测定核酸含量的几种方法
核酸定量方法及原理
核酸定量方法及原理广泛用于测定制备物中核酸含量的方法有两类。
如果样品较纯（即蛋白质、酚、琼脂糖以及其他核酸等杂质含量较低时），可通过分光光度法测定其吸收紫外线的量，既简便又准确。
若样品中DNA或RNA含量较低或含有较多杂质，则可以通过溴化乙锭或Hoechst 33258等荧光染料所发出的荧光估测核酸的含量。
DNA或RNA的分光光度法测定核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。
可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。
核酸的最高吸收峰的吸收波长 260 nm。
每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。
定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。
如：1OD 的吸光值分别相当于50μg / mL的dsDNA，37μg / mL的ssDNA， 40μg/mL的RNA，30μg/ mL的寡核苷酸。
测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。
测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，而后测试空白液和样品液。
然而，实验并非一帆风顺。
读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。
灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。
事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，对应吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。
另外，还需考虑核酸本身理化性质和溶解核酸缓冲液的pH 值、离子浓度等。
在测试时，离子浓度太高也会导致读数漂移，因此建议使用pH 值一定、离子浓度较低的缓冲液（如TE）可大大稳定读数。
样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。
这些小颗粒的存在干扰测试效果。
为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A ，吸光值最好在0.1-1.5 A。
在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。
从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。
最后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。
核酸的定量分析方法
主要有紫外-可见光谱法、荧光光谱法、红外光谱法、拉曼光谱法等。
基于光谱学的定量分析方法的优缺点
优点
操作简单，适用范围广，无需使用放射性同位素标记，可用于多种类型核酸的定量。
缺点
易受样品中杂质的影响，准确性较低，重现性较差。
光谱学定量分析的实例和应用领域
实例
紫外-可见光谱法定量分析DNA和RNA样品中的浓度和纯度。
VS
应用领域
基因组学、蛋白质组学、生物医药、环境 科学、法医学和化学计量学等领域。
05
基于生物芯片的定量分析方 法
生物芯片的原理及定量分析方法
生物芯片原理
生物芯片是一种高通量的生物分析技术，通过将生物分子固定在固相基质上 形成微阵列，然后利用特异性探针进行检测和定量分析。
定量分析方法
通常采用荧光标记或化学发光标记的核酸探针与生物芯片上的核酸序列进行 杂交，然后通过荧光信号或化学发光信号的强度来检测和定量分析目标核酸 序列的浓度。
VS
同位素标记法
通过在标准品和未知品中加入不同量的同 位素标记物，利用凝胶电泳将核酸分子分 离，再通过同位素检测器检测标准品和未 知品中同位素标记物的含量，从而计算未 知核酸浓度。该方法操作简便，但同位素 标记物具有放射性，对环境和人体健康可 能产生影响。
凝胶电泳定量分析的优缺点
优点
凝胶电泳具有高分辨率、可重复性好、操作简便、成本低廉 等优点，是核酸分子定量分析的常用方法之一。
缺点
需要使用较多的试剂和操作步骤，可能会受到非特异性杂交和酶抑制物的影响， 同时也存在一定的误差率。
循环酶放大技术定量分析的实例和应用领域
实例
采用循环酶放大技术对细菌、病毒、基因组、mRNA等多种 类型的核酸进行了定量分析，取得了较好的结果。
核酸含量测定
定磷试剂：含硫酸、钼酸铵、Vit.C，浅黄色，如果变绿则不能使用,每组用100mL烧杯取70mL
04
标准磷溶液：含磷量为10 μg/mL，每组用干试管取15用硫酸消化，将有机磷转化成无机磷；
02
制定定磷标准曲线；
03
测定回收率和样品总磷量。
实验步骤
1. 样品消化（每两组或三组做一份）
回收率的意义；
实验所用的水质、试剂质量、定磷试剂的酸度对测定结果的影响。
01
02
思考题
将试管洗净，斜插在试管架上，放在台面上。
将消化管和橡皮塞洗净，放回原处。
将比色杯洗净，放在实验台上的小平皿中。
将实验台面擦干净。
实验结束
消化管
1
2
3
RNA/mL
0
1
0
标准磷原液/mL
0
0
1
dH2O/mL
1
0
0
5mol/L H2SO4/mL
2
2
2
消煮炉中消化2—6h至溶液无色透明，冷却
dH2O/mL
1
1
1
沸水浴中加热10min（分解焦磷酸），冷却
用dH2O定容/mL
50
50
50
混匀
2. 定磷标准曲线的制定（每人做一份） 每人取18支试管，按照下表平行操作：
