工程菌人溶菌酶的纯化和性质_叶军
实验十 溶菌酶提取、分离、纯化及生物学性质、理化性质
实验七溶菌酶的制备及其性质【实验目的】同羧肽酶实验【实验要求】同羧肽酶实验【实验内容】1.溶菌酶Y活性检测⑴酶活力测定方法⑵酶活力单位定义⑶比活力定义⑷蛋白含量测定方法2. 蛋清溶菌酶的提取⑴每组4～5个新鲜鸡蛋⑵利用等电点沉淀及树脂层析等方法进行溶菌酶提取3. 溶菌酶的分离、纯化⑴利用各种方法，从上述提取液分离⑵每步纯化前蛋白纯度检测⑶分离纯化过程中跟踪检测活性组份的蛋白质含量和酶活性4. 溶菌酶理化性质⑴溶菌酶的分子量测定⑵溶菌酶的等电点测定5. 溶菌酶的酶学性质⑴在活力单位定义确定后，求出溶菌酶的Vmax和Km⑵初步确定溶菌酶的最适pH⑶初步确定溶菌酶的最适温度⑷提出最少两种溶菌酶的可逆抑制剂并验证抑制类型⑸提出溶菌酶的激活性并验证(6) 溶菌酶的热稳定性【实验原理】溶菌酶（lysozyme）是由弗莱明在1922年发现的，它是一种有效的抗菌剂，全称为1，4-β-N-溶菌酶，又称作粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁质酶。
活性中心为天冬氨酸52和谷氨酸35，是一种糖苷水解酶，能催化水解粘多糖的N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）与N-乙酰胞壁酸（NAM）间的β-1，4糖苷键，相对分子质量14700Da，由129氨基酸残基构成，由于其中含有较多碱性氨基酸残基，所以其等电点高达10.8左右，最适温度为50O C，最适PH为6～7左右。
在280nm的消光系数[%1A]为13.0。
该酶活性可被一些金属离子Cu2+、Fe2+、Zn2+（10-5～10-3M）1cm以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2+、Ca2+（10-5～10-3M）、NaCl所激活。
溶菌酶广泛存在于动植物及微生物体内，鸡蛋(含量约为2%～4%)和哺乳动物的乳汁是溶菌酶的主要来源，目前，溶菌酶仍属于紧销的生化物质，广泛应用于医学临床，具有抗感染、消炎、消肿、增强体内免疫反应等多种药理作用。
溶菌酶常温下在中性盐溶液中具有较高天然活性，在中性条件下溶菌酶带正电荷，因此在分离制备时，先后采用等电点法，D152型树脂柱层析法除杂蛋白，再经Sephadex G-50层析柱进一步纯化。
溶菌酶分离纯化的研究进展
院（系）名称生命科学系专业名称生物技术学生姓名徐孝锋学号111344009完成时间2013年11月溶菌酶分离纯化的研究进展生命科学系生物技术徐孝锋111344009摘要对近年来最新的溶菌酶分离纯化的方法,如包括膜色谱法、离子交换法、双水相技术、反胶团萃取、膨胀床吸附法等进行了总结并对利用溶菌酶时存在的问题进行了分析总结，对溶菌酶的应用前景进行了展望。
关键词溶菌酶; 膜色谱法; 分离; 纯化；应用The Research and Application of LysozymeAbstract In this article, the structure, properties, purification, activity measurement and renaturation of lysozyme are summarized. The application of the enzyme in food industry，biological engineering and medicine is also introduced．The encountered problems in application of lysozyme are pointed out, and the potential for further application of lysozyme is predicted．Keywords Lysozyme ；Structure and Properties ；Applications ；Purification ；Enzyme Activity溶菌酶(Ｌｙｓｏｚｙｍｅ)是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶,又称细胞壁溶解酶，是一种糖昔水解酶,水解组成细菌细胞壁的N一乙酞胞壁酸(NAM)和N一乙酞萄糖胺(NAG)之间的日一1,4糖昔键,广泛存在于自然界中[19]。
1922年弗来明(Ｆｌｅｍｉｎｇ)发现在人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶,因其具有溶菌作用,故命名为溶菌酶【4】。
溶菌酶的提取纯化及纯度测定
溶菌酶的提取纯化以及纯度鉴定实验者：钟吴宇豪绿药1501班 201530360127 同组者：连学帆韩家鑫实验地点：东配302 实验日期：2017年5月26日-5月27日报告完成日期：2017年5月28日指导老师：易喻【摘要】溶菌酶是一种具有水解细菌细胞壁能力的蛋白质，工业上通常以蛋清为原料，在pH6.5条件下用弱酸性阳离子交换树脂732吸附后，再用硫酸铵洗脱，经透析后冷冻干燥得到，在医学及食品商具有广泛应用。
本文中我们通过等电点沉淀法对溶菌酶进行粗提取，然后通过离子交换层析进一步除去杂蛋白，提纯所得的溶菌酶粗品，并且通过紫外分光光度计检测溶液吸光度来对最后的产品进行纯度及产率鉴定，确认得到了纯化倍数较高但产率较低的溶菌酶产品。
