农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验步骤修订稿
农杆菌介导的烟草高效遗传转化体系研究
转化技术体系, 为分子生物学和植物基因工程的研 究提供较好的技术基础。
1 材料与方法 1. 1 实验材料 1. 1. 1 植物 材料 四 倍 体烟 草 ( Nicotiana tabacum ) 品系 NT12 的无 菌 试 管 苗, 以 MS 为 基 本 培 养 基[ 3] , 附加 3% 蔗糖, pH 5. 8, 于 24 e 、自然光下培
平均阳性 植株数 ( 株/ 块)
阳性植株 频率 ( %)
1. 5 cm @ 1. 5 cm
23
7
30. 4
1. 0 cm @ 1. 0 cm
20
11
55. 0
0. 5 cm @ 0. 5 cm
4
2
50. 0
2. 2 预培养对转化率的影响 实验结果表明, 无论是经过 3 d 预培养的烟草
叶盘, 还是 未经预培养而直接 侵染的叶盘, 都约在 1421 d 后从表面创伤处及边缘出现芽点, 并逐渐长 大成为有几片幼叶的小芽。二者的分化时间、再生 芽的频率没有明显差异。所以, 为了缩短转化时间, 烟草叶盘转化可省去预培养。 2. 3 侵染时间对转化率的影响
图 2 部分转基因植株 PCR 检测结果 M: DNAmarker,K- EcoT 14I digest( TakaRa) ;
农杆菌的浸染实验的注意事项
农杆菌的浸染实验的注意事项《农杆菌的浸染实验的注意事项》农杆菌浸染实验就像是一场微观世界里的“细菌特工潜入行动”，每个环节都需要我们精心操作，稍有差池就可能让整个“任务”失败。
下面就来详细说说这个实验中的注意事项。
一、实验材料准备阶段1. 植物材料的选择- 这就好比是选演员，要选对主角。
植物材料要健康、生长状态良好。
如果植物本身就病恹恹的，那农杆菌这个“小特工”可能都找不到合适的“潜入点”。
比如，你不能拿已经快被虫子吃光叶子的植物来做实验，就像你不能让一个瘸腿的运动员去参加百米赛跑一样。
要选择幼嫩的组织，像是刚萌发的叶片或者嫩茎等，这些部位细胞分裂活跃，更容易被农杆菌感染，就像年轻的士兵更容易接受新的训练任务一样。
2. 农杆菌菌株的保存与活化- 农杆菌菌株就像是我们的特种部队，保存的时候一定要小心翼翼。
要在合适的温度（通常是 - 80℃或者液氮中）保存，这就好比是把特种部队放在一个安全的秘密基地里。
活化的时候，要严格按照操作规程，在合适的培养基上，给予恰当的营养成分，就像是给士兵们提供充足的食物和装备一样。
如果活化不当，农杆菌的活性就会大打折扣，就像士兵们饿着肚子、没带武器就去执行任务，肯定是不行的。
二、浸染过程中的注意要点1. 浸染液的制备- 浸染液里农杆菌的浓度可是个关键因素。
浓度太低，就像派出的特工人数太少，难以完成对植物细胞的“攻占”；浓度太高呢，又可能会把植物细胞“撑坏”，就像一群人挤在一个小房间里，结果谁都动弹不得。
一般要通过预实验来确定最佳的农杆菌浓度。
而且，浸染液里还可能需要添加一些辅助物质，比如乙酰丁香酮，它就像是给农杆菌特工们的“导航仪”，帮助农杆菌更好地找到植物细胞并进行浸染。
2. 浸染时间的控制- 浸染时间就像是一场限时的魔术表演。
时间太短，农杆菌还没来得及大展身手，就被赶出了植物细胞的“城堡”；时间太长呢，植物细胞可能会被农杆菌折腾得“奄奄一息”。
不同的植物材料和农杆菌菌株可能需要不同的浸染时间，这就需要我们不断地摸索，就像魔术师要不断练习才能掌握最佳的表演时长一样。
农杆菌侵染烟草原理
农杆菌侵染烟草原理
农杆菌是一种重要的植物病原菌，对烟草等植物的侵染具有很强的病原性。
其侵染烟草的原理主要有以下几个方面：
1. 构建T-DNA
农杆菌通过水平转移(plasmid)方式，将其含有的T-DNA转移到宿主细胞内。
T-DNA包含了多个基因，这些基因能够通过改变植物细胞的代谢和生长，从而使农杆菌得以侵染宿主细胞。
2. 激活植物细胞
T-DNA进入植物细胞后，由于其带有一个转录起始子，可以激活植物细胞的转录和翻译系统。
T-DNA序列会在宿主植物的基因组中插入，并产生一些蛋白质，例如植物生长激素和生长素，这些蛋白质会改变宿主植物的生长，从而使其更易受到农杆菌的侵染。
3. 抵抗机制
为了抵御农杆菌的侵染，植物细胞会产生一些反应，包括抗生素和抗菌蛋白，来抵抗农杆菌的入侵。
然而，农杆菌也会产生一些抗性基因，能够逃避植物细胞的抵抗，并使其成功侵染植物细胞。
总之，农杆菌通过构建T-DNA和激活植物细胞的生长和代谢，以及逃避植物细胞的抵抗机制，成功侵染了烟草等植物。
对于农业生产来说，防治农杆菌侵染十分重要，需要采取科学的防治措施。
- 1 -。
20 【终版】农杆菌介导的烟草转gfp基因(叶盘法)
1 实验背景什么是“植物转基因技术”“转基因植物”？植物转基因技术：把从动物、植物或微生物中分离获得的目的基因，或者经过修饰的目的基因，通过各种方法转移重组到植物基因组内，使之稳定遗传并赋予植物新的遗传性状的方法。
转基因植物：通过植物转基因技术获得的、整合有外源基因的植物个体。
1 实验背景为什么要进行植物转基因？优势：◆农业：生产抗逆、高产、优质、抗病虫、除草剂、营养品质改良等优良性状的作物；遗传育种等。
◆制药、化工等：可作为生物反应器，生产药用蛋白和有用次生代谢物，或生产某些有机化合物等。
