pet系统原核表达详细总结

用于克隆的宿主菌
用于克隆的宿主菌通常是Novablue， JM109以及DH5a。这些菌株是rec-end-型， 转化效率高，且质粒产量也高，适合用于 保存带有克隆目的基因的PET载体。
用于表达的宿主菌
BL21(DE3) 基因型： F– ompT hsdSB (rB– mB–) gal dcm (DE3) 无抗性 重组质粒转化到带有T7RNA聚合酶基因 的大肠杆 菌中，即可开始产生蛋白了。这些菌株都是DE3 溶原菌。噬菌体DE3是一种衍生噬菌体，带有噬 菌体21抗性区和lacI基因，lacUV5启动子，以及 T7RNA聚合酶基因。这一区段被插入int基因，因 此阻止了DE3在没有辅助噬菌体时整合到染色体 上或从染色体切出，一旦形成DE3溶原状态，就 只有受IPTG诱导的lacUV5启动子指导T7RNA聚 合酶基因转录。
抗生素抗性
pET载体常用的两种筛选标记是Ampr+和Knar+ 因为内酰胺酶的消化和PH的降低，Ampr+的选择 性易于丢失。某种情况下使用Knar+更为有利。 Ampr+和Knar+的另一个不同是两种基因的转录 方向不同 。Ampr+位于T7启动子下游，与其方向 相同。除了pET5系列，T7转录终止序列位于内酰 胺酶基因前面，但是这个终止序列只有70%的有 效性。因此，T7聚合酶能够通读，导致内酰胺酶 的积累。相反Knar+的转录方向与T7启动子方向 相反，诱导时并没有Knar+基因的增加。
Function of T7 Polymerase
The 3'®5' exonuclease activity of T4 DNA polymerase removes nucleotides until it encounters a residue corresponding to the single dNTPpresent in the reaction mix. At this point the 5'®3' polymerase activity of the enzyme counteractsthe exonuclease activity to effectively prevent further excision.
来自百度文库
T7lac Promoter
T7启动子下游有个Lac启动子，它包含常规 的启动子和lacI基因，T7lac与lacI启动子位 置交错。采用这种载体及DE3溶原菌，lac 阻遏蛋白可以作用与T7RNA聚合酶，也作 用与载体T7lac启动子。阻断任何T7RNA聚 合酶导致的目的基因转录。
pLysS和pLysE宿主菌
PET原核表达系统
pET系统是有史以来在E.coli中克隆表达重组蛋 白的功能最强大的系统。目的基因被克隆到 pET质粒载体上。受噬菌体T7强转录及翻译信 号控制，表达由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶 诱导。T7RNA聚合酶机制十分有效并具选择性： 充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达 目的蛋白。
不依赖连接反应的克隆方法（LIC）
用LIC法制备的pET载体有不互补的单链粘端，与目的插 入片段上相应的粘端互补。扩增目的插入片段的引物5,端 序列要与LIC载体互补。T4DNA聚合酶的3 , -5 , 外切酶活性经短时间即可在插入片段上形成单链粘端。由 制备好的插入片段和载体互相形成退化产物，这种方法十 分快速高效且为定向克隆。pET载体上编码的氨基酸序列 可通过肠激酶或X因子去掉。
pET载体
pET载体最初是由Studier及其同事构建。 (Studier and Moffatt,1986; Rosenberg et al., 1987; Studier et al., 1990). 包括两种载体——转录载体（用于表达本 身含有核糖体结合位点和起始密码子目的 基因）和翻译载体（载体上带有核糖体结 合位点）。一般来说，转录载体用于表达 来自原核的基因，而翻译载体表达真核基 因。
lacUV5 Promoter
与野生型lac启动子相比，控制T7RNA聚合 酶表达的 lacUV5启动子对 cAMP/CRP的刺 激并不敏感。然而，最近研究发现rDE3宿 主菌在缺少葡萄糖的培养基生长到稳定期 时，cAMP同样对lacUV5产生了去阻遏作用。 尽管宿主菌长到稳定期并不推荐，菌体培 养过夜（16h）后转入含有1%的葡萄糖的 培养基中，可以有效避免去阻遏作用，因 为glucose可以cAMP的产生。
BL21(DE3)
BL21(DE3)是应用最广泛的表达宿主菌。是 lon蛋白酶和ompT膜外蛋白酶（纯化过程可 以降解蛋白）缺陷型。目的蛋白BL21中更 加稳定。
因为BL21(DE3)对利福平敏感，如果有必要 可以用利福平来限制宿主RNA和蛋白质的 背景合成。
应该注意一些带有T7启动子的商业载体原 则上可以用来表达，然而，只有T7启动子 而没有额外的lac阻遏子基因的载体并不适 合。这些载体上的多拷贝lac操纵 子（用于 蓝白斑筛选）会结合lac抑制因子，使pet菌 株中同样受lac抑制因子控制的基因部分表 达。。结果基本的T7RNA聚合酶活性升高， 使目的基因的稳定性受到影响。
另一个为目的基因提供稳定性保证的方法 是在拥有兼容的氯霉素抗性编码表达少量 T7溶菌酶（T7RNA聚合酶天然抑制物）的 宿主中表达。 T7RNA溶菌酶是一种双功能 蛋白，它能够切割大肠杆菌细胞壁肽聚糖 层，也可与聚合酶结合，阻止转录。
pLysS (or pLysE）有助于目的蛋白的抽提
The presence of pLysS (or pLysE) has the further advantage of facilitating the preparation of cell extracts. After the target protein has accumulated, the cells are collected and suspended in a buffer such as 50 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, pH 8.0. Simply freezing and thawing, or adding 0.1% Triton X-100, will allow the resident T7 lysozyme to efficiently lyse the cells. This property can make it advantageous to carry pLysS in the cell even when it is not required for stabilizing the target plasmid.