Lysozyme is a protein of bacterial cell wall hydrolysis ability, the industry usually with egg white as raw material, 732 exchange resin adsorption with weakly acidic cation under the condition of pH6.5, with ammonium sulfate was dialyzed after freeze drying, is widely used in medicine and food business. In this paper we by isoelectric point precipitation method for crude extraction of lysozyme, followed by ion exchange chromatography to remove impurity protein, lysozyme crude purified, and the measured absorbance of the purity and yield of the final product identification of UV spectrophotometry, confirmed the purification factor was high but low yield the lysozyme product.【关键词】溶菌酶，等电点沉淀法，离子交换层析，酶活，提纯【引言】对溶菌酶的研究始于20 世纪初,人们发现人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶,因其具有溶菌作用,故命名为溶菌酶。
溶菌酶的提取及系列性质的测定
溶菌酶的提取及系列性质的测定摘要本文研究了从新鲜蛋清中提取溶菌酶的方法及其溶菌酶一系列性质的测定。
通过采用离子交换树脂和硫酸铵沉淀法对鸡蛋清中的酶提取，采用凝胶层析法对提取的溶菌酶进一步纯化，并用考马斯亮蓝G-250试剂，脲的试剂及SDS-PAGE不连续电泳的原理和实验方法分别对溶菌酶的酶活力、蛋白质浓度、酶促动力学、分子量及纯度进行了测定。
关键字：新鲜鸡蛋，溶菌酶，提取，性质，测定溶菌酶的简介溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶、球蛋白G，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。
主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。
溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。
溶菌酶相对分子质量约为1.44×104，是一种强碱性蛋白质，等电点在10.0以上，并对温度和酸不敏感。
在自然界中，普遍存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿液、淋巴液等细胞中，植物卷心菜、萝卜、木瓜等，以蛋清含量最丰富，约为0.3%。
实验目的：1、了解酶的基本研究过程。
2、掌握溶菌酶提取和性质测定中的实验方法。
3、熟悉有关生化技术的基本原理和基本操作。
I．实验准备一实验目的1.熟悉并了解整个实验流程。
2.熟练掌握各种溶液的配制。
二实验仪器及材料仪器：柱层析系统（层析柱，恒流泵，紫外监测仪，部分收集器），Sigma高速冷冻离心机，722s分光光度计，透析袋，水浴锅，电泳仪，电泳槽，紫外凝胶成像系统。
材料：新鲜鸡蛋。
试剂：（1）弱酸性阳离子交换树脂；（2）磷酸氢二钠；（3）磷酸二氢钠；（4）氯化钠；（5）硫酸铵；（6）氢氧化钠；（7）甘油；（8）盐酸；（9）葡聚糖凝胶G-50；（10）溶壁微球菌干粉；（11）考马斯亮蓝G-250；（12）95%乙醇；（13）85%磷酸；（14）牛血清清蛋白(BSA)；（15）脲；（16）丙烯酰胺（Acr）；（17）甲叉双丙烯酰胺（Bis）；（18）四甲基乙二胺（TEMED）；（19）甘氨酸(Gly)；（20）过硫酸铵（AP）；（21）考马斯亮蓝R-250；(22)三羟甲基氨基甲烷（Tris）；（23）2-β-巯基乙醇；（24）十二烷基磺酸钠（SDS）；（25）溴酚蓝；（26）冰醋酸；（27）标准蛋白：SDS-低相对分子质量标准蛋白.三试剂配制(1) 0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0；【配置成5*500ml，临用前稀释】(2) 2mol/L NaOH；200ml(3) 2mol/L HCl；200ml(4) 含50%甘油的0.1mol/L 磷酸盐缓冲液，pH 7.0；200ml(5) 含0.05mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液，pH7.0；（现用现配）【临用前配置】200ml(6) 含0.5 mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液，pH7.0；（现用现配）【临用前配置】200ml(7) 含0.1 mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液，pH7.0；（现用现配）【临用前配置】(8) 测活缓冲液：含30mmol/L NaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0；(9) 底物溶液Ⅰ：40mg溶壁微球菌干粉溶于100mL测活缓冲液中；【公用，临用前配置】(10) 考马斯亮蓝G-250试剂：考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50mL 95%乙醇中，加入100mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL，滤纸过滤；【公用】(11) 标准蛋白质溶液：用0.1mol/L NaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0配制1mg/ml牛血清清蛋白溶液；（100ml）(12) 底物溶液Ⅱ：300mg溶壁微球菌干粉溶于100ml测活缓冲液中；【公用，临用前配置】(13) 10mol/L 脲，测活缓冲液配制；【50ml】(14) 