植物制片技术01

选用石蜡的原则： 夏季或材料质地较为坚硬，选用高熔 点的石蜡；冬季或材料质地较为幼嫩、 柔软，选用低熔点的石蜡为宜。
五、浸透和包埋
包埋器材： 纸船（柔韧的纸折叠而成）、温台、 镊子、酒精灯。
五、浸透和包埋
包埋步骤： （1）熔化的石蜡倒入纸船，镊子夹取渗透 好的材料放入纸船中。 （2）纸船表面的石蜡开始凝结，将其放入
✤固定液的渗透力
1）选择固定剂时，要充分考虑
固定液的性质、浓度和温度对
渗透力的影响。 2）植物材料的大小和组织紧密 程度对渗透的影响。
影响固定的因素
✤固定的时间
固定剂对不同种类的植物及其不
同器官完成固定的时间不同。
过短，固定不均匀；过长对材料 有不良影响或不易着色。
影响固定的因素
✤固定液的用量
固定液用量不可太少，为材料
五、浸透和包埋
包埋：以特定的器皿将材料及石蜡 制成适宜切片的形态。 石蜡性质与切片的成败密切相关。
五、浸透和包埋
包埋剂特点：
石蜡有熔点为52、54、56、58度四种
不同的石蜡。
石蜡熔点不同，性质不同。低熔点的
石蜡质地均一，而56-58度的石蜡质地
较为疏松，有小的空隙，易使蜡带不
成带。
五、浸透和包埋
石蕊和苏木精等。
八、染
人工染料：
色
也称煤焦油染料，多从煤焦油中
提取获得，是苯的衍生物。
八、染
染料的性质
色
染料可按其电离后染料离子所 带电荷的性质，分为酸性染料、碱 性染料、中性（复合）染料和单纯 染料四大类。
八、染
1、酸性染料
色
这类染料电离后染料离子带负 电，如伊红、刚果红、苯胺黑、苦
味酸和酸性复红等，可与碱性物质
三、清洗与脱水
常用的脱水剂 4）丙酮：分子式CO(CH3)2，为无 色透明液体。 脱水快于酒精，仍须经过透明。
三、清洗与脱水
常用的脱水剂 5）甘油：分子式C3H5(OH)3，无色 透明粘稠液体。 避免原生质的收缩，适用于细小
柔软材料。
四、透明与过渡
材料除尽水分后，多需要经过一 种既能与脱水剂又能与包埋剂混合 的溶剂处理，以便于包埋剂的渗入。 同时，这种溶剂能使材料变得透明， 因此，该步骤称为透明。
三、清洗与脱水
1）清洗：洗去材料中的固定液。 清洗剂：常用水或酒精溶液。
在操作时，根据固定液来选择。
三、清洗与脱水
固定液 FAA
纳瓦兴或其 它弱酸类 含苦味酸的
清洗剂 同浓度的酒精 水
备
注
70%酒精溶液 水
水或酒精来自百度文库液
苦味酸-甲醛 除外
锇酸类
氯化汞类
流水冲洗
以碘液检测是 否清洗干净
三、清洗与脱水
• 常用固定剂
7、重铬酸钾：分子式K2Cr2O7，橙色结 晶粉末，强氧化剂。 特点：渗透慢，强硬化作用。 8、氯化汞：分子式为HgCL2，剧毒无色 粉末。杀死强，渗透快， 沉淀蛋白，有 强的收缩作用。不单独使用。 9、碘：分子式为I2 ，良好的防腐剂
二、固定、保存
•混合固定液种类及应用（一）
二、固定、保存
三、清洗与脱水
常用的脱水剂 2）正丁醇：
分子式 CH3CH2CH2CH2OH。无色液体，有 酒味。能与乙醇、乙醚及其他多种有机溶剂 混溶。蒸气与空气形成爆炸性混合物，易燃
物。毒性与乙醇相同，但刺激性强，有使人
难以容忍的恶臭。
三、清洗与脱水
正丁醇的使用：
使用时与酒精以一定比例混合，最后使 用纯溶液。 优点：省略了透明，直接渗蜡。
植物制片的各类方法 植物组织化学的测定
概
目的：
论
为观察植物内部细微结构，将植物材料 制成适合显微镜观察的薄片。
概
• 制片分类：
论
保存时间分：临时制片、永久制片 制作方法分：活体观察、切片法、
非切片法。
概
• 活体观察：
论
对材料不加任何处理直接观察， 达到镜检目的。
概
• 切片法：
论
用刀具将材料切成薄片，进行
酸，100ml蒸馏水配制。
最常用的粘片剂，可长期保存。
七、粘片与展片
常用的粘片剂与展片 2）蛋白粘片剂 新鲜鸡蛋白25ml，甘油25ml，石炭酸 0.5g配制而成。 常用于动物制片。 粘贴性差，1---2月后失去粘性。不可长 期保存，易腐败。
八、染
染色的基本原理 物理作用： 1、吸附作用 2、组织、细胞吸收 3、沉淀作用 4、化学作用
结合成盐。
八、染
2、碱性染料
色
