应孔中间有红色斑点出现。
6.2 阴性——质控点显示红色，反应孔中间无红色斑点出现或仅为痕迹。
检验方法的局限性少数标本（急性感染、高血脂、溶血等）可出现背景偏红，一般不影响结果判断，可通过将标本用封闭液1:3稀释，加样80μl背景将获得改善。
严重乳糜血标本可能会阻塞硝酸纤维素膜孔，使背景很红，影响中间红色斑点有无的判别，不宜用本法测定。
7、注意事项7.1 必须以单人份操作，严禁多标本同时检测，每个标本的操作步骤需要连续进行，不宜停顿过长。
7.2 质控点显示红色表明试剂盒有效；阴、阳性对照也是确保定性结果可靠的一个环节，但临床阳性标本显色深浅可以与阳性对照不同。
1150817803结核分枝杆菌（TB）核酸检测试剂盒（PCR-荧光法）说明书
结核分枝杆菌（TB）核酸检测试剂盒(PCR-荧光法) 说明书【产品名称】通 用 名 称：结核分枝杆菌（TB）核酸检测试剂盒(PCR-荧光法)【包装规格】32人份/盒【预期用途】本试剂盒用于定性检测患者痰液中结核分枝杆菌核酸,可作为临床结核分枝杆菌检测的辅助手段。
适应症：由结核分枝杆菌感染引起的肺结核、肠结核、结核性腹膜炎等疾病。
【检验原理】本试剂盒选用结核分枝杆菌保守基因片段设计特异引物及特异Taqman 探针，该探针能与引物扩增区域中间的一段DNA模板发生特异性结合，在PCR延伸反应过程中，Tap酶的外切酶活性将5’端荧光基团从探针上切割下来，使之游离于反应体系中，从而脱离了3’端荧光淬灭基团的屏蔽，既能接受光刺激而发出可供仪器检测的荧光，从而实现在全封闭反应体系中对结核分枝杆菌核酸的自动化检测。
【主要组成成份】组成 组成成分 规格核酸提取液 含0.5％Triton-100、5％Chelex-100 1.8mL×1TB反应混合液 含Tris-HCl、KCl、MgCl2、dNTP、引物、荧光探针 1.2mL×1Taq酶含TapDNA酶及抗体 14μL×1阳性对照品 主要成分为含TB基因组DNA（重组克隆）人工构建的质粒100μL×1阴性对照品 主要成分为TE Buffer 100μL×1注：不同批号试剂盒中各组份不可以互换。
【储存条件及有效期】试剂-20℃可保存12个月，未使用完的试剂继续冷冻保存不影响其稳定性，但试剂反复冻融不得超过三次。
【适用仪器】具有FAM荧光通道的ABI 7300 、ABI 7500 荧光PCR扩增仪。
【样本要求】1.标本：人痰液。
2. 采集：将患者用力咳出肺深部的痰液采集于无菌样本保存管，密闭送检。
采集具体方法请参考《微生物标本采集手册》一书。
3. 存放：2-8℃保存，不超过24小时；-20℃下保存，不超过3个月；-70℃下长期保存，但应避免反复冻融。
结核杆菌TBPCR荧光扩增检测说明书
【正文】结核分枝杆菌（TB）核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒说明书Operation Introduction for Mycobacteriumtuberculosis(TB) PCR Fluorescence Diagnostic Kit前言本试剂盒采用一对PCR引物和一个荧光双标记的探针，该探针能与引物扩增区域中间的一段DNA模板发生特异性结合，从而将PCR技术和荧光检测技术结合起来，实现了对TB核酸的自动化检测。
检测灵敏度为10个TB菌/毫升。
试剂盒在PCR循环结束后无需开盖。
试剂盒中采用了dUTP-UNG酶防污染系统。
本品可用于可疑结核病患者经处理的痰液标本结核分枝杆菌核酸的定性检测，可用于结核病的辅助诊断。
试剂盒组成※贮存条件及有效期本试剂盒贮存于-20℃的条件下有效期为一年（请于有效期内使用）。
自备试剂4％NaOH、灭菌生理盐水样本采集、存放及运输1．采集：以清晨第一口痰为宜。
先用清水漱口，嘱患者用力咳出深部的痰于无菌样本保存管，密封，即可送检。
2．存放：待测样本在2-8℃保存不应超过24小时；-20℃保存不超过三个月；-70℃以下长期保存。
应避免反复冻融。
3．运输：采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进行运输。
适用仪器1．BIO-RAD iCycler荧光PCR检测仪、PE Gene Amp 7700荧光PCR检测仪2．Roche LightCycler 荧光PCR检测仪3．其它荧光PCR检测仪，如PE-5700、PE-7000、基因公司Rotor-Gene、MJ公司Opticon Monitor、大和Line-Gene荧光定量PCR检测仪等使用方法1．样本处理（样本处理区）1.1. 首先对痰液样本进行目测，若样本中唾液占绝大部分，则需重新采集样本。