30%胶贮液：每100mL中含丙烯酰胺29.2g，甲叉双丙烯酰胺0.8g；【100ml公用】(15) 1.5mol/L Tris-HCl pH 8.8；【100ml公用】(16) 0.5mol/L Tris-HCl pH 6.8；【100ml公用】(17) 10%（W/V）过硫酸铵；【现用现配】(18) SDS电泳缓冲液：25mmol/L Tris，0.192mol/L Gly，0.1%（W/V）SDS；【500ml】(19) 10%（W/V）SDS；【10ml】(20) 染色液：0.2g考马斯亮蓝R-250，42mL工业酒精，10mL冰醋酸，加蒸馏水至100mL；【50ml】(21) 脱色液：5mL冰醋酸，45mL工业酒精，50mL蒸馏水；【100ml】(22) 保存液：7%冰醋酸；(现用现配)(23) 2×上样缓冲液：【公用，10ml】0.5mol/L Tris-HCl pH 6.8 2mL甘油2mLSDS 0.4g0.1%溴酚蓝0.5mL2-β-巯基乙醇0.5mL蒸馏水 2.5mL注意事项：1.准确称量各种药品试剂从而防止实验误差的产生2,量取各种液体试剂时必须准确是实验结果更加精准。
实验3溶菌酶分离提纯
02
实验条件控制不当
实验条件如温度、pH值等未能在 适宜范围内，影响了实验结果。
04
数据分析错误
对实验数据进行分析时，可能存 在误判或遗漏，导致结论不准确
。
对实验的改进建议
加强操作培训
严格控制实验条件
对实验操作人员进行培训，提高其操作技 能和实验水平。
确保实验条件如温度、pH值等在适宜范围 内，以提高实验结果的可靠性。
加强试剂管理
完善数据分析方法
建立试剂管理制度，确保试剂质量可靠、 使用有效。
对数据分析方法进行完善，确保能够准确 解读实验结果。
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溶菌酶的浓缩和结晶
浓缩
将溶菌酶溶液进行浓缩，以降低溶剂的体积。
结晶生长
将诱导后的溶液放置在恒温条件下，让结晶 慢慢生长。
结晶诱导
向浓缩后的溶菌酶溶液中加入适量的盐或有 机溶剂，以诱导结晶的形成。
离心收集结晶
将结晶离心分离出来，并用适量的水或缓冲 液洗涤。
04 结果分析
分离效果的分析
分离效果
通过实验结果，我们可以观察到溶菌 酶的分离效果。通过色谱图或电泳图， 可以直观地看到目标蛋白与杂质蛋白 的分离情况。
掌握实验操作技能
01
通过本实验，学生将掌握溶菌酶 分离提纯的基本实验操作技能， 包括调节溶液pH值、沉淀、萃取 、吸附等。
02
学生将学会使用离心机、分光光 度计等实验仪器，了解实验数据 的处理和分析方法。
02 实验原理
溶菌酶的分子结构和性质
01
溶菌酶是一种碱性蛋白，分子量约为14000-18000 道尔顿，由约129个氨基酸组成。
19-酶的分离纯化及酶学性质研究
酶的分离纯化---介绍酶分离纯化的步骤、原则和评价方法⏹酶的分离提纯●酶分离纯化的目的：研究酶的性质、作用、反应动力学、结构与功能的关系、阐明代谢途径；作为生化试剂和药物。
●酶提纯主要包括：酶制剂的浓缩；杂蛋白和杂质的去除●分离纯化方法的衡量指标总活力回收；比活力提高的倍数。
材料处理抽提分离纯化鉴定机械、化学，组织/细胞破碎,蛋白质释放缓冲液、离子浓度pH，蛋白质溶解到缓冲液，盐析、有机溶剂、等电点、吸附、超滤，缩小体积离心离心离子交换、凝胶过滤、疏水层析、亲和层析、高效液相、快速蛋白质液相层析、电泳、结晶电泳、结晶、溶解度、高效液相，二种以上分子量、等电点、活性酶总活力比活力回收率纯化倍数酶总活力比活力酶总活力比活力酶总活力比活力酶总活力比活力酶的分离提纯过程⏹评价指标●总活力=活力单位数/ml×总体积（ml）●比活力=活力单位数/ mg蛋白（氮）=总活力单位数/ 总蛋白（氮）mg ●纯化倍数=每次比活力/第一次比活力●回收率=每次总活力/第一次总活力某科研人员在对酶分离纯化过程中得到以下实验结果：请根据上述实验结果回答以下问题：⑴在六部分离纯化过程中，哪一步（A）分离效果最好，哪一步（B）分离效果最差？依据是什么？⑵上述A和B步骤分离纯化方法的原理是什么？⑶该酶是否已经纯化？还可以用什么方法确定其纯度？分离步骤总蛋白质含量(mg) 活力单位数1 粗分离20 000 4 000 0002 盐析 5 0003 000 0003 等电点分离4 000 1 000 0004 离子交换200 900 0005 亲和层析50 750 0006 分子筛层析45 675 000分离步骤总蛋白含量mg 活力单位数比活力回收率纯化倍数1粗分离20 000 4 000 00020010012盐析 5 000 3 000 0006007533等电点分离 4 000 1 000 00025025 1.254离子交换200900 000450022.522.55亲和层析50750 0001500018.75756分子筛层析45675 0001500016.8875回收率=100*每一步的活力单位数/第一步的活力单位数纯化倍数=每一步的比活力/第一步的比活力取XXmL 酶液测定其中蛋白质的含量，换算总蛋白含量取XXmL 酶液测定其中酶活力单位数，换算活力单位数总活力数/总蛋白含量宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化纯化步骤总蛋白总活力比活力纯化倍数回收率（mg）（U）（U/mg蛋白）（%）1、粗酶液80 4320 54 1 1002、乙醇沉淀29 3585 123 2.27 833、醋酸钙沉淀21 2980 141 2.64 694、盐析 4 1771 464 8.52 415、丙酮沉淀 1 1166 1104 20.29 276、结晶0.12 130 1072 19.70 3。
溶菌酶的提取纯化及纯度测定
1.1试剂与仪器
