蛋白质组学-酵母双杂交实验策略

蛋白质组学-酵母双杂交联合实验策略

蛋白质作为生命活动实际执行的分子，在生物机理研究中处于非常重要的地位。随着蛋白与表型的相关关系、因果关系被逐渐阐明，生物机理的研究往往需要深入到蛋白相互作用层面。如何选择合适的蛋白分子，研究与之相互作用的蛋白网络，从而阐释生理过程也是科研实践中的经典问题。另一方面，天然情况下的蛋白互作，可以采用Co-IP等技术进行检测，然而对于植物、微生物、非模式动物等研究，往往缺乏合适的抗体，定制抗体周期长造价又高。

如何选择合适的蛋白，如何在没有抗体的情况下开展蛋白互作研究？这里，小编和大家一起分享一篇最新的文献，一起来看一看蛋白互作研究“套路”吧。

标题：Identification of proteins using iTRAQ and VIGS reveals three bread wheat proteins involved in the response to combined osmotic-cold stress

期刊：J ournal of Proteome Research

主要技术：iTRAQ、酵母双杂交（Y2H）

研究背景：非生物逆境压力（Abiotic stress）对作物的影响巨大，其具体机制尚不明确。本文拟通过蛋白质组学与酵母双杂交等技术，初步研究渗透压-寒冷联合胁迫对小麦生长影响的机制。

研究结果：

1. 渗透压-寒冷联合胁迫影响小麦表型

对实验材料渗透压-寒冷联合胁迫处理24小时，可以发现其高度、根系长度、根与叶的重量等一系列表型发生显著的变化。

图1 渗透压-寒冷联合胁迫对小麦表型的影响

2. 渗透压-寒冷联合胁迫影响小麦蛋白表达

分别提取实验组（渗透压-寒冷联合胁迫处理）与对照组小麦根和叶片的蛋白，采用iTRAQ标记进行蛋白质组学研究，分别鉴定到3703（根）和3009（叶）个蛋白，其中差异表达蛋白分别为250（根）和258（叶）个。对差异蛋白分别进行GO和KEGG分析，从整体上分析差异表达蛋白的生理功能（图2）。

图2 差异表达蛋白的GO与KEGG通路分析

3. 差异表达蛋白的结合分析与验证

对差异表达的蛋白分别进行蛋白-蛋白互作分析（PPI，图3），揭示其蛋白互作网络。选择其中5组互作蛋白，采用酵母双杂交（Y2H）技术进行点对点验证，最终发现1组存在强相互作用，1组存在较弱的相互作用（图4）。

图3 差异蛋白的PPI分析

图4 酵母双杂交（Y2H）验证蛋白互作

研究小结：

在该研究中，首先通过表型实验发现暴露于渗透压-寒冷胁迫24小时的小麦幼苗显示出抑制生长，以及增加的脂质过氧化，相对电解质渗漏等表型变化。随后采用基于iTRAQ的定量蛋白质组方法确定暴露于渗透压-寒冷胁迫条件下的小麦幼苗的根和叶的蛋白质组学特征，在根与叶中共鉴定出250个和258个差异表达蛋白质，并且这些蛋白质中的大多数显示出不同的丰度，从而揭示了器官特异性的差异。接着采用PPI互作分析阐释差异表达蛋白参与的互作调控网络，揭示蛋白互作网络在胁迫条件下的变化。最后从PPI分析中选出5对互作蛋白进行验证，确认胁迫造成的蛋白互作变化。

总结一下，本文采用了生理实验验证表型——蛋白质组学鉴定差异表达蛋白——PPI分析蛋白互作——酵母双杂交Y2H验证蛋白互作的经典套路，你学到了吗~

天然情况下，一般采用Co-IP等进行蛋白互作验证，而对于植物、微生物、非模式动物等，酵母双杂交（Y2H）完全可以帮您解决缺乏合适抗体，定制抗体周期长造价又高的难题。