◆园艺：美化生活等，如蓝玫瑰等。
◆科学研究：生物学、遗传学等多领域基础研究等。
1 实验背景怎样将外源基因转入植物？间接转化法(载体介导)病毒介导法农杆菌介导法（双子叶/单子叶）种质系统介导法胚囊和子房注射法生殖细胞侵染法花粉管通道法直接转化法物理法化学法基因枪法(单子叶植物)显微注射法电击法超声波法PEG 法脂质体法1 实验背景各种转基因方法的区别是什么？（引自崔广荣，2003）1 实验背景针对不同植物，怎样选择转基因方法？目前转基因植株中，约80%以上通过“农杆菌介导转化法”获得。
植株特点首选方法备注对农杆菌敏感农杆菌介导法效率高，方法成熟，转基因植株遗传稳定。
原生质体培养容易直接转化法（如PEG 法）转化率高，可克服转基因植株嵌合体的难题。
多胚珠花粉管通道法提高转化率子房中有较大单胚珠植物(如核果类)显微注射法提高转化率转化难度大的植物基因枪法其它方法不可行时的备选放射性农杆菌发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes根瘤农杆菌Agrobacterium tumefaciens旋钩子农杆菌1 实验背景农杆菌为什么能够介导基因转入植物？土壤农杆菌革兰氏阴性菌RiTi 质粒(tumor inducing plasmid ）约150~200 kb向植物细胞传递外源基因Ti1 实验背景农杆菌为什么能够介导基因转入植物？Vir 区:毒性区，包含多个致病基因，能激活T-DNA 的加工、剪切、复制及转入植物细胞，并使农杆菌表现出毒性。
烟草农杆菌转化实验步骤1
烟草农杆菌转化实验实验配方：1LRMOP: 20×大量元素50ml200×微量元素5ml200×有机5ml200×铁盐5ml3%蔗糖30g0.8%琼脂（国产）4g/500ml灭菌后，每500ml培养基加入:0.1mg/L NAA 1mg/ml NAA 50μL1mg/L 6-BA 1mg/ml6-BA 500μLYEB:液体培养基：1L酵母提取物1g牛肉膏5g蛋白胨5g蔗糖5gMgSO4•7H2O 0.5gpH7.0 高压灭菌。
固体培养基：每升YEB 液体培养基加15g 琼脂粉，高压灭菌。
卡那霉素（Kan）储液：100mg/ml利福平（Rif）储液：50mg/mlYEB 固体培养基平板: 灭菌后的YEB 固体培养基待其温度降至50℃时加入卡那霉素（Kan）和利福平（Rif），至终浓度为50mg/l，混匀后立即倒入培养皿，凝固后4℃倒置保存。
一．农杆菌感受态细胞的制备（1）划线活化农杆菌，挑取农杆菌单菌落于3ml的YEB液体培养基（含Rif 50mg/l）中，28℃振荡培养过夜；（2）取过夜培养菌液1ml接种于50ml YEB（Rif 50mg/l）液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.5；（3）取2ml菌液，13000rpm，离心30sec, 弃上清；（4）加入10ml 0.1M CaCl2，使农杆菌细胞充分悬浮，冰浴30min；（5）13000rpm，离心30sec，弃上清，置于冰上，加入2.5ml预冷的0.1M CaCl2，充分悬浮细胞，分装在1.5ml EP管中，液氮中速冻1min，置-80℃冰箱保存备用。
二．质粒DNA导入农杆菌①电转法：1.取农杆菌感受态在冰上冻融；2.加2μL质粒DNA于100μL感受态细胞中，用枪头轻轻搅拌混匀；3.然后再将其转入电转杯中（不要产生气泡），在2500V高压下电击；4.取出电转杯，加入500μL预冷的YEB培养基（不含抗生素），轻轻吹打混匀，吸出菌液转入1.5ml离心管中，28℃，200rpm振荡培养5h；5.取30-40μL菌液涂在含相应抗生素（50mg/l Kan和50mg/l Rif）的YEB平板上，28℃倒置培养1.5-2天；6.挑选单菌落PCR检测，将阳性菌落保存。
实验四、农杆菌转化烟草和拟南芥课件
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CATALOGUE
实验总结
实验收获与体会
掌握了农杆菌转化法的基本 原理和操作流程。
了解了烟草和拟南芥作为实 验材料的优缺点。
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学会了如何进行抗性筛选和 分子检测验证转基因植株。
培养了实验操作技能和团队 合作精神。
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等方法进行评估。
表型分析对于筛选具有优良性状的转基 因植株具有重要意义。
转化细胞的遗传稳定性分析
转化细胞的遗传稳定性分析是评估转 基因植物遗传物质稳定性的重要步骤 。
一般情况下，经过多次繁殖后，转化 细胞或转基因植株仍能保持稳定的遗 传特性，则认为遗传稳定性较好。
通过连续繁殖转化细胞或转基因植株 ，并定期进行PCR检测和表型分析， 可以观察遗传物质的变化情况。
其他试剂
如抗生素、质粒 DNA等。
农杆菌转化烟草和拟南芥
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将外源基因克隆到农杆菌的质 粒载体上。
将重组质粒转化到农杆菌中。
将农杆菌接种到植物受体材料 上。
在培养条件下培养植物受体材 料，使农杆菌与植物细胞相互