这类染料电离后染料离子带正电， 可与酸性物质结合成盐。实验室一般
常用的碱性染料有甲基紫、结晶紫、
碱性复红、中性红、孔雀绿和蕃红等。
八、染
3、中性（复合）染料
色
酸性染料与碱性染料的结合物 叫做中性（复合）染料，如基姆萨 氏（Gimsa）染料等，后者常用于细 胞核的染色。
• 混合固定液种类及应用（二）
二、固定、保存
混合固定液种类及应用（三）
二、固定、保存
固定的成败直接关系到实验结果。
固定的效果
固定好的材料结构清晰，层次分明，
能真实地反应材料的结构特征。
影响固定的因素
✤固定液的选择
根据观察目的和对象，选择固
定剂。同时，要充分考虑植物
种类、不同器官的特性。
影响固定的因素
二、固定、保存
• 理想固定剂具备的特点
1、快速渗入材料，杀死原生质，固定
其细微结构；不因固定等人为因素 发生变化。 2、增加细胞结构及内含物的折光程度， 使之更为清晰，适合显微镜观察。
理想固定剂具备的特点
3、组织或细胞不发生收缩或膨胀
4、能增加染色或媒染能力。
5、增加组织的硬度易于切片，但不至 于过于松脆。 6、具有保存作用。
体积的20—50倍为宜。
植物细胞中含有大量水分，会 稀释固定液。
影响固定的因素
✤材料切取
保持材料新鲜，避免机械损伤。
切割的材料立即投入固定液中。
影响固定的因素
✤使用具有还原性和氧化性的固 定液，中途需更换一次新液。
影响固定的因素
✤抽真空
植物材料有大量孔隙，适当抽
去其中的气体，有利于材料的
固定。
六、切片
切片时，右手旋转手柄，左 手拿毛笔，挑起蜡带，达到 15-20厘米后用刀片切断。
七、粘片与展片
七、粘片与展片 使用药剂将蜡带粘在洁净的载玻 片上的步骤，称为粘片。 粘片时，使用水或药剂使皱缩的 蜡片以及材料，在适宜的温度下
伸展开的过程，称为展片。
七、粘片与展片
常用的粘片剂与展片 1）Haupt粘片剂 由明胶1g，15ml甘油，2g石炭
• 常用固定剂
3、冰醋酸：分子式为CH3COOH，是 具有强烈刺激性气味的无色液体。 特点是渗透力强，可防腐，保存蛋白 质和染色体，但溶解脂肪，有膨胀作 用。 4、铬酸：分子式为H2CrO4，是CrO3 的水化物，为红棕色晶体，强氧化剂。 可沉淀蛋白、核酸。有收缩、渗透慢、 硬化的缺点。
二、杀死、固定、保存
八、染
4、单纯染料
色
这类染料的化学亲和力低，不
能和被染的物质生成盐，其染色能
力视其是否溶于被染物而定，因为
它们大多数都属于偶氮化合物，不
溶于水，但溶于脂肪溶剂中，如苏
丹类（Sudanb）的染料。
八、染
1、脱蜡，梯度进行。
色
染色的基本程序（番红固绿对染为例）
2、复水，梯度酒精进行。 3、染色，番红。 4、95%固绿染色。 6、脱水，透明。 7、封片。
冷水中，促进石蜡短时间内凝固。
（3）过夜后，取出备用。
五、浸透和包埋
六、切片
（1）修块：
将包有材料
的蜡块修成
一个上窄下
宽的台体。
粘在木块上，
即可切片。
六、切片
旋转切片机
样品台
手柄
刻度盘
刀架
六、切片
六、切片
（2）切片：将蜡块夹在切片机上；调 整刀口，刀刃与蜡块平行；调整刀的 倾角；调整切片厚度；切片。
绪 论
• 植物显微技术的近代发展
多种功能显微镜的使用
透射、扫描电子显微镜技术的发明
多种切片技术的运用
绪 论
植物显微技术的发展热点 免疫化学与显微技术的结合 分子生物学向显微技术的渗透
植物显微技术
植物制片技术 光学显微镜技术
显微摄影技术
植物制片技术
第一章 概论
第二章
第三章 第四章
植物制片的步骤原理
绪
论
三、植物显微技术发展简史
植物显微技术的诞生与早期发展，
最早可追溯到列文•虎克的显微镜与
发现。方法非常简陋，材料未经任 何处理直接在显微镜下观察，显微 镜的分辨率也比较低。
绪
固定法出现 石蜡切片法的发明 染色方法的使用
论
• 植物显微技术的日渐成熟
早期显微图谱为手绘，以后采用照相技术 高分辨的显微镜制造使用
一、选 材
根据研究和观察的目的确定取材 的部位。 原则是“准、巧、小”。
一、选 材
