限制性内切核酸酶的切割方法
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
是代表任意一种核苷酸碱基。
核酸内切酶 Restriction endonuclease
识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并在合适的反 应条件下使每条链一定位点上的磷酸二酯键断开， 产生具有3-OH和5-P基团的DNA片段的内切脱氧 核糖核酸酶。 识别序列规律：旋转对称或左右互补对称。
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
限制性内切酶的命名
Hin dⅢ Haemophilus influenzae d株
流感嗜血杆菌d株的第三种酶
属系 株 序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
限制性内切酶识别序列的特征
1）每一种酶都有各自的特异识别序列 2）识别序列具左右互补对称(Pst I: GAATTC) 3）同位酶对切割的序列甲基化有不同的
影响限制性内切酶活性的因素
1) DNA的纯度 2) DNA的甲基化程度 3) 温度 4) 缓冲液 5) 反应体积和甘油浓度 6) 反应时间
DNA的纯度
核酸内切限制酶消化DNA底物的反应效率，在很大程度上是取决于所使 用的DNA本身的纯度。污染在DNA制剂中的某些物质，例如蛋白质、 酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸(EDTA)、SDS(十二烷基硫酸钠)、以 及高浓度的盐离子等，都有可能抑制核酸内切限制酶的活性。
①合成双链cDNA分子或片段连接 ②缺口平移制作高比活探针 ③DNA序列分析 ④填补3´末端
又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、 35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成， 双链DNA 3末端标记等
①合成cDNA ②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析
污染。由于DNase的活性需要有Mg2+的存在，而在DNA的贮存缓冲 液中含有二价金属离子螯合剂EDTA，因此在这种制剂中的DNA仍然 是稳定的。然而在加入了核酸内切限制酶缓冲液之后，DNA则会被 DNase迅速地降解掉。要避免发生这种情况，唯一的办法就是使用高 纯度的DNA。
DNA的甲基化程度
核酸内切限制酶是原核生物限制—修饰体系 的组成部分，因此识别序列中特定核苷酸 的甲基化作用，便会强烈地影响酶的活性。 为避免产生这样的问题，在基因克隆中使 用的是失去甲基化酶的大肠杆菌菌株制备 质粒DNA。
源自文库
Questions
1基因工程的主要理论依据:共6点 2核酸内切酶识别序列的规律 3限制性内切酶的命名 4同位酶、同裂酶、同尾酶
识别相同序列切点不同 识别位点相同，酶的来源不同。 识别位点不同，切出片段有相同末端序列。
➢粘性末端：产生的 DNA片段末端的一条 链多出一至几个核苷 酸。3´端比5´端长的 称为3´粘性末端，5´ 端比3´端长的称为5´ 粘性末端。 ➢平末端：产生的 DNA片段末端是平齐 的。
基因工程的基本技术路线
重组DNA技术中常用的工具酶
工具酶 限制性核酸内切酶
DNA连接酶 DNA聚合酶Ⅰ
Klenow片段
反转录酶 多聚核苷酸激酶
末端转移酶 碱性磷酸酶
功
能
识别特异序列，切割DNA
催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键， 使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接
催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针
在3´羟基末端进行同质多聚物加尾
切除末端磷酸基
核酸酶分类
核酸内切酶：催化水解多核苷酸内部的磷酸二酯键
核酸外切酶：从DNA或RNA链的一端逐个水解下 单核苷酸
Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性