作用并导入外源基因。
基因枪法转化植物细胞
胞，促 进其再生和表达外源 基因。
实验原理
植物基因工程简介
植物基因工程是通过改变植物 的遗传物质来改良植物性状的 一门科学。
它利用基因工程技术将外源基 因导入植物细胞，并在植物细 胞内表达，从而获得具有优良 性状的转基因植物。
植物基因工程的应用范围广泛 ，包括抗虫、抗病、抗除草剂 、提高产量、改良品质等。
农杆菌的特性
农杆菌是一种土壤细菌，属于根瘤菌科。
农杆菌侵染烟草原理
农杆菌侵染烟草原理农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种常见的细菌，它引起了许多植物疾病，并广泛应用于植物基因转化和构建转基因植物。
农杆菌感染的方式分为两个主要步骤：附着和转化。
首先，农杆菌通过其特殊的附着鞭毛附着在植物细胞的表面。
这些附着鞭毛具有与植物表面组织相互作用的能力，帮助菌体在细胞壁上定位。
然后，农杆菌进一步通过组成细菌群体的多聚糖特异性识别植物细胞并贴附在其表面。
这个过程涉及的多聚糖是菌体外表面中的一种多糖物质，称为Beta-1,2-葡聚糖。
该多糖与植物细胞表面的特定受体结合，使细菌固定在植物细胞表面。
接下来，农杆菌通过化学信号释放细菌表面小分子信号物质，称为诱导物质。
这些诱导物质与植物细胞的感受器相互作用，诱导植物细胞启动反响。
在感染过程中，农杆菌释放的Ti质粒在接触植物表面后激活，融入植物细胞胞质。
这个过程主要涉及到Ti质粒上的一些基因区域，称为过渡区，它负责将外源基因转移到植物细胞中。
接下来，T DNA被运送到植物细胞的细胞核中。
T DNA的传输过程主要受T基因（vir基因）的操控，这些基因编码用于T DNA传输的蛋白质。
一旦T DNA被引入细胞核，它会被整合到植物细胞的基因组中，并在细胞分裂过程中通过传代进行稳定遗传。
这个过程涉及到转座酶（T nase）等蛋白质的参与，它们帮助将T DNA插入植物基因组的特定区域。
总之，农杆菌侵染烟草的原理涉及一系列复杂的分子交互作用和基因调控过程。
通过附着、感染、引入TDNA以及其整合到植物基因组中，农杆菌成功地将外源基因引入烟草细胞，并构建转基因烟草。
这为基因工程研究和转基因植物生产提供了重要的工具和方法。
农杆菌注射烟草转化
农杆菌注射烟草转化编辑整理：尊敬的读者朋友们：这里是精品文档编辑中心，本文档内容是由我和我的同事精心编辑整理后发布的，发布之前我们对文中内容进行仔细校对，但是难免会有疏漏的地方，但是任然希望（农杆菌注射烟草转化）的内容能够给您的工作和学习带来便利。
同时也真诚的希望收到您的建议和反馈，这将是我们进步的源泉，前进的动力。
本文可编辑可修改，如果觉得对您有帮助请收藏以便随时查阅，最后祝您生活愉快业绩进步，以下为农杆菌注射烟草转化的全部内容。
农杆菌注射烟草实验步骤农杆菌转化1. 取1µl 质粒加入50µl 刚冻解的农杆菌感受态中（提前准备1mlLB 培养液，1.5ml 灭菌管,电击杯，移液枪，枪尖等）.★感受态易失效，准备工作须充分2.吸取菌液打入电击杯，（不要产生气泡)，放入电击仪（调manal 至1。
6—1。
7）。
3.电击完立即加入1mlLB 培养基，混匀，并吸至新的离心管中。
4.28℃,摇2h （过程中可以准备抗性板子，或提前准备)。
5.涂板，(使用kan+rif 双抗板）28℃培养36h 。
6. 可做菌落PCR 检测是否转化成功,同时做菌种保藏（根据实验需要）.接菌注射1. 挑菌转接3ml 双抗培养基，27℃摇菌过夜。
★玻璃试管摇菌效果要好些2. 取20µl 菌液到20 mlLB 培养基中，(20mlLB + 100ml/L MES + 20µmol/L AS+500µlkana/L ）摇菌过夜至OD 值为1.0-1.5.●不加Rif ★准备两份，最后调OD 值会用到。
3. 3560r/min ，10min 弃上清.4. 配缓冲液MMA （H 2O+MES 10ml +MgCl 2 10ml +AS 1ml ），现配现用。
用等量缓冲液重悬菌液。
一份等量,一份少量5. 调菌液OD 值至1。
0，室温放置1h 。
将需要混合的菌液等体积混合,可注射。
农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验步骤
农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验步骤第一篇：农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验步骤农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验步骤整理人：早熟组赵凤利一、准备试剂：1.加有三抗的YEB或LB液体培养基，用于摇菌；2.渗透液(50ml)：250mg D-glucose，5ml MES 原液，5ml Na3PO4·12H2O 原液，5ul 1M 乙酰丁香酮原液，加dH2O至50ml。
1).500 mM MES(Sigma)：4.88 g溶于50ml dH2O，保存于4℃2).20 mM Na3PO4·12H2O(BDH)：0.38 g 溶于50ml dH2O，保存于4℃3).1M 乙酰丁香酮：0.196 g，加DMSO至1 ml，可分装成小剂量，存于-20℃。