1.1.1试剂250mL烧杯、玻璃棒、小漏斗、定性快速滤纸、50mL量筒、50mL离心管、鸡蛋1只、0.02mo1/LPBS（pH7.0、pH8.0、）,l mLEp管, pH计,移液管1m1、冰醋酸、5mo1/L NaOH,滴管,离心管，样品S1、S2、S-2, CM一纤维素高子交换介质., 0.02mo1/LpH8.0的PBS, 0.6mo1/LNaC1,烧杯（50mL, 250mL）、桔草芽胞杆菌过夜培养物（37℃,18h,160r/min,100/250mL）、0.02mo1/L pH8.0的PBS（测活缓 冲液,含50mmo1/LNaC1）, 0.2mo1/LpH8.0的PBS。
【关键词】溶菌酶，等电点沉淀法，离子交换层析，酶活，提纯【引 言】 对溶菌酶的研究始于20世纪初,人们发现人的唾液、眼泪中存在有 溶解细菌细胞壁的酶,因其具有溶菌作用,故命名为溶菌酶。1937年Abraham和Robinson从卵蛋白中分离出溶菌酶晶体,揭开了研究溶菌酶的历史篇章。 它广泛 存在于鸟类、家禽的蛋清中和哺乳动物的泪液、唾液、血浆、乳汁、胎盘以及体 液、组织细胞内,其中在蛋清中含量最丰富(约0.13% )在一些植物体如卷心菜、 萝卜、无花果和微生物体内也存在溶菌酶,只是含量差异较大。
溶菌酶的提取纯化以及纯度鉴定实验者：钟吴宇豪 绿药1501班201530360127同组者：连学帆 韩家鑫 实验地点：东配302实验日期：2017年5月26日-5月27日 报告完成日期：2017年5月28日 指导老师：易 喻
【摘要】溶菌酶是一种具有水解细菌细胞壁能力的蛋白质，工业上通常 以蛋清为原料，在pH6.5条件下用弱酸性阳离子交换树脂732吸附后，再用硫酸铵洗脱，经透析后冷冻干燥得 到，在医学及食品商具有广泛应用。 本文中我们通过等电点沉淀法对溶菌酶进行粗提取， 然 后通过离子交换层析进一步除去杂蛋白， 提纯所得的溶菌酶粗品， 并且通过紫外分光光度计 检测溶液吸光度来对最后的产品进行纯度及产率鉴定， 确认得到了纯化倍数较高但产率较低 的溶菌酶产品。
溶菌酶的提取,分离纯化,产物纯度鉴定及活性测定精选全文
可编辑修改精选全文完整版溶菌酶的提取，分离纯化，产物纯度鉴定及活性测定实验目的：1、学习和掌握溶菌酶的制备过程2、学习和掌握溶菌酶的纯化过程3、学习和掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的德原理和技术4、测定溶菌酶的分子量和所提取的溶菌酶的浓度5、测定所提取的溶菌酶的活性试验原理：溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。
主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。
溶于水，不溶于乙醚和丙酮，pI为11.0-11.35，最适pH值6.5。
酸性介质中可稳定存在，碱性介质中易失活。
溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。
因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
该酶广泛存在于人体多种组织中，鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液以及微生物中也含此酶，其中以蛋清含量最为丰富。
从鸡蛋清中提取分离的溶菌酶是由18种129个氨基酸残基构成的单一肽链。
它富含碱性氨基酸，有4对二硫键维持酶构型，是一种碱性蛋白质，其N端为赖氨酸，C端为亮氨酸。
可分解溶壁微球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰阳性菌。
2.1、离子交换层析离子交换层析是依据混合样品中各种离子或离子化合物与离子交换树脂的可交换离子之间的交换程度不同而进行分离纯化的。
离子交换层析主要是离子交换剂与溶液中离子或离子化合物以离子交换方式进行，过程是可逆的。
由于离子交换剂对溶液中各种离子具有不同的结合力，也就是说，离子交换剂对各离子的排斥和阻滞作用不同，从而引起各离子在柱内的流速差异，逐渐发生分离，最终分别流出层析柱。
该法可同时分析多种离子化合物，具有灵敏度高，重复性、选择性好，分离速度快等优点。
溶菌酶制备及其性质鉴定(生物制品技术课件)
溶菌酶广泛存在于动植物及微生物体内，具有抗感染、消炎、消肿、增强体内免 疫反应等多种药理作用。
鸡蛋清内含有丰富的溶菌酶，向鸡蛋清中加入一定量的中性盐，并调节pH至溶菌 酶的等电点，溶菌酶即可结晶析出。
如若结晶不纯，可以重结晶。
实验原理
溶菌酶之所以溶菌，因它能催化革兰氏阳性细菌细胞细胞壁作为底物，以单位时间内被它水解的
细胞壁的量表示酶活力的大小。
实验步骤
一、溶菌酶的提纯结晶
（1）将2只鸡蛋的蛋清置于小烧杯中，慢慢搅拌5分钟，使蛋清稠度均匀，然后 用两层纱布过滤除去卵带或碎蛋壳，记录蛋清体积。
（2）按每100ml蛋清溶液加入5g氯化钠的比例，向蛋清溶液中慢慢加入氯化钠 细粉，边加边搅拌，促使氯化钠细粉及时溶解，以避免局部浓度过高或沉淀于容 器底部，否则会引起蛋白质的变性而产生大量的白色沉淀。
实验步骤
（3）加完氯化钠细粉后，再用1mol/L的氢氧化钠溶液小心地将上述蛋清溶液的 PH值调节到9.5-10.0。
低温下静置7d，溶菌酶结晶将慢慢析出，于72-96h 达到最高产率。 （4）将结晶溶液4000r/min，离心5min，倾去上清液，加入等体积预冷0℃丙酮，
再4000r/min，离心5min，洗涤后弃去上清液，即可得到粗制的溶菌酶晶体。
实验步骤
二、溶菌酶的活力测定
（1）酶液的制备 准确称取溶菌酶样品100mg， 用0.1mol/L，pH6.2磷酸缓冲液 配成1mg/ml的酶液，再将酶液稀释成50µg/ml。
（2）将酶液2mL和底物悬液2mL（短小芽孢杆菌）分别置于25℃水浴中保温1015min，然后吸取底物悬液4mL放入比色皿中，450nm波长读出吸光度，此为0 时读数。
实验结果
1、计算出溶菌酶的活力单位 2、请说出其它提取和纯化溶菌酶的方法吗？请写出相关的方法及原理。
溶菌酶分离纯化实验报告
一、实验目的1. 学习溶菌酶的分离纯化方法；2. 掌握凝胶色谱法、离子交换色谱法等分离纯化技术；3. 分析溶菌酶的纯度、分子量等特性。