以每管含磷量(μg)为横坐标，吸光值为纵坐标画标准曲线，直线应过原点。
在标准曲线上查出样品(x)和标准磷(y)的含磷量(μg)。
数据处理
计算样品总磷量：
01
计算RNA量：
02
样品RNA含量：
03
计算回收率：
操作注意事项
1. 每人独立操作，不允许两人穿插取样； 2. 要求试剂及所有器皿清洁，不含磷； 3. 每管加样和测定均要求平行操作； 4. 消化溶液定容后务必上下颠倒混匀后再取样； 5. 各种试剂必须用移液管按顺序准确量取，移液管口用吸水纸擦净，溶液尽量加到试管下部，标准溶液要求用差量法。 6. 漩涡混合器的使用：用点动档，试管竖直或稍倾斜垂直向下用力。 7. 测定吸光值时，用一个比色杯装去离子水调节分光光度计零点，另一个比色杯按照从低浓度到高浓度的顺序测定，不用润洗，切忌甩比色杯，将蓝色溶液撒在仪器和地面上。
核酸定量方法及原理
核酸定量方法及原理广泛用于测定制备物中核酸含量的方法有两类。
如果样品较纯（即蛋白质、酚、琼脂糖以及其他核酸等杂质含量较低时），可通过分光光度法测定其吸收紫外线的量，既简便又准确。
若样品中DNA或RNA含量较低或含有较多杂质，则可以通过溴化乙锭或Hoechst 33258等荧光染料所发出的荧光估测核酸的含量。
DNA或RNA的分光光度法测定核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。
可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。
核酸的最高吸收峰的吸收波长 260 nm。
每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。
定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。
如：1OD 的吸光值分别相当于50μg / mL的dsDNA，37μg / mL的ssDNA， 40μg/mL的RNA，30μg/ mL的寡核苷酸。
测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。
测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，而后测试空白液和样品液。
然而，实验并非一帆风顺。
读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。
灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。
事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，对应吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。
另外，还需考虑核酸本身理化性质和溶解核酸缓冲液的pH 值、离子浓度等。
在测试时，离子浓度太高也会导致读数漂移，因此建议使用pH 值一定、离子浓度较低的缓冲液（如TE）可大大稳定读数。
样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。
这些小颗粒的存在干扰测试效果。
为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A ，吸光值最好在0.1-1.5 A。
在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。
从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。
最后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。
实验九紫外分光光度法测定核酸的含量
学会使用紫外分光光度计进行核酸含量测定
操作步骤
准备标准品、未知样品和空白对照；按照仪器操作说明调整波长、设置测量模 式；将标准品和未知样品分别放入样品池；记录吸光度值；根据标准品的标准 曲线计算未知样品的核酸含量。
02
核酸在260nm波长处有最大吸收 峰，这是核酸特有的吸收峰，可 用于核酸的定量分析。
核酸的紫外吸光度与浓度的关系
随着核酸浓度的增加，吸光度也相应 增加。
在一定浓度范围内，吸光度与核酸浓 度呈线性关系，可以用于定量分析。
核酸含量计算公式及注意事项
核酸含量计算公式：核酸浓度（μg/mL） = (A / V) / (1000 × L) × (100 / S)
其中，A为吸光度值，V为样品体积（mL），L 为光程（cm），S为核酸分子截面积 （cm²/μg）。
注意事项
实验过程中要保持光程一致，以减小 误差。
实验过程中要避免样品污染，以免影 响实验结果。
对于不同来源和性质的核酸样品，可能需要采 用不同的实验条件和标准曲线进行定量分析。
03
实验步骤
样品制备
实验结论
根据实验结果和分析，得出实验结论，总结实验的成功与不足之处， 并提出改进意见和建议。
05
实验总结
实验收获与体会
学会了使用分光光度计进行实验 操作。
认识到实验操作对结果准确性的 影响。
01
02
掌握了紫外分光光度法测定核酸 含量的原理和方法。
03
04
了解了核酸在紫外光下的吸收特 性。
核酸的定量分析方法
光
分
析
DNA
法
AO-ST体系能 量发生荧光猝 灭
DNA浓度与荧光 猝灭强度呈线性 关系
检出限 2.6× 10-7mol/L
线性范围为 0～ 1.1× 10-6mol/L
1.DNA促进AO-ST间的荧光能量转移
下图表明ST的电子吸收光谱与AO的荧光发射光谱重叠。AO的荧
光在ST存在时明显地被淬灭，说明两者在水溶液中存在能量的转