二、实验步骤：1.将检测成功的农杆菌菌液过夜扩摇，28℃,200rpm；2.取1-1.5 ml 菌液，加到灭菌的1.5ml离心管中；3.1000 g，10 min，沉淀菌体(室温)，去上清，加1 ml 渗透液，悬浮菌体；4.重复步骤3，进一步除去少量的抗生素；5.取少量悬浮菌液稀释10倍，测定OD600值，并乘以10，作为悬浮菌液的OD600值；注：如果悬浮菌液的OD600值在1.5-2.0之间，说明有大量的死菌细胞，将降低转化的效率。
6.确定悬浮菌液对渗透液的滴定度，计算稀释系数，使最终悬浮菌液(用于侵染)为0.5-5.0 ml，OD600为0.01-0.1，通常0.5-1.0 ml 的最终悬浮菌液就能满足侵染了；如：需要OD600=0.1的500 ul最终悬浮菌液，而测定的悬浮菌液的OD600=0.4，则最终悬浮菌液中，悬浮菌液的用量为(0.1*500)/0.4=125 ul，则需要渗透液为375 ul。
7.在1.5ml离心管中，配好最终悬浮菌液，准备侵染；8.侵染前，将烟草放于白色荧光灯下1 h，使其气孔打开；9.选择倒三叶和倒四叶，用于侵染(于两叶脉之间侵染)，一株选两叶，侵染一种菌液；10.用去掉针头的注射器，轻柔地摩擦待转叶片的背部(0.5 cm2)，或用小针头刺穿，以去除其蜡质层；11.侵染前，用记号笔标记待转区域；12.将第7步中的最终悬浮菌液吸入1ml去针头的注射器中13.将注射器对着叶片背面的待转区域，一手按着叶片上面，另一手轻轻推动活塞，直到看到液体扩散，再侵染其他部位，侵染后，用记号笔圈定侵染区域；14.将侵染后的烟草放回培养室15.2-3天后：1).亚细胞定位实验：切掉侵染区域，制片，荧光显微镜观察；2).启动子GUS活性：GUS染色，75%酒精脱色，观察结果。
实验农杆菌转化烟草和拟南芥PPT演示文稿
植物基因转化受体
高效稳定的再生能力 较高的遗传稳定性 具有稳定的外植体来源 对选择性抗生素敏感 对农杆菌侵染有敏感性
植物基因转化受体系统类型： 愈伤组织再生系统 直接分化再生系统 原生质体再生系统 胚状体再生系统 生殖细胞受体农杆菌介导法
基因枪法 PEG诱导原生质
总之，T-DNA的整合是通过植物靶DNA和T-DNA间短的同源区段 发生重组而完成的，在接口附近伴有DNA顺序的转换和重复。
7
真空浸透法转化拟南芥
• 拟南芥种子消毒与萌发，播种后生长出现花蕾后打顶，待侧枝长出花蕾后，侵染前 受体材料 一天去除已开花蕾和果荚
• 接种含有表达载体的农杆菌GV3101克隆于5 mL YEP液体培养基(Rif 100 μg/mL， 接种 Kan 50 μg/mL)中，28 °C，200 rpm振荡培养过夜
• 将过夜培养的菌液按照1:100的比例转接到50 mL新鲜配制的YEP液体培养基(Rif 100 活化 μg/mL，Kan 50 μg/mL)中，28 °C，200rpm振荡过夜培养至菌液OD600为1-2
• 收集菌体，重悬于浸染缓冲液(1/2MS，5%蔗糖，0.015% Silwet L-77)，将菌液稀释 诱导 至OD600为0.6-0.8
侵染
• 用1 ml注射器注射烟草叶片，避光培养约48 h后，Gus染色观察
10
乙酰丁香酮
Vir区基因的活化直接调控着T-DNA的转移，酚类化合物对Vir区基因的活化具 有重要作用。 乙酰丁香酮（Acetosyringone，分子式:HOC6H2(OCH3)2COCH3）AS：
遗传转化中常用的诱导能力较强的一种酚类化合物，乙酰丁香酮之所以能 够提高外植体的转化频率，是因为它可诱导农杆菌Vir基因活化，从而促进外 源基因的整合。 使用方法： 在侵染前4-6h加入液体培养基，使农杆菌既处于对数生长期，又处于vir基因 高度活化状态，从而提高侵染能力 悬浮离心后用植物外植体培养基稀释成侵染液时加入 加在农杆菌和外植体共培养的培养基中，一般农杆菌附着16h后才能进行转 化 在农杆菌液体培养基及共培养基中都加入AS
烟草转基因步骤
植物材料：Nicotiana benthamiana
菌种：GV3101
载体：Cam35S-gfp
第一天：
准备菌液，Culture a single colony in liquid LB + 50 mg/L Kanamycin + 60 mg/L Gentamicin
第三天：
转化
准备植物材料
1.无菌烟草材料，生长4-5周，完全展开叶片；
2.切成0.6cm到0.8cm见方叶盘；
3.用重悬液RM重悬离心收集的农杆菌菌体（2500 g，5 min），重悬至OD600=0.5~0.8；
4.将叶盘转入农杆菌重悬液中，28℃侵染30 min；
5.倒掉农杆菌菌液，将叶盘转到固体RM培养基上，覆盖无菌滤纸。
共培养：
在黑暗中25℃培养3天。
洗涤：
共培养后，将叶盘转到一个50ml圆底离心管中，用含有1000 mg/L特美丁RM溶液洗涤3 min，用RM溶液洗两次，每次3分钟。
筛选和分化培养：
1.用滤纸将叶盘表面吸干；
2.将叶盘放置到筛选RM培养基，10个叶盘一个皿；
3.黑暗中培养2周，转移至光下培养；
4.每3周继代一次。
生根
1.将分化愈伤转移至生根培养基；
2.成苗。
RM培养基：（固体加8 g/L Agar）
MS盐
B5 Vitamins
30 g/L 蔗糖
BA 2.0 mg/L
NAA 0.2 mg/L
PH 5.6
筛选培养基：