1.2. 目测合格后，在样本中加入2～3倍体积4%的NaOH溶液，置于摇床上，在150rpm、37℃条件下处理30min或常温下1Hr，使其充分液化（无明显固状物并且吸出时无拖丝现象即为液化完全；若液化不完全，可适当再加入少量4%的NaOH溶液直至液化完全）。
宝创干式荧光免疫分析仪标准操作程序
宝创干式荧光免疫分析仪标准操作程序1、目的规范检测的操作流程，保证测试结果的准确性。
2、原理结核分枝杆菌复合群的感染，可以引起血液中的记忆淋巴细胞免疫识别，并产生和分泌相应因子，如γ-干扰素。
因此，对全血细胞进行特异性结核抗原刺激，通过其释放的γ-干扰素进行定量测定，可判定是否存在针对结核分枝杆菌复合群特异性的细胞免疫反应。
根据以上原理，结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒选取含有结核杆菌特异性抗原（ESAT-6和CFP-10）作为刺激抗原，与新鲜的肝素锂抗凝全血充分混合孵育23-24小时，使用干式荧光免疫分析仪定量检测血浆中的γ-干扰素浓度。
同时，引入空白阴性对照管和植物凝血素阳性对照管，作为对无法肯定受试者的免疫状况或血液处理及孵育过程的对照，排除实验中因样本不理想或操作错误引起的假阴性或假阳性结果，使检测结果更加的准确。
3、适用仪器广州市宝创生物技术有限公司的干式荧光免疫分析仪（DFIA100、DFIA200、DFIA300）。
4、实验操作所需器材和试剂1.厂家提供：结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒干式荧光免疫分析仪（DFIA100、DFIA200、DFIA300）2.实验室自备：5、试剂储存条件及主要组成成分5.1(4-30)℃避光干燥保存，不得冻存。
有效期12个月。
检测卡的铝箔袋开封后，检测卡需在1小时内尽快使用。
5.2试剂主要组成成分注：不同批号试剂盒中各组成成分不得互换使用。
6、产品性能指标6.1最低检测限：本试剂盒的最低检出限≦0.25IU/ml6.2阴性参考品符合率：检测15份随机健康人的新鲜全血样本，阴性参考品符合率不低于75%。
6.3阳性参考品符合率:检测20例结核病患者的新鲜全血样本，阳性参考品符合率不低于80%。
6.4精密度6.4.1 取一份结核病患者的新鲜全血样本进行3次重复检测，结果均为阳性;6.4.2用企业精密度参考品J1、J2分别进行10次重复检测，检测结果的变异系数（CV）≦15%。
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结核分枝杆菌荧光定量检测试剂盒研发步骤
非竞争性内标法
1.模板的获得（TB标品和内标DNA）
(1) 普通PCR反应
选用一种工作标准品为模板，根据巨细胞病毒荧光定量检测试剂盒说明书进行普通PCR 反应，反应后溶液进行琼脂糖凝胶电泳，并对目的条带进行切胶回收。
(2) 连接
由于Taq酶的PCR反应产物末端带A，故直接以上述切胶回收的PCR片段为目的PCR 片段，按pGMT克隆试剂盒进行10μl连接体系的配制，4℃过夜连接。
(3) 转化
10μl昨日过夜连接的体系转入50μl TP10感受态细胞中，冰浴30min，42℃90s热激，冰浴2-3min，加入600μl LB培养基后37℃震荡培养90min。
分别涂100μl于现倒的蓝白筛选平板，37℃过夜培养。
(4) 检测
挑取白色菌落接种于1-5ml LB培养基中，摇到一定浓度后，以菌液为模板用普通PCR 进行验证。
(5) 测序
选择条带正确的菌液进行测序。
2.基因的查找和比对（TB标品和内标DNA）
从/网点的genbank中下载所需要的序列，与测序结果进行比对。
由于不知道测序基因的具体名称，故需要进行大量的比对以找出其在genebank中的序列。
TB标品DNA序列：CACATCAGCCGCGTCCACGCCGCCAACTACGGTGTTTACGGTGCCCGCAAAGTGTGGCTAACCCTGAACC GTGAGGGCATCGAGGTGGCCAGATGCACCGTCGAACGGCTGATGACCAAACTCGGCCTGTCCGGGACCA CCCGCGGCAAAGCCCGCAGGACCA
TB内标DNA序列：CACATCAGCCGCGTCCACATCTGATCCGTAGCGACTACGGACGCGCGCCTACGCCCTTCTCAGTTAA
3.引物和探针的设计（TB标品和内标DNA）
(1) 引物设计
引物序列：
上游引物TB-F：5’ CACATCAGCCGCGTCCACG 3’ 19bp
