基因组原位杂交中封阻DNA制备方法研究_顾爱侠

第33卷第5期2010年9月河北农业大学学报J OU RNAL OF AGRICU LTU RAL UNIVERSITY OF H EBEIVol.33No.5Sep.2010文章编号:1000-1573(2010)05-0077-03基因组原位杂交中封阻DNA制备方法研究顾爱侠1, 李雪姣1, 冯大领2, 王彦华1, 陈雪平1, 申书兴1(1.河北农业大学园艺学院,河北保定071001;2.河北农业大学生命科学学院,河北保定071001)摘要:在基因组原位杂交中,适当的封阻可以大大提高基因组原位杂交的效率。

本研究采用煮沸法、超声波剪切法对大白菜基因组DN A进行剪切,研究了大白菜封阻DN A的制备方法。

结果表明:珠沸法效率高,操作简单,当煮沸70min DN A片段大小主要集中在200~500bp,适于在基因组原位杂交中作为封阻。

研究结果为基因组原位杂交的应用奠定了基础。

关 键 词:煮沸法;超声波剪切法;封阻;基因组原位杂交中图分类号:S634.1文献标志码:APreparation of blocking DNA in genomic in situ hybridizationGU A-i xia,LI Xu e-jiao,FE NG Da-lin g,WANG Yan-hu a,CHE N Xu e-ping,SH EN Shu-xing(1.Colleg e of H or ticulture,Ag r icultural U niversit y of H ebei,Baoding071001,China;2.Colleg e of L ife Sciences,A g ricult ur al U niv ersity of H ebei,Bao ding071001,China)Abstract:Geno mic in situ hybridization(GISH)may be improv ed if suitable blocking DNA is used.Chinese cabbage g enomic DNA w as cut by boiling and ultrasonic method to study the pr eparation o f blocking DNA.T he r esults sho w ed that the efficiency of boiling method w as hig her than ultrasonic cutting metho d,and boiling metho d w as mor e easily operated.M ost DNA leng th w as200-500bp w hen g enom ic DNA w as boiled for70min,thus DNA w as suit-able for blocking DNA in GISH.T hese findings laid a foundation for further study on GISH.Key words:boiling m ethod;ultraso nic cutting metho d;blocking DNA;GISH基因组原位杂交技术(Genom ic in situ hybrid-ization,GISH)是原位杂交技术进一步的发展,其基本原理是采用取自多倍体品种或杂种的一个亲本的总基因组DNA经标记后作为探针,并在杂种的2个亲缘关系较近时,用过量的来自其他亲本的未经标记的总基因组DNA作封阻,区分来源于不同染色体组的染色体或染色体片段[1-2]。

该项技术广泛应用于植物异源染色质的鉴定及物种起源演化中[3-5]。

1989年Le等[6]报道了利用黑麦总基因组DNA为探针鉴别了一个小麦品种中的黑麦染色体及染色体片段,但是该方法不能应用于两者亲缘关系比小麦与黑麦更近的物种之间的鉴定。

后来M ukai和Gill对该技术进行改良,通过加入未标记的封阻DNA,在小麦背景下检测到大麦染色体[7],提高了GISH的鉴别能力。

可见,加入封阻DNA 对于亲缘关系较近物种的鉴别是必须的,GISH中无论是探针还是封阻都必须通过染色体的立体结构来完成杂交,所以其长度必须有利于在染色体的立体结构中穿梭,前人研究表明DNA长度在200~ 500bp最有利于杂交,有效的封阻非特异性位收稿日期:2010-02-22基金项目:国家自然科学基金(30871713);河北省科学技术研究与发展计划项目(09225511);河北省自然科学基金(C2006000416).作者简介:顾爱侠(1980-),女,河北省卢龙人,主要研究方向:蔬菜遗传育种.通讯作者:申书兴(1964-),男,河北省唐山人,教授,博士生导师,主要从事蔬菜遗传育种方面的研究.河北农业大学学报第33卷点[8-9]。

由于芸薹属A基因组与C基因组间具有较强的同源性,在二者杂交种、异附加加系等材料开展GISH研究中,无论哪个种基因组作探针都必须使用另一基因组DNA作封阻才能区分二者染色体[10],如果不加入相应的封阻DNA则二者所有染色体上都有较强的杂交信号,不能区分[11]。

可见合适封阻DNA 的使用是开展A、C基因组GISH的必要前提条件。

目前常用的DNA剪切法有超声波剪切法、煮沸法、高压剪切法、微量注射器反复抽提法等。

高压剪切法虽简便易行,但由于升温和降压时的时间不易控制,导致不能很好的把握每次的实际反应时间;微量注射器反复抽提法虽不要求仪器,但每次的力度不能准确控制,会导致实验的重复性差。

本试验以大白菜(Brassica campestris syn rapa ssp.Pekin-ensis,AA)为试材,利用超声波剪切法和煮沸法打断基因组DNA,对2种方法的效率和最佳处理时间进行比较研究,为开展GISH奠定必要基础。