除上述成分外，加特美丁终浓度300 mg/L，潮霉素50 mg/L。
烟草 BY -2细胞培养集应用实验报告
烟草BY -2细胞培养集应用实验报告烟草BY -2细胞培养集应用实验报告：实验步骤1. BY-2 细胞培养烟草BY -2 细胞悬浮培养在摇床上，避光，温度260 C，转速130r pm，每7天将 1m l 细胞转入20m l新鲜的液体培养基中继续培养。
BY -2 愈伤组织生长在固体培养基上，每3-4周继代一次。
转基因的悬浮细胞和愈伤组织生长在含相应抗生素的培养基中。
2. 用干转化的农杆菌GV3101的准备(1)接种农杆菌单菌落到2 ml新鲜的YEB液体培养基中，28“培养过;(2)取200ul培养物加到l0ml新的培养基中继续培养3-4小时:(3) '5000 rpm,离心5 min集菌，用BY-2液体培养基重悬菌体，OD 为0.5左右，待用。
3. 农杆蔺介导的烟草BY-2悬浮细胞的外源基因转化(1)取生长到第3或4天的BY-2细胞4 ml，加入上述备用的农杆菌液100ul，共培养 3天;(2) 500 g离心2 min，收获细胞并用BY-2液体培养基(Amp 500 mg/L)洗3次 :(3)将细胞稀释后铺于BY-2固体培养基的平板(Kan 100 mg/L, Amp 500mg /L )上，26℃黑暗培养。
(4)四周后，取出生长良好的愈伤小块，打散后放入液体培养基悬浮培养。
4. 农杆菌介导的烟草BY-2愈伤组织的外源基因转化(1)取培养2-3周的烟草愈伤组织小块浸入农杆菌液中20 min，取出用无菌滤纸吸干，置BY-2 培养基平板(无抗生素)上培养2天;(2)取出愈伤小块，用无菌水洗4次，然后用含抗生素(Amp 500 mg/L)的无菌水浸泡30-60m in;(3)取出愈伤小块，用无菌滤纸吸干，置于培养BY-2的平板(Amp500mg/L，Kan100mg/)上。
(4)培养四周后，挑出生长的愈伤小块，转移到新的抗性平板(Kan 100 mg/L)上继续生长;(5)取出生长良好的愈伤小块，打散后放入液体培养基中，26'C, 130 rpm,在摇床上黑暗培养;(6)每7天继代一次。
实验十八(1)农杆菌感染烟草叶片与共培养
4、 W5稀释液：125mmol/L CaCl2，155mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，5mmol/L葡萄糖，pH5.6。 各组（4人）50ml 5、其他需要高压灭菌的用具同本实验。
其他需要高压灭菌的用具：
过滤器（2），注射筒（1），不锈钢网筛 （=54m）（1），漏斗（1），三角瓶（5）， 滴管（10支），10ml刻度离心管（2支）。
四、步骤
1、农杆菌培养
（1）取新鲜菌落（液）于2ml YEB培养 基（含50mg/L Rif、30mg/L Str 和50mg/L Kan） 中，28 ℃下，180rpm震荡培养过夜。
（2）将2ml菌液转入20ml培养基（含50mg/L Rif、30mg/L Str 和50mg/L Kan）中，培养5~6 小时左右。
（3）菌液达到OD600＝0.2～0.5时用于转化。
2、感染
（1）取烟草幼叶，表面消毒（方法同上次实 验），剪切成0.5~1.0cm-2大小。 （2）将叶片放入菌液中，在80r/min摇床上旋 转浸染5～10分钟。
3、共培养
（1）将叶片置于无菌滤纸上吸去多余的菌液。
（2）接种在MS培养基上（0.02mg／L NAA＋ 0.2mg／L BA），在25~28℃黑暗条件下共培 养2~3天。每组接种20瓶。
（2）每3天更换一次培养基。培养条件同前。
下次实验准备（均高压灭菌）
1、CPW培养基+0.4mol/L甘露醇，pH 5.4，各组 （4人）60ml，分装成10ml、10ml和20ml、20ml。 2、20％PEG600，0.06mol/L CaCl2，0.3mol/L甘 露醇。各组（4人）20ml 3、1mol/L 甘氨酸-NaOH，pH10.0 。各组（4人） 10ml。
[烟草亚细胞定位]农杆菌瞬时侵染烟草-激光扫描共聚焦法
![[烟草亚细胞定位]农杆菌瞬时侵染烟草-激光扫描共聚焦法](https://img.taocdn.com/s3/m/e8c47eb56f1aff00bfd51e41.png)
[植物科学领域]利用农杆菌侵染烟草进行体内瞬时表达的方法Method for transient expression in vivo by infecting tobacco with Agrobacterium一、原理（Principle）烟草叶片的瞬时表达系统常用来进行基因的亚细胞定位监测，监测蛋白在细胞中分布的位置，从而对其功能进行预测。
通过基因翻译的蛋白与绿色荧光蛋白构成融合蛋白，在激光共聚焦仪器下观测绿色荧光的分布，判断蛋白表达的部位。
同时，还可根据荧光的光强度检测蛋白的表达量。
该过程是经根癌农杆菌介导的，进而将目的基因整合到到烟草的细胞内的。