准确、分析适应性广等特点。
DNA电化学生物传感器：基本原理
电
电压
ssDNA
化
（单链DNA）
学 法
杂交反应
电流
待测溶液
（样品中与之互补 的另一条DNA）
电导
样品中DNA的结构 和含量的测定
差分脉冲和方波伏安法研究亲和素-生物素固载ssDNA的生物传感器
Pt电极预 处理（抛光）
ssDNA在铂 电极表面的 固定化
核酸(DNA或RNA)在中性至碱性介质中由于核苷酸上磷酸基的离 解而能以有机 离子形式存在，因此能用某些碱性染料对其加以 测定。
定
以后所测得的含磷量，以及该样品的无机磷含量，即样品未经消化
磷
法
直接测得的含磷量。将总磷量减去无机磷才是该有机磷物质的含磷
量。
定磷法简单、快速、灵敏度高，但是受蛋白质和核苷酸的影响。
核苷、核苷酸、核酸的组成成分中都有嘌呤、嘧啶碱基，这些碱基
紫
都具有共轭双键 （ -C-C=C-C=C-），在紫外光区的250-280nm处有强烈
紫 外
RNA的质量浓度(mg/L)＝ A260nm 稀释倍数
吸
0.024 L
收
DNA的质量浓度（mg / L) A260nm 稀释倍数
实验四、定磷法测定核酸含量(精)
实验步骤
1. 核酸样品用硫酸消化，将有机磷转 化成无机磷； 2. 制定定磷标准曲线；
3. 测定回收率和样品总磷量。
9
1. 样品消化（每两组或三组做一份）
吸取核酸样品液1ml于凯氏烧瓶中，另吸取蒸馏水 1ml做空白试验。各加入2 ml 5M硫酸。置于140160℃烘箱内消化2-4h，待溶液呈黄褐色后，取出 冷却，加入1-2滴30%过氧化氢，继续消化，到溶液 透明为止。取出冷却后加入1ml 蒸馏水，于沸水浴 中加热10min，以分解消化过程中形成的焦磷酸。 然后将消化液用蒸馏水转移至100ml容量瓶中定容 到刻度。
10
消化管 RNA/mL 标准磷原液/mL dH2O/mL
1 0 0 1
2 1 0 0
3 0 1 0
5mol/L H2SO4/mL
dH2O/mL 用dH2O定容/mL
2
1 50 混匀
2
1 50
2
1 50
消煮炉中消化2—6h至溶液无色透明，冷却
沸水浴中加热10min（分解焦磷酸），冷却
11
2. 定磷标准曲线的制定（每人做一份）
(4) 样品RNA含量：
样品RNA质量分数(%) RNA质量浓度( g / mL ) 100% 2000( g / mL )
15
操作注意事项
1. 每人独立操作，不允许两人穿插取样； 2. 要求试剂及所有器皿清洁，不含磷； 3. 每管加样和测定均要求平行操作； 4. 消化溶液定容后务必上下颠倒混匀后再取样； 5. 各种试剂必须用移液管按顺序准确量取，移液管口用吸水 纸擦净，溶液尽量加到试管下部，标准溶液要求用差量法。 6. 漩涡混合器的使用：用点动档，试管竖直或稍倾斜垂直向 下用力。 7. 测定吸光值时，用一个比色杯装去离子水调节分光光度计 零点，另一个比色杯按照从低浓度到高浓度的顺序测定， 不用润洗，切忌甩比色杯，将蓝色溶液撒在仪器和地面上。
核酸的定量分析方法
优
点
紫
紫外吸收法测定核酸含量简便快速，灵敏度高，一般可达
外
3ng/L的检测水平。蛋白质也有紫外吸收，通常蛋白质的吸收高
吸
峰在280nm波长处，在260nm处的吸收值仅为核酸的1/10或更低，
收
因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。
法
缺
点 若待测的核酸制品中混有大量的具有紫外吸收的杂质（显著蛋
ssDNA电极杂交 （含一定浓度目 的基因杂交液 SSC）
电
化
DNA传感器 （ssDNA通
学
过生物素-亲 和素的方法
法
固载在Pt电 极）
指示剂： Co(phen)33+
工作电极
DNA序列 检测系统
示差脉冲伏 安法(DPV)
电 流 变 化
方波 伏安法(AWV)
线性范围： 8.0×10-9～ 2.8× 10-8
光在ST存在时明显地被淬灭，说明两者在水溶液中存在能量的转
荧
移，在体系中AO作为荧光能量的给予体，而ST则是能量的接受体。
光
当有DNA存在时，AO-DNA体系的荧光强度被ST淬灭的程度大大 增加。
分
析
法
1.AO荧光发射光谱 2.ST 电子吸收光谱
DNA的存在前后，ST对AO荧光淬灭的变化主要是由于DNA分子对AO 分子、ST分子的极化作用引起。ST对AO-DNA荧光淬灭的效率大于AO荧 光淬灭效率，是由于DNA对AO与ST间的荧光能量转移过程促进的影响。
B：钼酸铵-过 氯酸沉淀剂
紫
RNA（或DNA）的质量浓度（mg/L)
A 260nm
稀释倍数
0.024(0.020) L
外
吸 收
核酸的提取及含量测定
沉淀(RNA),先用1mL0.
一、核酸提取 14mol/LNaCl的pH为4，使两者分开。
匀浆、超声震荡、酶解等，因动物组织含有核酸酶，在一定温度下，该酶可被Ca2+,Mg2+等激活，为避免核酸酶对核酸的水解，与核 酸提取液中加入适量螯合剂（如EDTA，柠檬酸等），除去这些离子，整个过程在低温下进行。
核蛋白 RNP DNP
0.14mol/LNaCl 1.0mol/LNaCl
溶解度大
溶解度小
溶解度小
溶解度大
（仅为水中1%） (比在水中大2倍)
• 此外，两种核蛋白溶解度与pH值有关
RNP：pH2.0-2.5时最低
DNP：pH4.2时溶解度最低
故调节溶液pH也可促使两者分离，将 0.14mol/LNaCl的pH为4，使两者分开。
2+
㈠新鲜测肝糖组法织用为冰生避理盐免水洗去核表面酸的血酶液，加对0. 核酸的水解，与核酸提取液中加入
适量螯合剂（如EDTA，柠檬酸等），除去这些离 14mol/LNaCl的pH为4，使两者分开。
14mol/LNaCl溶解提取核糖核蛋白。
子，整个过程在低温下进行。 上清液,倒入另一离心管中,记录体积
新鲜肝组织用冰生理盐水洗去表面的血液，加0.