二、实验原理溶菌酶是一种广泛存在于自然界中的碱性蛋白酶，具有水解细菌细胞壁中肽聚糖的作用，导致细菌细胞破裂死亡。
本实验采用凝胶色谱法、离子交换色谱法等分离纯化技术，从溶菌酶粗提液中分离纯化溶菌酶。
三、实验材料1. 溶菌酶粗提液；2. 凝胶色谱柱（Sephadex G-100）；3. 离子交换树脂（DEAE-Cellulose）；4. 透析袋；5. 氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等；6. 紫外分光光度计；7. pH计；8. 离心机；9. 超声波处理仪。
四、实验步骤1. 凝胶色谱法分离溶菌酶（1）将溶菌酶粗提液用透析袋透析，去除小分子杂质；（2）配制凝胶色谱柱，用磷酸盐缓冲液平衡；（3）将透析后的溶菌酶粗提液上样，收集各洗脱峰；（4）检测各洗脱峰的紫外吸收值，确定溶菌酶的最佳洗脱峰；（5）将最佳洗脱峰浓缩，复溶于磷酸盐缓冲液。
2. 离子交换色谱法纯化溶菌酶（1）将凝胶色谱法分离得到的溶菌酶浓缩液用透析袋透析，去除盐分；（2）配制离子交换树脂柱，用磷酸盐缓冲液平衡；（3）将透析后的溶菌酶浓缩液上样，收集各洗脱峰；（4）检测各洗脱峰的紫外吸收值，确定溶菌酶的最佳洗脱峰；（5）将最佳洗脱峰浓缩，复溶于磷酸盐缓冲液。
3. 溶菌酶纯度分析（1）将纯化后的溶菌酶用紫外分光光度计检测，计算其浓度；（2）对溶菌酶进行SDS-PAGE电泳，观察其分子量；（3）根据SDS-PAGE电泳结果，分析溶菌酶的纯度。
五、实验结果1. 凝胶色谱法分离得到的溶菌酶在280nm波长下具有明显的吸收峰，表明其为蛋白质；2. 离子交换色谱法纯化后的溶菌酶在280nm波长下具有明显的吸收峰，表明其为蛋白质；3. SDS-PAGE电泳结果显示，溶菌酶的分子量为14.4kDa；4. 溶菌酶的纯度达到95%以上。
实验十-溶菌酶提取、分离、纯化及生物学性质、理化性质
实验七溶菌酶的制备及其性质【实验目的】同羧肽酶实验【实验要求】同羧肽酶实验【实验内容】1.溶菌酶Y活性检测⑴酶活力测定方法⑵酶活力单位定义⑶比活力定义⑷蛋白含量测定方法2. 蛋清溶菌酶的提取⑴每组4～5个新鲜鸡蛋⑵利用等电点沉淀及树脂层析等方法进行溶菌酶提取3. 溶菌酶的分离、纯化⑴利用各种方法，从上述提取液分离⑵每步纯化前蛋白纯度检测⑶分离纯化过程中跟踪检测活性组份的蛋白质含量和酶活性4. 溶菌酶理化性质⑴溶菌酶的分子量测定⑵溶菌酶的等电点测定5. 溶菌酶的酶学性质⑴在活力单位定义确定后，求出溶菌酶的Vmax和Km⑵初步确定溶菌酶的最适pH⑶初步确定溶菌酶的最适温度⑷提出最少两种溶菌酶的可逆抑制剂并验证抑制类型⑸提出溶菌酶的激活性并验证(6) 溶菌酶的热稳定性【实验原理】溶菌酶（lysozyme）是由弗莱明在1922年发现的，它是一种有效的抗菌剂，全称为1，4-β-N-溶菌酶，又称作粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁质酶。
活性中心为天冬氨酸52和谷氨酸35，是一种糖苷水解酶，能催化水解粘多糖的N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）与N-乙酰胞壁酸（NAM）间的β-1，4糖苷键，相对分子质量14700Da，由129氨基酸残基构成，由于其中含有较多碱性氨基酸残基，所以其等电点高达10.8左右，最适温度为50O C，最适PH为6～7左右。
在280nm的消光系数[%1A]1cm 为13.0。
该酶活性可被一些金属离子Cu2+、Fe2+、Zn2+（10-5～10-3M）以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2+、Ca2+（10-5～10-3M）、NaCl所激活。
溶菌酶广泛存在于动植物及微生物体内，鸡蛋(含量约为2%～4%)和哺乳动物的乳汁是溶菌酶的主要来源，目前，溶菌酶仍属于紧销的生化物质，广泛应用于医学临床，具有抗感染、消炎、消肿、增强体内免疫反应等多种药理作用。
溶菌酶常温下在中性盐溶液中具有较高天然活性，在中性条件下溶菌酶带正电荷，因此在分离制备时，先后采用等电点法，D152型树脂柱层析法除杂蛋白，再经Sephadex G-50层析柱进一步纯化。
酶工程 第四章 酶的提取与分离纯化
（二）离心机的种类
按离心机转速的不同，分为： 常速（低速） 高速 超速
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离心机的种类
名称
转速(r/min)
注意事项
低速离心机 高速离心机 超速离心机
6000 6000〜 25000 >25000
常温，注意样品热变性和离心 管平衡
冷冻（防止温度升高）， 离心管的精确平衡
冷冻＋真空系统（减少空气阻 力和摩擦）， 离心管的精确平衡
点相距较大的杂蛋白），多与其它方法联合使用 （如盐析法、有机溶剂法），因蛋白质在质的pI都在偏酸性范围内
2）无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低 3）无需除掉多余酸即可进行下一步纯化
4. 缺点：
酸化时，容易引起蛋白质失活
39
（四）有机聚合物沉淀法
4.酶解法（enzymatic lysis）：
外加酶法： 根据细胞壁的结构和组成特点，选用适当的酶。 自溶法（autolysis）: 细胞结构在本身具有的各种水解酶作用下发 生溶解的现象。
12
（三）细胞破碎确认
1.直接测定破碎前后的细胞数：
破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数；
破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。
细菌
菌
酵母菌
霉菌
壁厚 /nm
层次
15 ~ 50 单层
10 ~ 13 同G+ 多层
100 ~ 300 多层
100 ~ 250 多层
主要 组成
肽聚糖
(40% ~ 90%) 多糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖 (1%〜2%)
肽聚糖 (5% ~ 10%)
脂蛋白 脂多糖 (11% ~ 22%) 磷脂 蛋白质
葡聚糖(30% ~ 40%) 多聚糖
实验 溶菌酶的粗提取、分离纯化及酶活力、纯度及分子量测定
46
SDS-PAGE separates proteins by MW
47
蛋白质的迁移率与分子量的对数呈线性关 系，符合下式：logMW=K-bX MW：分子量；X：迁移率；k、b均为常数
CH2CH3
载 体
-O-CH2CH2N-H Cl-
Diethylaminoethyl (DEAE)
CH2CH3
阴离子交换剂
(可吸附带负电的蛋白质)
阳离子交换剂
(可吸附带正电的蛋白质) 22
两种离子交换剂
阴离子交换剂：
常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基2-羟丙基
DEAE －C2H4N+(C2H5)2H
2.酶的比活力： 每单位酶蛋白所含的活力单位数。 对固体酶：用活力单位/mg酶蛋白、或活力单位
/mg酶蛋白氮来表示； 对液体酶：用活力单位/ml酶液来表示。 很明显，比活力越大，酶的活力越大。
37
3.具体测定方法
分光光度法：产物与适当的化学试剂生成有色物质 或产物有紫外吸收的能力可采用此法。
测压法：产物中有气体，测气压增加量。 滴定法：产物中有酸生成，用碱滴定。 荧光法：产物中有荧光物质生成或产物与荧光试剂
r平均=1/2（r大+r小）cm
8
通常：
•低速离心以每分钟的转数表示，如： 4000r/min。 •高速离心（超速），常以相对离心力（RCF）表 示，如：65000g。
两者可换算或查测算图。
9
离心机的种类
名称
转速(r/min)
注意事项
溶菌酶的纯化及发展
溶菌酶的纯化及发展中图分类号：O641 TQ028.8 Q55 文献标识码：A 文章编号：1673-0992（2009）12-030-01关键词：溶菌酶性质；分离纯化；前景溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。
主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。
溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。
因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
一、分离纯化方法1.结晶法结晶法是一种传统的制备溶菌酶的方法，通过改变溶液条件，使溶菌酶以结晶态析出。
以王敏的制备卵清溶菌酶实验方法为例，介绍结晶法制备溶菌酶：结晶法分离溶菌酶的产率一般为60％～80％。
这种方法操作简单，应用于卵清溶菌酶结晶品的工业生产，使产品的成本大大降低，为其医药应用作出了贡献。
但是其生产周期较长，产率相对偏低，高纯度产品获取过程复杂；另外此法不能用以分离微量的溶菌酶。
2.离子交换法离子交换法一直以来都是溶菌酶生产所常用的方法，它是利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离的操作技术，具有简便、高效、成本低，且可自动化连续操作的优点，陕西科技大学的宋宏新等人采用弱酸性阳离子交换树脂(724树脂)动态交换洗脱纯化工艺对鸡蛋壳中的溶菌酶进行分离，具体工艺如下：分离过程中采取动态交换方法，即树脂装柱后抽提液缓慢流入柱中，用缓冲液洗涤，再用硫酸铵溶液洗脱。
结果表明724树脂的吸附率达到83．5％。
3.色谱技术色谱分离技术有多种类型，其中膜色谱技术是将液相色谱与膜分离结合起来的一种新技术，具有快速、高效、高选择性、易于放大的特点，能满足生物大分子高效分离与纯化的要求，它作为一种高效的分离纯化技术已受到人们的高度重视，广泛地应用于大分子物质的纯化。
工程菌人溶菌酶的纯化和性质
工程菌人溶菌酶的纯化和性质
叶军;钱世钧
【期刊名称】《微生物学报》
【年(卷),期】1999(039)001
【摘要】将人溶菌酶工程菌株在发酵培养、菌体经声破碎、变性和复性后所得的粗酶液经Ｅｘｐｒｅｓｓ－ＩｏｎＳ阳离子交换柱层析，得到电泳纯的酶，比活达到４８０００ｕ／ｍｇ。
一些重金属离子对酶的活性影响不尽相同，在０．０１ｍｏｌ／Ｌ的浓度下Ｃｕ＾２＋可使该酶完全失活。
【总页数】5页(P55-59)
【作者】叶军;钱世钧
【作者单位】中国科学院微生物研究所;中国科学院微生物研究所
【正文语种】中文
【中图分类】TQ925.9
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李成
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正常人尿中溶菌酶分离提纯研究
正常人尿中溶菌酶分离提纯研究
于方治
【期刊名称】《宁夏医科大学学报》
【年(卷),期】1982(000)001
【摘要】溶菌酶(lysozyme)在自然界分布较广。
因可作用于革兰氏阳性细菌的细
胞壁导致菌体溶解而得名。
近年来,其溶菌之外的其它生物学活性的研究屡见报道。
日本作者报道菌体经溶菌酶作用后的底物具有佐剂样免疫增强作用。
Klokars等氏发现人溶菌酶可显著刺激人白细胞的吞噬活性。
Osserman等氏报道体外实验中
观察到溶菌酶对病毒转化的鼠3T3细胞和人肝自发转化细胞有显著的逆转作用。
日本学者还把溶菌酶用于动物的实验
【总页数】1页(P10-10)
【作者】于方治
【作者单位】宁夏医学院附属医院肿瘤科
【正文语种】中文
【中图分类】R73
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＊“八五”国家科技攻关项目(No .85-722-05-02)收稿日期:1997-07-18,修回日期:1997-12-25工程菌人溶菌酶的纯化和性质＊叶 军 钱世钧(中国科学院微生物研究所 北京 100080)提 要 将人溶菌酶工程菌株在发酵培养、菌体经超声破碎、变性和复性后所得的粗酶液经Ex press -Ion S 阳离子交换柱层析,得到电泳纯的酶,比活达到48000u /mg 。