Tobacco leaf transient expression systems are often used to monitor the subcellular localization of genes, monitor the distribution of proteins in cells, and predict their function. The gene translated protein and green fluorescent protein constitute a fusion protein. The distribution of green fluorescence is observed under a laser confocal instrument to determine the protein expression site. At the same time, the expression level of the protein can also be detected based on the light intensity of the fluorescence. This process is mediated by Agrobacterium tumefaciens, which integrates the gene of interest into tobacco cells.二、材料与试剂1. 携带表达载体的农杆菌菌株（通常表达载体由35S启动子驱动）2. 2-4周的烟草植株3. LB培养基4. 乙酰丁香酮5. MES: 2-(N-吗啉代)乙磺酸6. 抗生素7. 注射器Materials and reagents1. Agrobacterium strain carrying an expression vector (usually the expression vector is driven by the 35S promoter)2. Tobacco plants for 2-4 weeks3.LB medium4.Acetosyringone5.MES: 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid6.Antibiotics7. syringe三、仪器1. 50 ml 离心管2. 光谱仪3. 紫外灯4. 荧光显微镜Third, the instrument1. 50 ml centrifuge tube2. spectrometer3. UV lamp4. fluorescence microscope四、步骤1. 挑取单克隆于5 ml LB液体培养中，28~30°C震荡培养。
农杆菌侵染烟草原理
农杆菌侵染烟草原理农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种特殊的细菌，它能够侵染许多植物，将其基因组改变为自己的目的基因组，导致植物产生肿瘤和其他异常表型。
这种现象被称为植物农杆菌病（Agrobacterium tumefaciens），这种病在园艺学中非常重要，因为它是研究植物基因工程的基石之一。
在农杆菌侵染烟草的过程中，第一步是农杆菌识别和攀附植物细胞。
这是由于农杆菌的一个称为T介导的转移蛋白，该蛋白帮助农杆菌在植物细胞表面形成一个特殊的结构，称为T长度发生器（T-pilus）。
这个结构能够锚定农杆菌在植物表面并促进接触和进一步的识别。
接下来，农杆菌产生特殊的类EB（virulence）素，它是一种特殊的分子信使，这种信使能够刺激植物细胞对农杆菌的进一步感知。
类EB素结合到细胞表面的接收器上，这是植物生长激素的一个重要接受者。
一旦类EB素与植物细胞膜上的接受器结合，它会导致激活一系列的蛋白酶和磷酸酶，这些蛋白酶和磷酸酶控制细胞基因表达和突变。
类EB素还有能力诱导细胞分裂和增殖，这是导致肿瘤形成的关键步骤。
农杆菌还会在细胞表面释放和合成许多其它信使，例如放屈酸等酚酸类化合物。
当植物细胞对类EB素信号的响应被激活后，农杆菌便通过它的第二种转移蛋白，称为T-DNA转移蛋白，将它的DNA片段传入植物细胞中。
T-DNA片段是农杆菌基因组中的一个片段，包含一些促进肿瘤形成或生物合成其它类型激素的基因，也可以包含一些抗生素或草甘膦抗性基因。
这个T-DNA片段被农杆菌员工特殊的切割酶切割成几个区域，第一个区域包含向植物细胞转座所需要的转座酶和反转座酶基因，另外一个区域包含转录的启动子，可以在细胞中启动其它T-DNA区域的基因表达，一个区域包含蛋白合成序列，以及一个主要的T-DNA区域，它编码产生激素，激发植物细胞分裂和生长，产生肿瘤。
同时，农杆菌会生成一个称为细胞外多聚糖（EPS）的多糖复合物，它可以隐藏T-DNA 分子并保护它不被宿主植物细胞发现和破坏。
农杆菌介导的烟草转化
农杆菌介导的烟草转化农杆菌介导的烟草转基因技术一、实验目的了解转基因的基本原理及操作方法。
二、基本原理根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农杆菌中含有诱导植物产生肿瘤的质粒（Tumor inducing plasmid），简称为Ti质粒。
野生型农杆菌的Ti 质粒，含有两个与致瘤有关的区域：一个是T-DNA区（transferred DNA region），含致瘤基因；另一个是毒性区（Virulence region），在T-DNA的切割、转移与整合过程中起作用。
农杆菌可将T-DNA插入到植物基因组中，并且可以通过减数分裂稳定地遗传给后代。
我们将目的基因插入到经过改在的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。
