大肠

GB4789.3-2008

食品卫生微生物学检验大肠菌群计数

前言

•本标准的第一法和第二法修改采用美国食品药品管理局(FDA)《细菌学分析手册》第4章大肠杆菌和大肠菌群计数(2002年)

•第三法修改采用国际分析家学会(AOAC INTERNATIONAL)AOAC 991.14《食品中大肠菌群和大肠杆菌计数Petrifilm测试片法》(1994年)

本标准与FDA和AOAC方法的主要区别是：•样品制备时取样量50g(或50mL)修改为25 g (或25 mL)。

•培养温度由35℃±1℃修改为36℃±1℃。•本标准代替GB/T 4789.3—2003《食品卫生微生物学检验大肠菌群测定》。

与GB/T 4789.3—2003相比主要修改如下：•将标准名称改为“食品卫生微生物学检验大肠菌群计数”；

•增加了大肠菌群的平板计数法和纸片检测方法；

•大肠菌群的MPN法从以乳糖胆盐为主要培养基的MPN法，修改为以月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤为主要培养基的MPN法；

•大肠菌群MPN法中原“报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值”，

修改为“报告每1mL(或1g)大肠菌群的MPN值”。

•本标准的附录A、附录B为规范性附录。

1.范围

•本标准规定了食品中大肠菌群计数的方法。•本标准适用于各类食品中大肠菌群的计数。

2 术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

2.1大肠菌群coliforms

一群在36℃条件下培养48 h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌群主要来源于人畜粪便，作为粪便污染指标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能。

埃希氏菌属柠檬酸杆菌属

克雷氏菌属产气肠杆菌属

为什么用大肠菌群作为食品中细菌污染的指示菌？由于与其他肠道菌相比大肠菌群具有以下特点：•大肠菌群数量多，是温血动物肠道的优势菌，检出率高。

•在外界的存活时间与肠道致病菌基本一致。•对杀菌剂的抵抗力与肠道致病菌一致。

•操作简单，不需要复杂的设备。

•灵敏度高，食品中的粪便污染量只要达到

0.001mg/kg即可检出大肠菌群。

许多国家把大肠菌群作为食品卫生质量的鉴定指标，用于判断食品是否受温血动物粪便的污染和肠道致病菌污染的可能性。

2.2 最可能数most probable number；MPN

基于泊松分布的一种间接计数方法．

3 设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

3.1 恒温培养箱：36℃±l℃。

3.2 冰箱：2℃～5℃。

3.3 恒温水浴箱：46℃±1℃。

3.4 天平：感量0.1 g。

3.5 均质器。

3.6 振荡器。

3.7 无菌吸管；1 mL(具0.01mL刻度) 、

l0mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。

3.8 无菌锥形瓶：容量500mL。

3.9 无菌培养皿：直径90mm。

3.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。

3.11 菌落计数器或Petrifilm TM1)自动判读仪。

4 培养基和试剂

•月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST)肉汤（新增加）•煌绿乳糖胆盐（BGLB)肉汤（新增加）

•结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA) （新增加）•磷酸盐缓冲液

•无菌生理盐水

•l mol/L氢氧化钠(NaOH)

• 1 mol/L盐酸(HCl)

•Petrifilm TM大肠菌群检验测试片和压板

第一法大肠菌群MPN计数

5 检验程序

6.操作步骤

6.1样品的稀释

6.1.1 固体和半固体样品

称取25g样品，放入盛有225mL磷酸盐缓冲

液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min-10000r/min均质1min～2min，或放入盛有

225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min-2min，制成1:10的样

品匀液。

6.1.2 液体样品

以无菌吸管吸取25 mL样品，置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。

6.1.3 样品匀液的pH值应在6.5-

7.5之间，必要时分别用1mol/L氢氧化钠(NaOH)或

1mol/L盐酸(HCl)调节。

6.1.4 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取l:10样品匀液1 mL，沿管壁缓缓注入9 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面)，振摇试管或换用1支1 mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。

6.1.5 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。

每递增稀释1次，换用1支1 mL无菌吸管或吸头。

从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min。

1mL

9mL9mL9mL9mL

1 0-11 0-

2 1 0-

3 1 0-4

1mL1mL

稀释液

6.2初发酵试验

•每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液)，

•每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤，

•每管接种lmL(如接种量超过1 mL，则用双料LST肉汤).

•36℃±l℃培养24h±2 h，观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至

48 h ±2 h。

•记录在24 h和48h内产气的LST肉汤管数。

未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进

行复发酵试验。