此酶的最适pH 为6.5;等电点为8.91;对溶壁微球菌的米氏常数K m =0.0311mg /m L ;60℃保温30min ,酶活力剩余48.3%。
N 末端氨基酸序列除了第一个M et ,其余4个与预期相符。
一些重金属离子对酶的活性影响不尽相同,在0.01mol /L 的浓度下Cu 2+可使该酶完全失活。
关键词 重组人溶菌酶,纯化,性质分类号 Q55 文献标识码A 文章编号 0001-6209(1999)01-0055-59 天然人溶菌酶主要存在于人奶、人胎盘和唾液等中,不易提取,且价格昂贵。
而通过人工合成基因,用微生物发酵法生产人溶菌酶将为其在食品、医药等方面的广泛应用提供有利条件。
本实验室已经成功地合成了人溶菌酶基因并构建重组质粒[1～2],在E .coli 中得到了高水平表达[3]。
本文在此基础上对该酶进行了纯化,得到SDS -PAGE 纯的酶,并对其性质作了一些研究。
1 材料和方法1.1 菌种工程菌株JBP -H LY ,由本课题组构建。
1.2 仪器和试剂Ex press -Ion S 阳离子交换剂、卵清溶菌酶、溶壁微球菌(M icrococcus lysodeikticus )均为Sigma 公司产品。
测定等电点的标准蛋白及电泳装置为Pharmacia 公司产品,Ampho -line 为LKB 公司产品。
其它试剂均为国产分析纯试剂。
1.3 菌体制备、粗酶液的提取及酶活性的测定方法见参考文献[3～4]。
1.4 人溶菌酶的纯化将粗酶液经冷冻干燥浓缩,对0.01moL /L ,pH5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液透析,再通过经上述缓冲液平衡的Express -Ion S 阳离子交换柱,用0～1moL /L NaCl 进行梯度洗脱。
收集活性部分的下柱液,用聚乙二醇反透析浓缩,利用SDS -PAGE 检查纯度。
1.5 蛋白含量和等电点测定蛋白含量用Folin -phenol 法测定[5]。
等电点测定参照文献[6]进行。
39卷 1期1999年2月微生物学报Acta Microbiologica SinicaVol .39February No .11999DOI :10.13343/j .cn ki .wsxb .1999.01.0092 结果2.1 酶的分离纯化按材料和方法所述进行分离纯化,洗脱曲线见图1,纯化结果见表1。
从结果可看出,收率为3.8%,纯度提高了12.9倍。
SDS -PAGE 检查结果见图2,为一单一泳带。
表1 工程菌人溶菌酶的纯化Table 1 Purification of Hu man lysozyme from engineered bacterium E .coli步 骤Steps 总活力/u Total act .总蛋白/mg Total pro .比活/(u /mL )S pec .act 纯化倍数Pur .fold 收率/%Act .rec .Crude enzyme 1.7×10549.534541.0100Express -Ion S9.1×1041.94800012.93.8图1 人溶菌酶纯化曲线Fig .1 Chromatography of the Humanl ysoz yme on Express -Ion S 1.A 280; 2.酶活Enzyme activity.图2 人溶酶酶的SDS -PAGEFig .2 SDS -PAGE of the Human lys ozyme 1.卵清溶菌酶Egg w hite lysozyme (14.3kD );2.人溶菌酶The Human lys ozyme (14.7kD ).2.2 酶的最适反应温度选取不同温度条件,测定纯酶活性,结果表明,酶的最适反应温度为45℃(图3)。
2.3 酶的最适反应pH选择不同缓冲液配制底物溶液,浓度为0.2mg /m L ,其它条件不变,测定酶活力。
结果见图4。
在磷酸缓冲液和磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中的最适反应pH 均为6.5,在Tris -HCl 缓冲液中的酶活性较其它缓冲液为高,最适反应pH 为8.0。
各种缓冲液所显示的最适反应pH 略有差别。
在一定范围内,该酶在Tris -HCl 和磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中对pH 敏感程度较差,而在磷酸缓冲液中对pH 敏感程度最大。
56微 生 物 学 报39卷图3 人溶菌酶反应最佳温度Fig.3 Optimum temp erature of the Humanlysozyme图4 人溶菌酶的最适反应pHFig.4 Optimum reaction pH of the Human lys ozymeN a2HPO4-citrate;2.N a2HPO4-NaH2PO4;3.Tris-HCl.2.4 酶的热稳定性将等量酶液分别置于不同温度下30min,冷却后于37℃按常规方法测酶活性,结果见图5。
酶在45℃以前稳定性较好,而在60℃加热30min,酶活剩余48.3%。
2.5 等电点测定利用聚丙烯酰胺凝胶电泳法,Ampholine的pH范围是3～10,测得此酶等电点为8.91。
2.6 N-末端氨基酸序列测定利用北京大学生命科学学院ABI491型蛋白测序仪测得酶的N-末端5个氨基酸依次为Met、Ly s、Val、Phe和Glu,除了Met外,其它氨基酸与人工合成DNA序列所预期的N-氨基酸顺序一致。
第一个Met是由于DNA序列中起始密码子ATG也被翻译所至。
2.7 酶的米氏常数以Microc occus lysodeikticus为酶的底物,分别配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/m L的浓度,测定酶活力,用双倒数法作图(图6),得到K m=0.0311mg/m L。