下游引物TB-R：5’ TGGTCCTGCGGGCTTTGC 3’ 18bp
内标引物：
上游引物TBN-F：5’ ACATCAGCCGCGTCCAC 3’ 17bp
下游引物TBN-R：5’ AACTGAGAAGGGCGTAGGC 3’19bp
(2) Taqman探针设计
TB标品DNA探针（第一通道）：
5’端荧光报告集团FAM
3’端荧光淬灭基团TAMRA
TB标品探针FAM-AGGTGGCCAGATGCACCGTCGAACG-TAMRA TM=74
TB内标DNA探针（第二通道）：
5’端荧光报告集团HEX
3’端荧光淬灭基团BHQ1
TB内标探针HEX-CTGATCCGTAGCGACTACGGACGCG-BHQ1TM=73
4.实时荧光定量PCR实验体系的优化
(1) 引物退火温度
引物的一个重要参数是熔解温度（Tm）。
这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA 分子时的温度。
Tm对于设定PCR退火温度是必需的。
在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。
合理的退火温度从55℃到70℃。
退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。
所有oligo软件会自动计算引物的Tm 值。
在设置退火温度时可以如下进行：以低于估算的Tm5℃作为起始的退火温度，进行温度梯度PCR，找到引物的最佳退火温度。
找到引物的最佳退火温度：58.8℃
(2) 引物浓度
引物的浓度会影响特异性。
最佳的引物浓度一般在0.1到0.5μM。
较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。
将引物的终浓度分别设置为几个梯度，使用RT-PCR进行扩增，从扩增曲线质量上选取最佳的引物浓度。
(3) 探针浓度
由于反复冻融易导致探针降解，在确认探针质量好的情况下，最好稀释成2μM（10×），作为工作浓度分装多支，避光保存。
将探针的终浓度设置为200 nM左右的几个梯度，使用RT-PCR进行扩增，从扩增曲线质量上及电泳图谱选取最佳的引物浓度。
如果荧光信号强度不足，可以增加至0.4uM。
(4) 镁离子浓度
镁离子影响PCR的多个方面，如DNA聚合酶的活性，这会影响产量；再如引物退火，这会影响特异性。
dNTP和模板同镁离子结合，降低了酶活性所需要的游离镁离子的量。
最
佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同，但是包含200μM dNTP的实时定量PCR，使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液（普通PCR是1.5mM）。
较高的游离镁离子浓度可以增加产量，但也会增加非特异性扩增，降低忠实性。
为了确定最佳浓度，普通PCR从1mM到3mM，以0.5mM递增，进行镁离子滴定。
(6) dNTPs浓度
将探针的终浓度设置为0.2mM左右的几个梯度，使用RT-PCR进行扩增，从扩增曲线质量及电泳图谱上选取最佳的dNTPs浓度。
(7) 模板浓度
对模板做一个梯度稀释的实验。
此外，每个引物都要设无模板对照，阳性对照以及污染对照。
最佳反应体系及配比（50μl）：
稀释105的TB标品DNA：1μl
稀释105倍的TB内标DNA：0.25μl
TB-F（10μM）：0.5μl
TB-R（10μM）：0.5μl
TBN-F（10μM）：0.5μl
TBN-R（10μM）：0.5μl
TB标品-Probe（10μM）：1μl
TB内标-Probe（10μM）：1μl
dNTPs（2.5mM）：0.8μl
MgCl2（25mM）：0.3μl
10*Buffer（天根HotMaster）：5μl
天根HotMasterTaq Polymerase：0.4μl
ddH2O：39.5μl
反应程序：95℃5min；95℃20s，60℃1min，40Cycles
5.试剂盒检测所需条件的测定
(1) 特异性实验
对不同的质粒和cDNA样品进行RT-PCR反应，每个样品3个重复，观察该试剂盒的特异性。
(2) 灵敏度实验
对模板进行10倍倍比稀释，应用建立的荧光定量PCR进行反应，每个稀释倍数3个重复，观察该试剂盒的敏感性。
(3) 重复性实验
应用建立的荧光定量PCR方法对模板进行重复检测。
(4) 稳定性实验
将荧光定量PCR反应体系混匀后分装冷冻保存，定期取出检测。