酶工程在生物技术上的应用

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霉菌细胞壁
• 霉菌的细胞壁结构比较复 杂。不同种属的霉菌，其 细胞壁的组分和结构有较 大的差别。因此，若要除 去霉菌的细胞壁，需要弄 清属于什么霉菌，再选用 适宜的几种酶共同作用， 才能达到较好的破壁效果。
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藻菌纲霉菌
• 毛酶，根霉等的细胞壁主要 由几丁质和壳多糖等多种物 质组成。破壁主要采用放线 菌或细菌产生的克多糖酶和 几丁质以及蛋白酶等多种酶 混合物。这些混合多酶试剂 一般称为细胞壁溶解酶。
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PS：书本285
剪接型核酶
自我剪接酶是在一定条件下催化本身RNA分子同时进 行剪切和连接反应的R酶。 类型： I类内含子（IVS）的自我剪接 Ⅱ类内含子的自我剪接
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一、I类内含子
I型IVS是与四膜虫26srRNA前体的IVS结构相似的 间隔序列，具有环状结构。通过转磷酸酯反应，生成成 熟的26srRNA及G-IVS.
二 原生质体的制备：除去细胞壁后由细胞膜和胞内 物质组成的微球体成为原生质体。在制备原生质体或 者提取某些稳定性较差的活性物质的时候，既要除去 细胞壁，又不能损伤其他成分。这样就不能采用激烈 的破碎方法，而只能利用各种具有专一性的酶。
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去除植物细胞壁
• 细胞壁的组分是纺织、造纸、木材、胶片、增稠剂及其他工 业产品重要的原料。植物细胞壁的生物合成过程是植物生长 发
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酵母细胞壁去除
• 酵母细胞壁的厚度为0.1~0.3μ m， 重量占细胞干重的 18%~30% ， 主要由 D- 葡聚糖和 D- 甘露聚糖 两类多糖组成，含有少量的蛋白 质、脂肪、矿物质。
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葡聚糖酶
• 葡聚糖酶： β - 葡聚糖酶（ β - 1,3 1,4 葡聚糖酶）。它是采用 Bacillus Lichenifomis 菌株经过液态深层发酵 制得，该酶是一种内切酶，专一作用 于β -葡聚糖的 1,3 及 1,4 糖苷键， 产生 3 - 5 个葡萄糖单位的低聚糖及 葡萄糖。
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Chapter.1
核酶
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20世纪30年代
酶定义： 酶是一类具有生物催化作用 的蛋白质。
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1982年Cech等发现四膜虫细胞大核期间26SrRNA
前体具有自我剪接功能，并于1986年证明其内含子
L-19IVS具有多种催化功能。1984年Altman等发现 RNaseP的核酸组分M1RNA具有该酶的活性，而该 酶的蛋白质部分C5蛋白并无酶活性。Cech和 Altman因发现Ribozyme而获得1989年度诺贝尔
Chp4
细菌细胞壁
霉菌细胞壁
简介
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微生物细胞和植物细胞的表层。细胞壁对微生物的 和植物维持其细胞的形态和结构起着重要的作用， 可保护细胞免遭外界因素的破坏。但在生物工程方 面，很多时候都要去除细胞壁。
简介
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一 细胞内物质的提取：微生物和细胞内的许多物质， 如胰岛素，干扰素等基因工程菌的产物天然抗氧剂等 植物细胞代谢物等都存在细胞内。为了将这些物质提 取出来，很多时候都需要把细胞壁破坏或者除去。
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利用核酶进行基因工作治疗的策略包括5个步骤即: 1)选择合适的核酶及其载体; 2)核酶与载体连接并转导细胞; 3)核酶转录,在细胞内不断产生大量核酶分子; 4)核酶通过共有序列识别与异常基因转录产物结合; 5)异常产物被核酶剪切并被RNase降解, 核酶循环利用。
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恢复正常剪接途径
基因突变有时会在内含子中生成新的剪接点，当 然也是异常的剪接点。它们与左邻右舍原来不起作用 的隐匿的剪接点搭配起来，就会形成错误剪接。由于 原有的正常剪接点并未丧失功能，只是作用被异常剪 接抑制，所以用反义核酸通过碱基互补，封闭异常剪 接点或其他剪接元件，就可堵住异常剪接途径，迫使 剪接系统选择正确的途径，形成正常RNA。这就间接地 对RNA缺陷作了“修复”。
细菌细胞壁
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Hale Waihona Puke Baidu
除去细菌细胞壁是采用从蛋清中分离的溶菌酶。
细菌细胞壁
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合成溶菌酶工艺流程图
细菌细胞壁