2.8 金属离子对酶活性的影响选取不同金属离子分别加入酶溶液,终浓度为0.01moL/L时测定酶活力,结果见表2。
结果表明,以上各种离子都对酶活力有影响,其中Cu2+最显著,酶活力全部丧失。
表2 一些金属离子对人溶菌酶的影响Tab le2 The effects of some ions on the Hu man lysozyme离子Ion No ion Cu2+Fe3+Zn2+Cd2+Co+Hg2+Ni+M n2+Ca2+相对活力/% Re.act.100035.742.547.571.475.078.678.680.0571期叶 军等:工程菌人溶菌酶的纯化和性质图5 人溶菌酶的热稳定性Fig .5 T hermostability fo the humanlysozyme图6 双倒数法测人溶菌酶的米氏常数Fig .6 Lin eweaver -B urk plot of the H uman l ysoz yme3 讨论在工程菌JPB -Hly 表达的人溶菌酶以不溶性的、没有生物活性包涵体形式积累,这对于获取有活性的酶带来不少困难,但对酶的纯化却是非常有利的。
在包涵体的变性、复性过程中去除了很多杂蛋白,所以经一步离子交换层析即得到电泳纯的人溶菌酶,纯化步骤很简单。
我们曾利用凝胶过滤,但效果不如离子交换层析。
因为凝胶过滤的上柱体积要求很小,而粗酶液的体积达300～400mL ,不易浓缩。
天然人奶溶菌酶的最适pH 为6.35[7],与基因工程人溶菌酶(以下简称工程酶)十分接近。
该工程酶的热稳定性较鸡卵清溶菌酶和天然人溶菌酶差。
从结构上和焓值■H 的分析[8]表明,人溶菌酶的热稳定性高于鸡卵清溶菌酶。
而工程酶系从包涵体经变性、复性而来,蛋白质重折叠后的构象可能与天然的人溶菌酶有一定差异,对酶活性区域无影响,而对其热稳定性产生影响。
不同的金属离子对工程酶的活力影响各不相同。
Cu 2+浓度为0.01mol /L 即可使该酶完全失活;而相同浓度的Ca 2+、Ni +、M n 2+对酶活力的影响远远小于Cu 2+。
Cu 2+对该酶影响很大,有文献报道Cu 2+可在100℃pH7时催化自由硫氢基的氧化,引起溶菌酶分子间、分子内二硫键的改变[9],使酶不能维持稳定的构象,从而丧失活性。
参 考 文 献[1] 钱世钧,于 颖,田开荣等.生物工程学报,1994,10(1):34～38.[2] 矫庆华,钱世钧,叶 军等.生物工程学报,1997,13(1):111～113.[3] 郭良栋,钱世钧,叶 军等.微生物学报,1997,37(1):53～57.[4] 钱世钧,陈 欣,叶 军等.生物工程学报,1996,12(增刊):266～268.[5] Low ry O H ,Rousebrough N J ,Farr A L et al .J Biol Chem ,1951,193:265～275.[6] 张树政,孟广震,何忠效主编.酶学研究技术.北京:科学出版社,1987.187～194.[7] Parry R M ,C handan R C ,S hanani K M et al .Arch B i ochem Biophys ,1969,103:59～65.[8] Barel A O ,Prieels J P ,M aes E et al .Biochem Biophys Acta ,1972,257:288～296.[9] Tomizaw a H ,Yamada H ,Tanigawa K et al .J Biochem ,1995,117(2):369～373.58微 生 物 学 报39卷＊Project of Chinese National Program s for Science and Technology Develop ment (No .85-722-05-02)PURIFICATION AND PROPERTIES OF HUMAN LYS OZYMEIN ENGINEERED BACTERIUM E .COLI＊Ye Jun Qian Shijun(Ins titute of Micro biol og y ,Chin ese Academy of Sciences ,Beijing 100080)Abstract To obtain the SDS -PAGE -pure human lysozyme ,the crude enzyme of engineered bacteri -um E .coli was purified by chromatography on cation ionexchange of Express -Ion S .The optimum reaction temperature and pH of this lysozyme were 45℃and 6.5,respectively .The isoelectric point is pH 8.91,and K m of the enzyme for Microc occus lysodeikticus is 0.0311mg /mL .T he thermal sta -bility of t he engineered enzyme is more sensible than hen egg white lysozyme and human milk lysozyme .The sequence of 5amino acids in N -end is same as designed ,except an M et at the first .The affects of some metal ion on this enzyme were shown .Cu 2+of 0.01mmol /L c ound completely inactivate the enzyme .Key words Recombinant Human lysozyme ,Purification ,Properties591期叶 军等:工程菌人溶菌酶的纯化和性质。