㈠ 测糖法
5×匀浆总体积/4 × 1/肝重(g)
⒉ 提取核糖核蛋白(RNP)
在生物体内核酸多以核蛋白的形式存在于组织中， 根据核糖核蛋白(RNP)和脱氧核糖核蛋白(DNP)在 不同浓度电解质溶液中溶解度明显差别进行分离。 故用0.14mol/LNaCl溶解提取核糖核蛋白。
核酸的提取及含量测定
• 核酸是具有重要生物化学功能的生物大分子， 根据其分子所含糖的种类不同，核酸分为两 大类，含核糖的称为核糖核酸(RNA)，含脱 氧核糖核酸的称为脱氧核糖核酸(DNA)， DNA是遗传信息的携带者，与生物的生长、 繁殖、遗传和变异有密切关系，RNA参与蛋 白质的生物过程，由于核酸具有如此重要的 生物学功能，对核酸的结果与功能的研究已 成为当前生物科学的重要课题之一。
关于核酸的实验报告
一、实验目的1. 掌握核酸提取、纯化的基本原理和操作方法。
2. 了解紫外分光光度法测定核酸含量的原理和方法。
3. 学会使用核酸纯化试剂盒和分光光度计。
二、实验原理核酸是生物体内重要的生物大分子，包括DNA和RNA。
DNA主要存在于细胞核中，而RNA则主要存在于细胞质中。
核酸提取、纯化是研究核酸结构、功能的基础。
1. 核酸提取：利用细胞壁和细胞膜的破坏，将核酸从细胞内释放出来。
2. 核酸纯化：通过去除杂质，提高核酸的纯度。
3. 核酸定量测定：利用紫外分光光度法，根据核酸的吸光度与浓度的关系，计算核酸的浓度。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：大肠杆菌、Tris-HCl缓冲液、NaCl溶液、SDS溶液、酚/氯仿/异戊醇混合液、乙醇、无水乙醇、DNA/RNA提取试剂盒、核酸纯化柱等。
2. 实验仪器：高速离心机、分光光度计、移液器、漩涡混合器、PCR仪等。
四、实验步骤1. 核酸提取（1）将大肠杆菌接种于LB培养基中，37℃培养过夜。
（2）取适量菌液，加入Tris-HCl缓冲液和NaCl溶液，混匀。
（3）加入SDS溶液，混匀。
（4）加入酚/氯仿/异戊醇混合液，剧烈振荡，静置。
（5）取上层水相，加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，剧烈振荡，静置。
（6）取上层水相，加入2倍体积的无水乙醇，混匀，静置。
（7）离心，弃上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，干燥。
2. 核酸纯化（1）将干燥的核酸沉淀溶于适量TE缓冲液中。
（2）将溶液加入核酸纯化柱中，用TE缓冲液洗柱。
（3）用适量无水乙醇洗柱，收集洗脱液。
3. 核酸定量测定（1）取适量核酸溶液，用紫外分光光度计测定其在260nm和280nm处的吸光度。
（2）根据核酸的摩尔吸光系数（A260=50μM^-1·cm^-1），计算核酸的浓度。
五、实验结果与分析1. 核酸提取实验成功提取了大肠杆菌的核酸，且纯度较高。
2. 核酸纯化实验成功纯化了核酸，且纯度较高。
3. 核酸定量测定实验测定了核酸的浓度，结果如下：A260 = 0.6A280 = 0.5核酸浓度= 0.3 μg/μL六、实验结论1. 实验成功提取、纯化了大肠杆菌的核酸。
核酸含量测定——定磷法
用漩涡混合器混匀，45℃恒温水浴保温25分钟
A660(2) A660平均值 A660平均值—空白 0
9
数据处理
关于空白： 1—6号管用于绘制定磷标准曲线，1号管作 为空白。 7—9号管用于样品及回收率的测定，7号管 作为空白。
以每管含磷量(μg)为横坐标，吸光值为纵坐标画 标准曲线，直线应过原点。 在标准曲线上查出样品(x)和标准磷(y)的含磷量 (μg)。
(4) 样品RNA含量：
样品RNA质量分数(%) RNA质量浓度( g / mL ) 100% 2000( g / mL )
11
操作注意事项
1. 每人独立操作，不允许两人穿插取样； 2. 要求试剂及所有器皿清洁，不含磷； 3. 每管加样和测定均要求平行操作； 4. 消化溶液定容后务必上下颠倒混匀后再取样； 5. 各种试剂必须用移液管按顺序准确量取，移液管口用吸水 纸擦净，溶液尽量加到试管下部，标准溶液要求用差量法。 6. 漩涡混合器的使用：用点动档，试管竖直或稍倾斜垂直向 下用力。 7. 测定吸光值时，用一个比色杯装去离子水调节分光光度计 零点，另一个比色杯按照从低浓度到高浓度的顺序测定， 不用润洗，切忌甩比色杯，将蓝色溶液撒在仪器和地面上。
核酸含量测定
定磷法
1
核酸定量测定常见的方法
1. 定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸 含量，反应灵敏。 2. 紫外吸收法：利用核酸在260nm处有吸收高峰，操作简 便，受蛋白质和核苷酸的干扰影响。 3. 地衣酚法：用于测定RNA的含量，RNA与浓盐酸共热， 降解形成的核糖转变为糠醛，利用地衣酚反应来测定，特异 性差，戊糖均有此反应。 4. 二苯胺法：DNA中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为ω -羟 -γ -酮基戊醛，利用二苯胺试剂反应，除脱氧木糖和阿拉伯 糖外其他糖类无此反应。