三、材料1、植物材料：烟草无菌苗2、农杆菌与载体：EHA105；PBI121四、方法步骤1、试剂的配制（1）LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂8g/L。
（2）液体MS/MT培养基PH：5.8-6.0 （3）烟草共培养培养基：固体MS培养基（4）烟草筛选培养基：MS +（2.0mg/L）6-BA + （0.3mg/L）NAA + （30g/L）蔗糖+ （400mg/L）头孢霉素+ （50mg/L）卡那霉素+ （7.5g/L）琼脂PH：5.8-6.0（5）烟草生根培养基：固体MS培养基2、农杆菌侵染菌液的制备方法：（1）超净工作台紫外灯灭菌15min，接种环酒精灯灼烧灭菌备用（2）铺皿：LB（50mg/L卡那霉素+25mg/L利福平）（3）划线：用接种环沾取预转化的农杆菌菌液于铺好的培养基划“之”字或者“#”字（4）封皿，做标记（5）28℃恒温培养1d-2d（6）用无菌刀刮取适量菌体于50mL液体MS培养基中，28℃，180r/min震荡培养1-2h至均匀悬浮液，紫外分光光度计测量菌液的OD600值，用液体MS调整浓度至OD600值约为0.8-1.0为宜，备用。
农杆菌转染烟草(陈泠)
4.1. 农杆菌转化烟草所需培养基和试剂（1）YEB液体培养基：蛋白胨5.0 g/L，酵母提取物1.0 g/L，蔗糖 5.0 g/L，MgSO4 0.5g/L，调pH至7.2~7.5，高压灭菌。
（固体培养基每升加15g琼脂，）（2）链霉素（Str）、卡那霉素（Km）：贮存液浓度为50 mg/mL，溶于双蒸水中，0.22 μm滤膜过滤后分装，–20℃保存。
（3）羧苄青霉素（Cb）和头孢霉素（Cef）：贮存液浓度为500 mg/mL，溶于双蒸水中，0.22 μm滤膜过滤，–20℃保存。
（4）6-氨基嘌呤（6-BA）和ａ-萘乙酸（NAA）：各取20mg，先用少量1 mol/L NaOH溶解，再加蒸馏水至1 mL，最好现用现配。
（5）烟草转化所用的培养基共培养培养基：MS+ 6-BA 2 mg/L+ NAA 0.2 mg/L分化培养基：MS+ 6-BA 2 mg/L+ NAA 0.2 mg/L+ Cb 500mg/L+Kan 100 mg/L 生根培养基：1/2MS + Kan 100 mg/L+ Cef 250mg/L（1/2MS是指MS大量元素减半）4.3.1 农杆菌LBA4404感受态的制备（1）取100 μL农杆菌LBA4404，接种于5 mL LB液体培养基（含50 mg/L Str）中，28℃、200 rpm暗培养过夜；（2）取2 mL培养的菌液于50 mL YEB液体培养基（含50 mg/L Str）中继续培养，直至OD600值为0.4左右；（3）将培养好的菌液在冰块中冰浴30 min，然后4℃，5,000 rpm离心5 min，弃去上清液；（4）加入10 mL预冷的20 mmol/L CaCl2悬浮菌体，尽量打散菌体，使菌体充分悬浮，有助于制备较高效率的感受态；（5）4℃，5,000 rpm离心5 min，弃去上清液，尽量去净液体；（6）用1 mL预冷的20 mmol/L CaCl2悬浮菌体，分装成100 μL/管，在液氮中冷冻后放于–70℃保存。
injection of N.benthamiana
烟草注射实验材料：N.benthamiana烟草（8-10叶期，壮实的最好）EHA105农杆菌（分别含相应质粒Q2-X，Q4-Y，P19）抗生素（Kana，Rif）AS （乙酰丁香酮，用DMSO配成100mM母液）MES （1M，用NaOH调至pH5.6，过滤除菌）MgCl2（1M）LB培养基2mL注射器实验步骤：1、挑取农杆菌于3-5mL LB培养基（+ 50mg/L Kana + 50mg/L Rif），250rpm，28℃振荡培养过夜(16h)。
OD600=1-22、以1;500—1:1000转接至新鲜LB培养基（+10mM MES + 20uM AS + 50mg/L Kana+ 50mg/L Rif ），250rpm，28℃振荡培养过夜(16h)。
OD600=13、4000 rpm 离心10 min，去上清4、用infiltration buffer (10mM MES，150uM AS，10mM MgCl2)重悬菌体（可先用菌液一半体积的infiltration buffer重悬）。
5、测量重悬液OD600的数值。
6、用infiltration buffer调整Q2-X与Q4-Y重悬液至OD600=1.5，P19重悬液至OD600=1。
7、等体积混合各菌液（也可先分开静置，注射前再混合），在室温静置重悬液3小时以上（但不要太长时间，建议不要超过6小时）。
8、烟草准备：在注射前一天可以把烟草从培养室拿出来，放在楼上实验室，因为在培养室的烟草叶片含水量高，菌液很难渗透注射进去。
所选择注射的叶片要完全伸展，靠近顶端的叶片最好，太嫩不好注射，太老活力不强。
9、在叶片背面用针头扎一个小孔，用去了针头的注射器对准小口，另一只手用手指隔着叶片轻轻堵住针筒和小孔（力度需要自己体会，太重了菌液推不出来，太轻了菌液推不进去，经验是用食指侧面比较好用），推动活塞，把菌液注射进叶片，直至水渍满了整个叶片（如果叶片较大，扎2-4个小孔）。
细胞工程实验-烟草叶片的组织培养.