• 植物材料的切取： 根、茎类轴性器官的切取： 1、横切面：观察各种组织的横切面，及其所 占比例。垂直于长轴方向切取。 2、纵切面：观察各种组织的纵切面，平行于 长轴方向切取。 分为：径向切面和切向切面。
一、选 材
四、透明与过渡
常用的透明剂 1）二甲苯
五、浸透和包埋
渗透：经过脱水、透明之后，将 包埋介质逐步浸入材料，使之渗入细 胞各部，并与细胞壁紧密结合，这个 过程为渗透。 原则：逐级进行，石蜡的浓度由 低到高。
五、浸透和包埋
步骤： （1）材料浸入2/3的二甲苯、1/3石蜡 的溶液，30-40度过夜。 （2）升温至56度，材料浸入1/2 的二甲 苯、1/2石蜡的溶液，历时2个小时。 （3）材料浸入1/4 的二甲苯、3/4石蜡 的溶液，历时2个小时。 （4）材料浸入纯石蜡溶液，历时2个小 时。重复一次。可进行包埋。
• 叶的切取：横切面。
二、固定、保存
固定：在杀死基础上，组织或细胞保 持生活的状态，并在以后制片的过程 中不发生变化。 保存：组织或细胞保持生活的状态， 能保存较长时间不发生任何变化。
二、杀死、固定、保存
• 固定的原理
化学作用：凝结作用。如蛋白质 变性。 物理作用：沉淀作用，如油类、 脂肪遇锇酸发生黑色沉淀。
• 常用固定剂
5、苦味酸：淡黄色晶体，分子式为C6H2
（NO2）3OH，强烈的爆炸物，以过饱 和水溶液保存。具有渗透力强，沉淀蛋 白、核酸，防硬化，增染色的特性，是 优良的固定剂。 6、锇酸：分子式为OsO4，是灰黄色的 晶体。最好的固定剂，脂类的唯一固定 剂，但渗透慢，易出现固定不均现象。
植物制片技术原理步骤
二、固定、保存
• 常用固定剂
1、酒精：分子式为C2H5OH，是常用的 有机溶剂，能与水以任意比互溶。是良 好的固定剂，杀死速度极快。缺点：具 收缩作用。 2、甲醛：分子式为HCOH，是气体。作 为固定剂时，为溶于水的溶液（38%） 来使用。有良好的硬化作用，也有收缩 固定过度，渗透慢的缺点。
二、杀死、固定、保存
三、清洗与脱水
常用的脱水剂 3）叔丁醇：
分子式(CH3)3COH，樟脑气味的无色 结晶，在少量水存在时则为液体。溶 于乙醇、二甲苯、水。有毒，对中枢 神经系统具有麻醉作用，对皮肤粘膜 有轻度刺激作用。为易燃易爆物。
三、清洗与脱水
叔丁醇的使用：
逐级进行。 不会使组织收缩或变硬。 省略脱水和透明的步骤。
色
八、染
染色的原则
色
低浓度。 适宜温度与时间。 合适的固定剂。 材料从某溶液取出进入染液时，两种 溶液浓度应相同。 经过酸或碱溶液后，必需彻底清洗。 染色与分色适时检查。
八、染
染料的种类
色
染料分为天然染料和人工染料两种。
八、染
天然染料：
色
多从生物体中提取得到，其成
分复杂。常见有胭脂虫红、地衣素、
植物显微技术
绪
论
一、什么是植物显微技术
用于观察研究植物内部精细结构的
技术方法，包括制片技术、光学显微
镜技术和显微摄影技术，是一门建立 在生物学、化学以及物理等多门学科 基础之上的综合性技术性学科。
绪 论
二、植物显微技术的任务和目的
根据材料的自然特性，观察
和研究的需要，将材料制成适宜
的薄片，选择合适的显微镜，显 示材料正确而清晰的结构，获得 反映材料真实特征的显微照片。
镜检。 有徒手切片，石蜡切片，半 薄切片等。
概
• 非切片法：
论
不同于上述两种制片方法，用化学 药剂处理材料后进行观察。
有离析法、涂抹法、整体封固法、
透明法等。
第二章 植物制片技术原理步骤
选材 清洗与脱水 渗蜡与包埋 粘片与展片 杀死、固定与保存 透明与过渡 切片 染色
封片
植物制片技术原理步骤
• 制片的步骤： 选材固定清洗脱水透明 浸蜡包埋切片粘片脱蜡染 色脱水封固。 先后顺序不可颠倒，环环相扣。
2）脱水 用药剂将材料中的水分置换干净。 作用：
＊硬化材料 ＊便于透明剂、包埋剂的渗入。
三、清洗与脱水
常用的药剂 1）酒精：最常用的脱水剂。 优点：能与水以任意比互溶，方 法简便易学。
缺点：不溶于石蜡等包埋剂；
易使材料硬化，而不利于切片。
三、清洗与脱水
酒精的使用： 使用酒精脱水时，酒精溶液浓度宜由低 到高，逐级进行。 在各级酒精中停留时间，依据材料的 大小、软硬程度而定。坚硬的和较大 的材料时间宜长，柔软的、较小的材 料时间宜短。