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溶菌酶能专一地作用于细菌细胞壁肽多糖分子中的N-乙酰胞 壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的a-1，4-键。而对于革兰氏阴 性菌需要由溶霉菌和EDTA共同作用才能达到较好的除去细胞 壁的效果。这是因为EDTA可作用于脂多糖。
半知菌纲霉菌
• 米曲霉，黑曲霉等的细 胞壁主要由几丁质，葡 聚糖组成。破壁时主要 采用几丁质酶和葡聚糖 酶的混合物。
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Chapter.2
酶在蛋白质测序上的应用 ——羧肽酶A
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1、羧肽酶简介
羧肽酶 Carboxypeptidase，CP
羧肽酶是一种专一性地从肽链的Ｃ端逐个降解、释放游离氨基酸 的一类肽链外切酶。根据反应底物的不同，可分为A、B、C和Y四类。
北京师范大学珠海分校12生物技术2班
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酶在大分子测 酶在去除细胞壁
上的应用
2
序上的应用
目录
酶在蛋白质 测序上的应 用 氢化酶在生物制氢
上应用
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Chapter.1
酶在除去细胞壁 的应用
主要内容
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Chp1
Chp3
植物细胞壁
Chp2
酵母细胞壁
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Chapter.3
酶在大分子切割和拼接方面的应 用——以自我剪切酶和自我剪接酶为
例
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Chp1 知识概述
1.3
酶在大分子切割和拼接方面的应用——
以自我剪切酶和自我剪接酶为例
Part1 Part2 Part3 Part4
核酶
自我剪切酶
自我剪接酶
应用
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由此获得一个惊奇的发现∶内含子的切除反应发生在仅 含有核苷酸和纯化的26S rRNA前体而不含有任何蛋白质催化 剂的溶液中，可能的解释只能是:内含子切除是由26S rRNA 前体自身催化的，而不是蛋白质。 结论：IVS具有类似蛋白酶的功能，能够打断及重建 磷酸二脂键。
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为了证明剪接过程中，确实没有蛋白质参与，切赫用重 组DNA技术得到四膜虫rRNA基因中的413bP连同两侧的 DNA克隆片段，将其离体DNA克隆到细菌中并且在无细胞 系统中转录成26S rRNA前体分子，再进行SDS-酚抽提，以 保证转录产物前体rRNA不与酶蛋白结合，在电泳图谱上可 看到环状IVS，线状IVS和缺失15个核苷酸的线状物3条谱带， 结合其他一些实验结果，可以充分肯定前体rRNA可在非酶 蛋白质存在条件下进行自我剪接。
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羧肽酶 A
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2、羧肽酶A
1、外形紧密，是一个5.0nm×4.2nm×3.8nm的椭圆形球体，大 约含有38%α 螺旋，17%β 折叠片； 2、分子量约为35kD； 3、由307个氨基酸残基构成； 4、等电点为6.0； 5、存在于哺乳动物的胰脏； 6、是一类水解蛋白和多肽底物C端芳香族氨基酸或脂肪族氨基 酸残基的消化酶。
剪接机制
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类型Ⅰ自我拼接的内含子分布很广，存在于真核生物的 细胞器基因，低等真核生物核的rRNA的基因，细菌和噬菌体 的个别基因中。
类型Ⅱ内含子只见于某些真菌线粒体和植物叶绿体基因 。
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应用
医学
核酶作为基因工程药物具有两个显著优点: 1)核酶的本质是RNA,其引起免疫应答的可能 性比外源蛋白小得多; 2)一般核酶的分子比较小,易于操作。
G-IVS经两次环化生成L-19IVS。催化过程需要鸟苷 酸或鸟苷以及镁离子参与。 剪接机制
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PS：书本147
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二、Ⅱ类内含子
Ⅱ型IVS是与细胞核mRNA前体的IVS结构相似的间隔 序列。通过转磷酸酯反应，生成成熟的RNA及套环状的 IVS。催化的剪接反应不需要鸟苷或鸟苷酸参加，但仍需 要镁离子(Mg2+)。
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至于RNA的分子结构，就其化学组成上 看，也是由四种核苷酸组成的多聚体。它与 DNA的不同， 首先在于以U代替了T，其次是用核糖代 替了脱氧核糖， 此外，还有一个重要的不同点，就是绝 大部分RNA以单链形式存在，但可以折叠起 来形成若干双链区域。在这些区域内，凡互 补的碱基对间可以形成氢键(图)。但有一些 以RNA为遗传物质的动物病毒含有双链 RNA。