12 生物化学实验--核酸的定量分析
核酸的定量分析【目的】1 ．掌握定糖法、定磷法和紫外吸收法分别定量分析 DNA 或 RNA 的方法。
2 ．熟悉定糖法、定磷法和紫外吸收法分别定量分析 DNA 或 RNA 的原理。
【原理】核酸分子中含有戊糖、磷酸与含氮碱，测定三者之一即可推算出核酸含量。
1 ．定糖法通过测定 DNA 或 RNA 分子中戊糖的含量，从而计算出 DNA 或 RNA 含量的方法。
RNA 在强酸环境中加热可水解产生核糖。
核糖在浓酸作用下脱水形成糠醛，糠醛能与 3 ， 5 - 二羟基甲苯（地衣酚）缩合成绿色化合物（反应式见第 3 篇实验 11 ），其最大吸收峰波长为 670nm ， fe 3+ 或 Cu 2+ 可作为催化剂催化反应，与同样处理的核糖标准液进行比色即可测定出 RNA 的含量。
DNA 在强酸环境中加热水解生成的脱氧核糖与浓酸共热脱水生成ω- 羟基γ- 酮基戊醛，后者与能与二苯胺反应生成蓝色化合物（反应式见实验 11 ），其最大吸收峰波长为 595nm ，与同样处理的脱氧核糖标准液进行比色即可测定出DNA 的含量。
2 ．定磷法通过测定核酸中磷的含量，从而计算出 DNA 或 RNA 含量的方法。
核酸含磷量平均为 8.73% （ RNA 含磷量为 8.5~9% ； DNA 含磷量为 9.2% ）。
用强酸使核酸分子中的有机磷消化成无机磷，在酸性溶液中磷酸与钼酸作用生成磷钼酸，后者在还原剂（如抗坏血酸、α-1 ， 2 ， 4- 氨基萘酚磺酸等）存在时，立即被还原为蓝色的钼蓝（反应式见实验 11 ），其最大吸收峰波长为660nm 。
当无机磷浓度在 2.5~25μg/ml 范围内时，溶液的吸光度值与磷含量成正比。
本法测得的磷含量为样品中的总磷量，需同时测定未消化样品中无机磷的含量，将测得的总磷量减去原无机磷含量即为样品中核酸的含磷量，进而计算核酸的含量。
3 ．紫外吸收法核酸分子中的嘌呤环和嘧啶环的共轭双键具有吸收紫外光的性能，最大吸收峰波长为 260nm ，不论是核苷、核苷酸或核酸，在此波段内都具有吸收紫外光的特性。
核酸的定量测定.
0
3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
2. 将试管内溶液立即摇匀，置沸水浴内25-30分钟。取 出冷却至室温，于670nm处测定OD值。
3. 以0-5号管RNA浓度为横坐标，对应光密度为纵坐标 ，绘出标准曲线。
4. 根据6号管测得的OD值，从标准曲线求出RNA待测 液浓度。
2. 在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏 度。除DNA外，脱氧木糖，阿拉伯糖（五碳糖 ）也有同样反应。其它多数糖类，包括核糖在 内，一般无此反应。
• 三、 实验步骤
• 1. 取同样规格的试管7支，按下表顺序分别精 确地加入各试剂。
编号
1
2
3
4
5
6
7
ห้องสมุดไป่ตู้
DNA标准液(200ug/mL) 蒸馏水(mL)
（一）琼脂糖凝胶电泳
用于大片段DNA或RNA的分离，精度低，但分 离范围广。
电泳迁移率决定于： （1）核酸分子的大小 （迁移率与相对分子质量对数成反比） （2）胶浓度 （迁移率与胶浓度成反比，常用0.7～1%） （3）DNA的构象：超螺旋＞线状分子＞开环状分子
（4）电压 （一般5V/cm,电压与迁移率成正比) （5）碱基组成（影响不大） （6）温度（4～30℃都可以，常室温进行）
0.00 0.00 4.00 2.00
Y X
2. 将试管内溶液立即摇匀，于70℃恒温水浴内保温5060分钟。取出冷却至室温，于595nm处测定OD值 。
3. 以1-6号管DNA含量（微克）为横坐标，光密度为纵 坐标，绘出标准曲线。
4. 根据7号管测得的OD值，从标准曲线求出DNA待测 液中的DNA含量。
B
2. 将试管内溶液立即摇匀，于45℃恒温水浴内保温3045分钟。取出冷却至室温，于660nm处测定OD(光密 度)值。
核酸浓度测定
核酸的定量与纯度的测定在分子生物学实验中，核酸提取需要进行其纯度和浓度的测定。
目前实验室常用的测定方法主要有分光光度法、荧光染料法、PCR法和杂交定量法等。
分光光度法分光光度法主要包括紫外分光光度法、定糖定磷法及基于酶催化的核酸定量方法等。
（1）紫外分光光度法紫外分光光度法基于DNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，DNA/RNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm 处。