与I型及III型核酸内切限制酶不同，II型核酸内切酶 只有一种多肽，并通常以同源二聚体形式存在。 它具有三个基本特性： a. 在DNA分子双链的特异性识别序列部位，切割 DNA分子产生链的断裂； b. 2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不 是彼此直接相对的； c. 因此，断裂的结果形成的DNA片段，也往往具有 互补的单链延伸末端。
为了提高核酸内切酶对低纯度DNA的反应效率，一般采用如下三种方 法：
①增加核酸内切限制酶的用量，平均每微克底物DNA可高达10单位甚至 更多些。
②扩大酶催化反应的体积，以使潜在的抑制因素被相应地稀释。 ③延长酶催化反应的保温时间。 在有些DNA制剂中，尤其是按微量碱法制备的，会含有少量的DNase的
• 打破了常规育种难以突破的物种之间的界限 可以使原核生物与真核生物之间的遗传信 息进行相互重组和转移 可以使动物与植物之间的遗传信息进行相 互重组和转移 可以使人与其他生物间的遗传信息进行相 互重组和转移
基因工程的主要理论依据
➢ 不同基因具有相同的遗传物质(DNA/RNA) ➢ 基因是可以从DNA上切割下来的 ➢ 基因是可以转移的 ➢ 多肽与基因之间存在对应关系 ➢ 遗传密码是通用的(绝少数除外) ➢ 可以通过DNA复制把遗传信息传递给下一代
基因工程
按照人们的愿望（人为的），进行严密的设 计（类似工程设计），通过体外DNA重组 （非生命活动过程）和转基因等技术，有 目的地改造生物种性，使现有的物种在较 短的时间内趋于完善（区别于自然突变和 常规育种），创造出更符合人们需求的新 的生物类型;利用这种技术对人类疾病进行 有效的诊断和治疗。
基因工程突出的优点
限制性反映 4）同位酶、同裂酶、同尾酶
酶切特点
同位酶：识别相同序列切点不同。
同裂酶：识别位点相同，酶的来源不同。限制酶HpaⅡ和 MspI是一对同裂酶，共同的靶子序列是CCGG。
同尾酶：识别位点不同，切出片段有相同末端序列。Sal I （5`-G TCGAC-3`）和Xho I(5`-C TCGAG-3`)的消化片 段相连，但所形成的重组片段（5`-GTCGAG-3`）则不能 被上述2种酶的任一种酶识别和切割。
识别位点
绝大多数的II型核酸内切限制酶，都能够识 别由4～8个核苷酸组成的特定的核苷酸序 列。我们称这样的序列为核酸内切限制酶 的识别序列。而限制酶就是从其识别序列 内切割DNA分子的，因此识别序列又称为 核酸内切限制酶的切割位点或靶序列。
1）有些识别序列是连续的(如GATC)， 2）有些识别序列则是间断的(如GANTC)，N
核酸内切酶 Restriction endonuclease
识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并在合适的反 应条件下使每条链一定位点上的磷酸二酯键断开， 产生具有3-OH和5-P基团的DNA片段的内切脱氧 核糖核酸酶。 识别序列规律：旋转对称或左右互补对称。
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
限制性内切酶的命名
Hin dⅢ Haemophilus influenzae d株
流感嗜血杆菌d株的第三种酶
属系 株 序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
限制性内切酶识别序列的特征
1）每一种酶都有各自的特异识别序列 2）识别序列具左右互补对称(Pst I: GAATTC) 3）同位酶对切割的序列甲基化有不同的
影响限制性内切酶活性的因素
1) DNA的纯度 2) DNA的甲基化程度 3) 温度 4) 缓冲液 5) 反应体积和甘油浓度 6) 反应时间
DNA的纯度
核酸内切限制酶消化DNA底物的反应效率，在很大程度上是取决于所使 用的DNA本身的纯度。污染在DNA制剂中的某些物质，例如蛋白质、 酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸(EDTA)、SDS(十二烷基硫酸钠)、以 及高浓度的盐离子等，都有可能抑制核酸内切限制酶的活性。
①合成双链cDNA分子或片段连接 ②缺口平移制作高比活探针 ③DNA序列分析 ④填补3´末端
又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、 35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成， 双链DNA 3末端标记等
①合成cDNA ②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析