一、 锤头型核酶
a中N,N’代表任意核苷酸；X 可以是A、U或 者C,但不能是G；I、II和 III是锤头结构中的 双螺旋区；箭头指向切割位点。
b 是锤头型核酶的立体结构模型，白色链是核 酶，灰色链是底物RNA分子，在磷酸骨架上结 合有镁离子
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二、 发夹型核酶
50个碱基的核酶和14个碱基的底物形成了发夹状的二级结构，包括4个螺旋和5个突环。螺旋3和4在核 酶内部形成，螺旋1(6碱基对)和2(4碱基对)由核酶与底物共同形成，实现了酶与底物的结合。核酶的识别顺 序是NGUC，其中N代表任何一种核苷酸，这个顺序位于螺旋1和2之间的底物RNA链上，切割反应发生在N 和G之间。
思考：为什么有这样的实验结果？
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前体RNA
生物刚开始转录出来的RNA是不成熟的,可以称为前体 RNA。对于原核生物，当前体RNA经过加工, mRNA 由 RNA 聚合酶合成后，将里面内含子转录的部分切掉。这样 才能形成有功能的mRNA，然后从细胞核中出来。
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书本283
剪切型核酶
• 育中最主要的合成代谢之一，也是植物光合作用产物的主要 贮积方式。
破除植物细胞壁主要采用纤维素酶， 半纤维素酶和果胶酶组成的混合酶。 这几种酶大多数由霉菌发酵产生的。
细菌细胞壁
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细菌细胞壁由一些化学成分不同的物质组成，如肽聚糖、磷壁 酸、脂多糖、磷脂、外膜蛋白等，在这些组成成分中对细胞壁 的生理功能起主要作用的是肽聚糖，除少数细菌如产甲烷细菌 这类古细菌的细胞壁是由其他化学物质组成外，几乎所有细菌 的细胞壁都含有肽聚糖，在G + 细菌中肽聚糖含量高达 30% ～ 95%，G － 细菌也有5% ～ 20%的含量。
特点：这类核酶的作用是只剪不接，催化自身RNA或不同的 RNA分子，切下特异的核苷酸序列。
类型： 自体催化剪切型：RNA的前体 异体催化剪切型
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剪切机制
转酯化过程： 由靠近位点3‘端的2’OH 或氧原子对切割位点的 磷原子实施亲核攻击， 产生5‘-OH 和2’，3‘-环 磷酸二酯。
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PS:书本151
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3、羧肽酶A的活性中心
精氨酸残基 金属Zn2+ 酪氨酸残基
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3、羧肽酶A的活性中心
精氨酸残基 金属Zn2+ 酪氨酸残基
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3、羧肽酶A的活性中心
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4、催化机理
羧肽酶的催化机制 1、促进水解离机制 2、Glu-270的亲和机制
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5、锌离子的作用
1、被裂解的肽键的羰基指向锌离子，锌离子起吸电子的作用， 使C=O键比正常的更为极化，使羰基C原子更易接受亲核进攻； 2、锌离子处在非极性环境促进了诱导偶极子的产生，增加了 它的有效电荷； 3、Glu270的负电荷的逼近也对羰基上产生一个大的偶极子做 出了贡献。
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RNA分子因为是单股核酸，且其分子通常不会很长，因 此可以卷绕成一定的分子构象，可能因而具有催化的能力； 此种具有催化力的RNA，统称之为 核酶。
核酶是唯一的非蛋白酶。它是 一类特殊的RNA，能够催化 RNA分子中的磷酸酯的水解及 其逆反应。
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核酶
锤头核酶 发夹核酶 丁型肝炎病毒（HDV)核酶 RNaseP I内含子
剪切型核酶
根据催化反应 剪接型核酶
II内含子
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Chapter.2
自我剪切酶
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T.R.Cech
1981年，Thomas Cech和他的同事在研究原生动物嗜 热四膜虫的26srRNA基因中有一段内含子，该基因转录产 物——前体rRNA中相应于这段内含子的核苷酸顺序是一个 有413个核苷酸的居间序列(IVS)。在前体rRNA加工过程中 去除基因内含子时这个IVS可自我催化除去,并最后使5’→外 显子与3’→外显子连接成成熟的rRNA分子
化学奖。
切赫 Thomas Robert Cech
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为何RNA有这种功能？ 凡是具有催化功能的分子，大多与其构象有关 它会折叠成一定构型，并可辨识其所要切开的序列，其反应 也需要金属离子协助，都很像是酶的行为。
DNA是双股核酸，而且其分子量非常巨大，因此无法自由卷 绕成特定构象，都只是形成长长的双螺旋结构。