因此，可以用260nm波长进行分光测定核酸浓度，OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA，单链DNA浓度约为33µg / ml，RNA约为40μg/ml，寡核苷酸约为35μg/ml。
如用1cm 光径，用H2O稀释DNA/RNA样品n倍并以H2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：DNA（mg/ml）=50×OD260读数×稀释倍数/1000RNA（mg/ml）=40×OD260读数×稀释倍数/1000。
A280nm是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA的A260/A280比值为1.8，纯RNA为2.0。
假如比值低，表示受到蛋白（芳香族）或分类物质的污染，需要纯化样品。
比值=1.5相当于50%蛋白质/DNA溶液。
A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA 和RNA的A260/A230比值为2.5。
若比值小于2.0标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。
A320nm或A340nm为检测溶液样品的浊度，该值应该接近0.0。
假如不足，标明溶液中有悬浮物，需要纯化样品。
实验步骤1、将制备的DNA悬浮溶解于TE缓冲液中pH8.0，10mmo1/L的Tris缓冲液，内含(1mmol/L EDTA)或悬浮溶解在灭菌水中(依据DNA含量加水)。
核酸鉴定的三种方法
核酸鉴定的三种方法一、紫外吸收法。
1.1原理。
核酸中的嘌呤和嘧啶碱基具有共轭双键，在260nm波长处有强烈的紫外吸收。
这就像是核酸有一个独特的身份标识，在这个特定的波长下会被检测到。
咱们可以根据这个特性来对核酸进行定性和定量分析呢。
这就好比每个人都有自己独特的指纹，核酸在260nm处的紫外吸收就是它的“指纹”。
1.2操作及判断。
操作起来也不算复杂，把样品放到紫外分光光度计里，测定260nm处的吸光度值。
如果吸光度值在一定范围内，那就说明有核酸存在。
要是这个值比较高，那可能核酸的含量就比较多。
不过这里面也有个小问题，就是有些杂质也可能在这个波长附近有吸收，就像鱼目混珠一样。
所以这个方法虽然简单直接，但也不是百分百准确无误的。
二、琼脂糖凝胶电泳法。
2.1原理。
这就像是一场核酸分子的赛跑比赛。
琼脂糖凝胶就像跑道，核酸分子在电场的作用下在凝胶里迁移。
不同大小的核酸分子迁移速度不一样，就像短跑运动员和长跑运动员速度有差异一样。
小的核酸分子跑得快，大的跑得慢。
这样根据核酸分子在凝胶中的位置，就能判断核酸的大小和大概的纯度了。
2.2操作。
首先要制备琼脂糖凝胶，就像做蛋糕要先准备面糊一样。
然后把核酸样品和上样缓冲液混合，加到凝胶的小孔里，通上电，让它们跑起来。
等跑一段时间后，再用染料染色，这样核酸分子就像穿上了彩色的衣服，在凝胶里能清楚地看到它们的位置了。
2.3结果判断。
如果看到一条清晰的条带，那就说明核酸比较纯。
要是有拖尾或者多条带，那可能就有杂质或者核酸有降解等情况。
这就好比从一个人的走路姿势能看出他是不是健康一样，从核酸在凝胶里的条带情况能判断出核酸的质量好坏。
三、定磷法。
3.1原理。
核酸里面含有磷元素，这可是核酸的一个重要组成部分。
通过测定磷的含量，就能推算出核酸的含量。
这就像是通过数树上的果子数量来推测整棵树的产量一样。
3.2操作及注意事项。
先把核酸样品进行消化处理，让磷元素都释放出来，然后用特定的试剂和磷反应，通过测定反应产物的量来计算磷的含量。
核酸化学—核酸的提取、分离和含量测定
5’
4’
1’
3’ 2’
(OH)
5’
4’
1’
3’ 2’
(OH)
核苷
H N
N
H
H N
9
N
H
腺嘌呤
HOH2C5′ O OH
4′
1′
3′ 2′
OH OH 核腺糖苷
A
G
C
U
dA
dG
dCLeabharlann dT核酸长链记录方式之演进
A T CGA TCG
5’
3’
P
OH
B 1’ R 2’ 3’
N
N H
N
A
7
6
5
1
8
9
4
2
3
鸟嘌呤guanine
O
N NH
N H
N
NH 2
G
嘧啶（Pyrimidine）
尿嘧啶 uracil
O
NH
胞嘧啶 cytosine
NH 2
N
4
5
3
6
2
1
胸腺嘧啶 thymine
O
NH
N
O
H
U
N
O
H
C
N
O
H
T
DNA中的四种碱基及它们间的氢键
胸腺嘧啶 T
胞嘧啶 C
腺嘌呤 A
DNA的粗提取与鉴定
1. NaCl的物质的量浓度为0.14 mol／L 时,DNA的溶解度最低。
2.DNA不溶于酒精溶液。 3.DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色。
实验步骤 1、胀破细胞，得DNA溶液
核酸含量测定——定磷法
12
思考题
1. 回收率的意义； 回收率的意义； 2. 实验所用的水质、试剂质量、定磷试剂的 实验所用的水质、试剂质量、 酸度对测定结果的影响。 酸度对测定结果的影响。