污染。由于DNase的活性需要有Mg2+的存在，而在DNA的贮存缓冲 液中含有二价金属离子螯合剂EDTA，因此在这种制剂中的DNA仍然 是稳定的。然而在加入了核酸内切限制酶缓冲液之后，DNA则会被 DNase迅速地降解掉。要避免发生这种情况，唯一的办法就是使用高 纯度的DNA。
DNA的甲基化程度
核酸内切限制酶是原核生物限制—修饰体系 的组成部分，因此识别序列中特定核苷酸 的甲基化作用，便会强烈地影响酶的活性。 为避免产生这样的问题，在基因克隆中使 用的是失去甲基化酶的大肠杆菌菌株制备 质粒DNA。
源自文库
Questions
1基因工程的主要理论依据:共6点 2核酸内切酶识别序列的规律 3限制性内切酶的命名 4同位酶、同裂酶、同尾酶
识别相同序列切点不同 识别位点相同，酶的来源不同。 识别位点不同，切出片段有相同末端序列。
➢粘性末端：产生的 DNA片段末端的一条 链多出一至几个核苷 酸。3´端比5´端长的 称为3´粘性末端，5´ 端比3´端长的称为5´ 粘性末端。 ➢平末端：产生的 DNA片段末端是平齐 的。
基因工程的基本技术路线
重组DNA技术中常用的工具酶
工具酶 限制性核酸内切酶
DNA连接酶 DNA聚合酶Ⅰ
Klenow片段
反转录酶 多聚核苷酸激酶
末端转移酶 碱性磷酸酶
功
能
识别特异序列，切割DNA
催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键， 使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接
催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针
在3´羟基末端进行同质多聚物加尾
切除末端磷酸基
核酸酶分类
核酸内切酶：催化水解多核苷酸内部的磷酸二酯键
核酸外切酶：从DNA或RNA链的一端逐个水解下 单核苷酸
Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性
与I型及III型核酸内切限制酶不同，II型核酸内切酶 只有一种多肽，并通常以同源二聚体形式存在。 它具有三个基本特性： a. 在DNA分子双链的特异性识别序列部位，切割 DNA分子产生链的断裂； b. 2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不 是彼此直接相对的； c. 因此，断裂的结果形成的DNA片段，也往往具有 互补的单链延伸末端。
为了提高核酸内切酶对低纯度DNA的反应效率，一般采用如下三种方 法：
①增加核酸内切限制酶的用量，平均每微克底物DNA可高达10单位甚至 更多些。
②扩大酶催化反应的体积，以使潜在的抑制因素被相应地稀释。 ③延长酶催化反应的保温时间。 在有些DNA制剂中，尤其是按微量碱法制备的，会含有少量的DNase的
• 打破了常规育种难以突破的物种之间的界限 可以使原核生物与真核生物之间的遗传信 息进行相互重组和转移 可以使动物与植物之间的遗传信息进行相 互重组和转移 可以使人与其他生物间的遗传信息进行相 互重组和转移
基因工程的主要理论依据
➢ 不同基因具有相同的遗传物质(DNA/RNA) ➢ 基因是可以从DNA上切割下来的 ➢ 基因是可以转移的 ➢ 多肽与基因之间存在对应关系 ➢ 遗传密码是通用的(绝少数除外) ➢ 可以通过DNA复制把遗传信息传递给下一代
基因工程
按照人们的愿望（人为的），进行严密的设 计（类似工程设计），通过体外DNA重组 （非生命活动过程）和转基因等技术，有 目的地改造生物种性，使现有的物种在较 短的时间内趋于完善（区别于自然突变和 常规育种），创造出更符合人们需求的新 的生物类型;利用这种技术对人类疾病进行 有效的诊断和治疗。
基因工程突出的优点
限制性反映 4）同位酶、同裂酶、同尾酶
酶切特点
同位酶：识别相同序列切点不同。
同裂酶：识别位点相同，酶的来源不同。限制酶HpaⅡ和 MspI是一对同裂酶，共同的靶子序列是CCGG。
同尾酶：识别位点不同，切出片段有相同末端序列。Sal I （5`-G TCGAC-3`）和Xho I(5`-C TCGAG-3`)的消化片 段相连，但所形成的重组片段（5`-GTCGAG-3`）则不能 被上述2种酶的任一种酶识别和切割。
识别位点
绝大多数的II型核酸内切限制酶，都能够识 别由4～8个核苷酸组成的特定的核苷酸序 列。我们称这样的序列为核酸内切限制酶 的识别序列。而限制酶就是从其识别序列 内切割DNA分子的，因此识别序列又称为 核酸内切限制酶的切割位点或靶序列。
1）有些识别序列是连续的(如GATC)， 2）有些识别序列则是间断的(如GANTC)，N