细胞工程学实验报告专业：_ 09级生物技术一班__ 姓名：___ __ 学号：____ _ _实验一实验室的设计及基本设备一、实验室的设计1、实验室设计的原因：植物细胞工程实验室的流程是：清洗玻璃器皿、配制培养基、高压气灭菌、无菌操作、培养室培养植物、植物材料的检测。
因此实验室需要有清洁器皿和配制培养基的准备室，无菌操作室或超净工作台，供培养材料用的培养室，检查培养情况并做记录的实验室。
一般在设计上，每个组分最好按工作的自然程序连续排列，如：准备室、灭菌室、无菌操作室、植物材料培养室、检测室。
实验室的安排应合理简洁，并要求无尘、灭菌、光洁、清净。
2、实验室的布局要求：（1）准备室准备室可以是一大间或几小间，主要用于进行一切与实验有关的准备工作：完成所使用的各种药品的贮备、称量、溶解、器脿醮涤、培养基配制与分装、培养基和培养器皿的灭菌、培养材料的预处理等。
必要的设备有:准备室应具备实验台、药品柜、水池、仪器、药品、防尘橱（放置培养容器）、冰箱、天平、蒸馏水器、酸度计及常用的培养基配制用玻璃仪器等。
洗涤灭菌区功能：完成各种器具的洗涤、干燥、保存、培养基的灭菌等。
要求：洗涤灭菌室根据工作量的大小决定其大小，一般面积控制在30-50m2。
在实验室的一侧设置专用的洗涤水槽，用来清洗玻璃器皿。
中央实验台还应配置2个水槽，用于清洗小型玻璃器皿。
如果工作量大，可以购置一台洗瓶机。
准备1-2个洗液缸，专门用于洗涤对洁净度要求很高的玻璃器皿，地面应耐湿并排水良好。
设备：水池、落水架、中央实验台、高压灭菌锅、超声波清洗器、干燥灭菌器（如烘箱）等。
（2）无菌室（接种室）进行植物细胞、组织培养操作的关键是无菌条件。
室内的墙壁要求光滑平整；地面为光洁的水磨石，平坦无缝，避免灰尘积累，便于清扫。
紫外灯一般在3到4平方米内安装1到2只；在工作台下安置紫外灯紫外灯可使灭菌彻底。
同时，工作台上方安装平板玻璃，以防操作时落灰。
条件不好时，用无菌箱代替无菌室，箱内用紫外灯灭菌。
分子与基因工程实验
植物基因转化受体系统
指用于转化的外植体通过组织培养途径或其他非组织培养途径，能高效、稳定地再 生无性系，并能接受外源DNA整合，对转化选择抗生素敏感的再生系统。
具备条件：
1. 高效稳定的再生能力 2. 较高的遗传稳定性 3. 具有稳定的外植体来源 4. 对选择性抗生素敏感 5. 对农杆菌侵染有敏感性
农杆菌与外植体共培养
01
接种菌体后的外植体 02
是整个转化过程中培养基上，在
农杆菌吸附，T-DNA
外植体细胞分裂、生
的转移及整合都在这
长的同时，农杆菌在
共培养时期内完成。
外植体切口面也增殖
生长，该两者共同培
养过程称之为共培养。
Conceptions
Events An 'event' is the insertion of a particular transgene into a specific location on a chromosome.
Transformation frequency
Independent transgenic plants/inoculated immature embryo or callus.
Line
The seedlings from one transgenic cell, namely, one independent successfully transformation event, belong to one line, also are called clones.
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农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验步骤
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农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验步骤
整理人：早熟组赵凤利
一、准备试剂：
1.加有三抗的YEB或LB液体培养基，用于摇菌；
2.渗透液(50ml)：250mg D-glucose，5ml MES 原液，5ml Na3PO4·12H2O 原液，5ul 1M 乙酰丁香酮原液，加dH2O至50ml。
1). 500 mM MES (Sigma)： g溶于50ml dH2O，保存于4℃
2). 20 mM Na3PO4·12H2O (BDH)： g 溶于50ml dH2O，保存于4℃
3). 1M 乙酰丁香酮： g，加DMSO至1 ml，可分装成小剂量，存于 -20℃。
二、实验步骤：
1.将检测成功的农杆菌菌液过夜扩摇，28℃,200rpm；
2.取 ml 菌液，加到灭菌的离心管中；
3.1000 g，10 min，沉淀菌体(室温)，去上清，加1 ml 渗透液，悬浮菌体；
4.重复步骤3，进一步除去少量的抗生素；
5.取少量悬浮菌液稀释10倍，测定OD600值，并乘以10，作为悬浮菌液的
OD600值；
注：如果悬浮菌液的OD600值在之间，说明有大量的死菌细胞，将降低转化的效率。
6.确定悬浮菌液对渗透液的滴定度，计算稀释系数，使最终悬浮菌液(用于侵染)为 ml，OD600为，通常 ml的最终悬浮菌液就能满足侵染了；
如：需要OD600=的500 ul最终悬浮菌液，而测定的悬浮菌液的OD600=，则最终悬浮菌液中，悬浮菌液的用量为*500)/=125 ul，则需要渗透液为375 ul。
7.在离心管中，配好最终悬浮菌液，准备侵染；
8.侵染前，将烟草放于白色荧光灯下1 h，使其气孔打开；
9.选择倒三叶和倒四叶，用于侵染(于两叶脉之间侵染)，一株选两叶，侵染一种菌液；
10.用去掉针头的注射器，轻柔地摩擦待转叶片的背部 cm2)，或用小针头刺穿，以去除其蜡质层；
11.侵染前，用记号笔标记待转区域；
12.将第7步中的最终悬浮菌液吸入1ml去针头的注射器中
13.将注射器对着叶片背面的待转区域，一手按着叶片上面，另一手轻轻推动活塞，直到看到液体扩散，再侵染其他部位，侵染后，用记号笔圈定侵染区域；
14.将侵染后的烟草放回培养室
15.2-3天后：
1). 亚细胞定位实验：切掉侵染区域，制片，荧光显微镜观察；
2). 启动子GUS活性：GUS染色，75%酒精脱色，观察结果。
参考文献：Nature Protocols, 2006: 2019-2025.。