13
实验结束
将试管洗净，斜插在试管架上， 将试管洗净，斜插在试管架上，放在台 面上。 面上。 将消化管和橡皮塞洗净，放回原处。 将消化管和橡皮塞洗净，放回原处。 将比色杯洗净， 将比色杯洗净，放在实验台上的小平皿 中。 将实验台面擦干净。 将实验台面擦干净。
10
(1) 计算回收率： 计算回收率：
y × 50 回收率 = 0.15 ×100% 1000
x × 50 RNA总磷量 g / mL) = 1.5 ( 回收率
(2) 计算样品总磷量： 计算样品总磷量：
(3) 计算 计算RNA量： 量
RNA质量浓度（ g / mL) = 总磷量 无机磷量 DNA含量× 9.9% ×10.5 质量浓度（ （ ） ≈ 总磷量×10.5
核酸含量测定
定磷法
1
核酸定量测定常见的方法
1. 定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸 定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量， 含量，反应灵敏。 含量，反应灵敏。 2. 紫外吸收法：利用核酸在260nm处有吸收高峰，操作简 紫外吸收法：利用核酸在260nm处有吸收高峰 处有吸收高峰， 受蛋白质和核苷酸的干扰影响。 便，受蛋白质和核苷酸的干扰影响。 3. 地衣酚法：用于测定RNA的含量，RNA与浓盐酸共热， 地衣酚法：用于测定RNA的含量 RNA与浓盐酸共热 的含量， 与浓盐酸共热， 降解形成的核糖转变为糠醛，利用地衣酚反应来测定， 降解形成的核糖转变为糠醛，利用地衣酚反应来测定，特异 性差，戊糖均有此反应。 性差，戊糖均有此反应。 4. 二苯胺法：DNA中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为ω-羟 二苯胺法：DNA中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为 中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为ω 酮基戊醛，利用二苯胺试剂反应， -γ-酮基戊醛，利用二苯胺试剂反应，除脱氧木糖和阿拉伯 糖外其他糖类无此反应。 糖外其他糖类无此反应。
几种常见的DNA、RNA含量测定方法
一、DNA含量的测定方法 2.琼脂糖电泳凝胶检测法
实验仪器
微波炉
一、DNA含量的测定方法 2.琼脂糖电泳凝胶检测法
实验仪器
凝胶电泳槽
一、DNA含量的测定方法 2.琼脂糖电泳凝胶检测法
实验仪器
凝胶成像系统
一、DNA含量的测定方法 2.琼脂糖电泳凝胶检测法
实验方法
（1）制备琼脂糖溶液 （2）将琼脂糖溶液倒入电泳支架上，放上梳子，梳子须离开电泳 支架底部1mm左右。待凝胶凝聚后，小心拔去梳子，将支架放入 装有电极缓冲液的
DNA%＝
X 100
一、DNA含量的测定方法 3.二苯胺法
应用范围
仅限于对于提取的DNA不含有其他糖及糖的衍生物、芳香醛、蛋白质等杂质且浓 度大于50mg/l的情况下适用
一、DNA含量的测定方法 3.二苯胺法
优点： 缺点：
操作简便，有一定精确性，常用作教学性实验
对DNA样品纯度有一定要求，实验试剂非实验室常用试剂
2.琼脂糖电泳凝胶检测法
一、DNA含量的测定方法
实验原理
DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分 子在电场中通过介质而泳动。对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量、 电荷量、分子大小及构象有关。因此通过电泳可大致将分子量不同的DNA分离开。 之后通过在凝胶中加入少量EB（其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种光络合 物，在254~365nm波长紫外光照射下呈现荧光）来对DNA进行检测和分析。而 相同分子量DNA浓度与其荧光亮度呈正比。因此DNA片段的浓度可与已知浓度的 DNA同时进行电泳，通过结合的EB荧光强度，来估计其含量。
2
4
1.6
4
1.2
核酸含量测定方法
核酸含量测定方法核酸含量测定方法1. 摄取样品•取得待测样品，如DNA或RNA。
•确保样品质量高，避免污染。
2. 分离核酸•使用离心机将核酸与其他细胞部分进行分离。
•根据样品特点选择合适的分离方法，如酚/氯仿法、硅胶柱层析法等。
3. 确定核酸含量光谱法•通过测量核酸在紫外光谱下的吸收来确定其含量。
•使用纳米比色皿或光谱仪进行测量。
•根据核酸的碱基组成和光谱特性选择合适的波长进行测量。
比色法•利用核酸与特定试剂反应产生有色产物进行定量测定。
•常用方法包括二苯基胺（DBA）法、二倍卯胺（PicoGreen）法等。
•利用钻石黑与核酸形成复合物，通过测量复合物的吸光度来测定核酸含量。
•该方法操作简便、灵敏度高。