1 材料与方法1.1 材料大白菜嫩叶。

1.2 方法1.2.1 大白菜DNA提取 采用CT AB法,具体操作步骤如下:取1g大白菜幼嫩叶片,在液氮冷冻下迅速将叶片研磨成粉末,然后转入离心管中,加入6mL预热的提取缓冲液,混匀,65 水浴1h。

提取液组分:1.1mol/L NaCl,83m mo l/L T ris-H Cl pH8 0, 16mmo l/L EDT A pH8 0,2%CTAB,40m mol/L -巯基乙醇(临用前加)。

冷却至室温后加入等体积的24 1氯仿/异戊醇,混匀。

10000r/min,20 离心10min。

用剪尖枪头将上清液转移至新的离心管中,加入等体积预冷的异丙醇,缓慢混匀。

-20 静置1h。

10000r/min,4 离心5m in。

弃上清液, 70%乙醇洗2次。

空气干燥沉淀,溶于适量TE缓冲液,加入终浓度为50~60 g/m L RNase,37 水浴30~60 min。

加入1/10体积3mol/L醋酸钠(pH5 2), 2倍体积预冷乙醇,混匀,-20 静置20m in。

12000r/m in,离心5r/m in。

弃上清,70%乙醇洗2次,空气干燥沉淀,溶于适量TE缓冲液。

用0 8%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量,用 DNA作标准分子质量对照,在紫外透射仪上观察、拍照。

1.2.2 超声波法剪切基因组DN A 取适量DNA 试样于封闭好的离心管中置于超声波清洗仪内,强度为100%,时间分别为30、60、120、180、240、300 m in,各取出8 L置于冰上10min左右。

用2%的琼脂糖凝胶电泳检测片段大小,DL2000作标准分子质量对照。

1.2.3 煮沸法剪切基因组DNA 根据DNA的热不稳定性,对它们进行煮沸剪切,取适量DNA于封闭好的离心管中,煮沸15、25、40、50、60、70、90、120、140m in时取出8 L,置于冰上10min左右。

2%的琼脂糖凝胶电泳检测片段大小,DL2000作标准分子质量对照。

2 结果与分析2.1 DNA提取效果CTAB法提取的大白菜基因组DNA经0 8%琼脂糖凝胶电泳检测质量(见图1),结果显示点样孔干净,DNA无降解,无RN A,表明所提取的基因组DN A质量较高。

1~7:大白菜基因组DNA;M: DNA M arker。

图1 大白菜基因组DNA琼脂糖电泳检测结果Fig.1 Electrophoretic products of genomicDNA of C hinese cabbage2.2 基因组DNA剪切效果超声波剪切和煮沸法剪切DNA电泳结果如图2所示。

2.2.1 超声波剪切法制备封阻DN A 超声波清洗仪剪切效果较弱,超声波处理60min时的DNA样品几乎未被剪断;超声波处理180min时DNA才开始被大量剪断;超声波处理300min DNA片段还仍主要集中于1000~2000bp,与预期200~500bp 相差甚远,说明该法的效率低,不适用于将基因组DNA剪切至200~500bp这样小的片段。

2.2.2 煮沸法制备封阻DNA 煮沸15min时的DNA样品,电泳检测出的DNA条带已呈明显的弥散,表明此时DNA已被剪断,其片段大小集中在700bp以上;煮沸25min时的DNA样品,电泳检78第5期 顾爱侠等:基因组原位杂交中封阻DNA 制备方法研究测结果表明,DNA 片段大小主要集中于500~2000bp;煮沸40min 时的DNA 片段大小主要集中于400~1000bp;煮沸50min 时的DNA 片段大小主要集中于400~750bp;煮沸70min 时的DNA 片段大小主要集中于200~500bp,此时已达到原位杂交时作为封阻和探针标记片段大小的要求;煮沸90min 时的DNA 样品已无明显主亮带,弥散条带的亮度弱,说明此时多数DNA 片段已小于250bp;煮沸140m in 、120min 时的DNA 样品在该琼脂糖电泳已不能被检测出任何条带,说明此时DNA 片段长度已小于100bp 。

可见煮沸法对于打断DNA 有较高的效率,对于大白菜基因组,当煮沸70m in 时所得DNA适宜在基因组原位杂交用做封阻。

1.超声波处理300min DNA;2.超声波处理240min DNA;3.超声波处理180min DNA;4.超声波处理120min DNA;5.超声波处理60m in DNA;6.超声波处理30min DNA;7.煮沸140min DNA;8.煮沸120min DNA;9.煮沸90min DNA;11.煮沸70min DNA;12.煮沸60min DNA;13.煮沸50min DNA;14.煮沸40min DNA;15.煮沸25min DNA;16.煮沸15min DNA;M.DL2000M ark er图2 煮沸法和超声波清洗仪剪切法切割大白菜基因组DNA 琼脂糖电泳检测结果Fig.2 Electrophoretic products of cut genomic DNA ofC hinese cabagge by boiling and ultrasolic3 讨论封阻DNA 是指非检测染色体DNA,其作用是除去探针、染色体中的相同序列,使其不能和非检测染色体杂交。