四硫代氨基嗪（SSB）法•利用核酸与SSB形成特定的复合物，通过测量复合物的吸光度来测定核酸含量。
•该方法适用于DNA和RNA的测定。
4. 数据处理与分析•根据测定结果进行数据整理与统计；•利用计算机软件如Excel、GraphPad Prism进行数据处理与绘图；•进一步分析数据以得到准确的结果。
5. 结论•根据测定结果，得出核酸样品的含量；•确定核酸含量对于分子生物学研究和实验操作至关重要。
以上是一些常见的核酸含量测定方法，根据实验需求和样品特点，选择合适的方法进行测定是确保结果准确可靠的关键。
不同方法有不同的优缺点，研究人员可以根据实际情况进行选择和优化，以获得最佳的测定结果。
•核酸含量测定方法在许多领域都有广泛的应用，包括分子生物学、遗传学、药物研发等。
•在分子生物学中，核酸含量测定是基础的实验技术，用于确定核酸样品的浓度和纯度，为后续实验提供准确的参考。
•在遗传学中，核酸含量测定可用于估算基因拷贝数、基因组大小以及测定突变体的细胞内核酸含量等。
•在药物研发中，测定药物与核酸的相互作用也是核酸含量测定的一个重要应用领域。
7. 未来发展趋势•随着生物技术和分子生物学的不断发展，核酸含量测定方法也在不断改进和发展。
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为什么要测核酸含量
有助于接下来核酸相关实验中所用酶和其他试剂含量的确定 为了排除核酸在实验中的干扰
核酸含量测定的几种方法
定磷法 定糖法 紫外吸收法 荧光光度法
定磷法
在酸性环境中，定磷试剂中的钼酸铵以钼酸形式与样品中的磷酸反应 生成磷钼酸，当有还原剂存在时磷钼酸立即转变蓝色的还原产物—— 钼蓝
优缺点：只用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液
荧光光度法
即琼脂糖凝胶电泳法。 溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，它插入到DNA分子中形成荧光
结合物，使发射的荧光增强几十倍，而荧光的强度正比于DNA的含量 ，将已知浓度的标准样品作为电泳对照，就可以估计出待测样品的浓 度。用量只需要5-10ng DNA即可，肉眼观察可检测0.05g-0.1g的 DNA。 该方法只是估计水平，另外还应考虑DNA或RNA样品中分子大小与标 准对照中核酸分子的长度。
测定核酸含量的几种方法
命基111 10111104 朱家民
核酸
由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一 。
核酸广泛存在于所有动植物细胞、微生物内、生物体内的核酸常与蛋 白质结合形成核蛋白。
同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。根据化学组成不 同，核酸可分为核糖核酸（简称RNA）和脱氧核糖核酸（简称DNA） 。
小节
根据不同情况以及实验条件选择合适的检测方法。 无论何种方法，均需保证待测样品的核酸（DNA或RNA)纯度。 根据需要设定一定的平行以及对照。
再见
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注意事项
1）清洗实验用容器不要用含磷清洗剂 2）消化过程注意防止爆沸和溅出内容物
定糖法
核酸中的戊糖可在浓盐酸或浓硫酸作用下脱水生成醛类化合物，醛类 化合物可与某些成色剂缩合成有色化合物，可用比色法或分光光度法 测定其溶液中的吸收值，在一定浓度范围内，溶液的吸收值与核酸的 含量成正比。
1、核糖的测定 生成的绿色化合物在λ=670nm处有最大的吸收值。
钼蓝最大的光吸收在650—660nm波长处。当使用抗坏血酸为还原 剂时，测定的最适范围为1—10微克无机磷。测定样品核酸总磷量， 需先将它用硫酸或过氯酸消化成无机磷再行测定。总磷量减去未消化 样品中测得的无机磷量，即得核酸含磷量，由此可以计算出核酸含量 。
优缺点：简单，快速，灵敏度高，但是受蛋白质和核苷酸的影响
组成核酸分子的碱基，均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收值在 波长为250~270nm之间。核酸的最大吸收波长是260nm，这个物 理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。
在波长260nm紫外线下，1OD值的光密度相当于双链DNA浓度为 50μg/ml；单链DNA或RNA为20μg/ml。可以次来计算核酸样品的 浓度。
2、脱氧核糖的测定 DNA中的脱氧核糖可在浓硫酸作用下脱水生成ω-羟基-γ-酮戊酸
，该化合物可与二苯胺生成兰色化合物，在λ=595nm处有最大吸收 值。
优缺点：较灵敏，但特异性较差，凡戊糖均有此反应。
注意事项
其他糖及糖的衍生物、芳香醛、蛋白质等都对实验有干扰，测定前应尽 量可能除去。
紫外吸收法