寡核酸探针
反义寡核苷酸探针
反义寡核苷酸探针反义寡核苷酸探针：在基因研究和诊断中的应用摘要：反义寡核苷酸探针是一种重要的分子生物学工具，广泛应用于基因研究和临床诊断中。
本文将介绍反义寡核苷酸探针的定义、原理、制备方法及其在基因研究和诊断中的应用，并讨论其优缺点以及未来发展方向。
引言：反义寡核苷酸探针是一种特异性高、灵敏度好的分子生物学工具，在基因研究和诊断领域中得到广泛应用。
它通过与目标基因序列互补配对，具有高度特异性，可以检测特定的基因突变、基因扩增和基因表达水平等。
在基因研究和临床诊断中发挥着重要作用。
一、反义寡核苷酸探针的定义和原理反义寡核苷酸探针是一种寡聚核苷酸序列，与目标序列互补配对，通常长度为15-30个碱基。
根据扩增特异性的要求，可以设计用于引物延伸、PCR、测序等各种基因研究和诊断方法中。
反义寡核苷酸探针的原理是通过与目标序列互补配对，形成稳定的双链结构，并使用荧光或放射标记等方式进行检测。
二、反义寡核苷酸探针的制备方法1. 化学合成法：利用化学合成的方法，通过固相合成技术制备反义寡核苷酸探针。
这种方法可以精确控制探针序列和长度，并可以在探针上引入荧光分子或标记物。
2. 酶法合成：通过利用DNA聚合酶合成反义寡核苷酸探针，该方法具有高效、经济等优点，但对于较长的探针序列，需要考虑到合成效率和错误率等因素。
三、反义寡核苷酸探针在基因研究中的应用1. 基因突变检测：反义寡核苷酸探针可以帮助检测基因突变，如单核苷酸多态性（SNP），缺失、插入或替换等突变。
2. 基因表达水平检测：通过对特定基因序列进行反义寡核苷酸探针的设计，可以检测该基因在不同组织或疾病样本中的表达水平，从而探究其在生物学、疾病发生发展中的作用。
3. 基因扩增和测序：在PCR扩增和测序中，反义寡核苷酸探针可用作引物，参与扩增过程，放大目标序列，并为测序提供可靠的检测信号。
四、反义寡核苷酸探针在临床诊断中的应用1. 遗传疾病的检测：反义寡核苷酸探针可用于遗传性疾病的检测，包括染色体异常、基因突变等。
寡核苷酸序列
寡核苷酸序列寡核苷酸是一种由少于20个核苷酸分子组成的小分子。
它们可以被用于多种生物学应用，例如制备基因探针、扩增特定DNA序列等。
在研究中，寡核苷酸也可以用作基于序列的检测方法，在诸如基因组测序和突变检测等领域中具有重要的应用价值。
因此，对于寡核苷酸序列有一个深入的了解显得至关重要。
本文将深入探讨寡核苷酸序列及其相关知识。
1. 寡核苷酸的结构与命名寡核苷酸由少于20个核苷酸单元组成，每个碱基单元包含一个含氮碱基和一个脱氧核糖分子。
根据脱氧核糖与含氮碱基的结合方式不同，它们可以被进一步分为两类：核苷酸和核苷酸酰胺。
核苷酸由一个含氮碱基、一个脱氧核糖和一个磷酸基团组成，而核苷酸酰胺则缺少磷酸基团。
寡核苷酸的命名方法和DNA和RNA相同。
例如，5'-ATCGCTCCA-3'是一个由9个核苷酸单元组成的DNA寡核苷酸，其中5'和3'末端表示脱氧核糖分子的两个端点。
2.1 寡核苷酸作为探针主要使用寡核苷酸的应用之一是作为基因探针。
寡核苷酸可以与DNA序列的互补链结合并标记荧光标记，以便研究者可以追踪DNA的存在。
这是许多应用中所需的，例如应用于基因组测序、检测特定DNA序列的技术、核酸杂交检测等。
这些技术都可以使用寡核苷酸做为探针的基础。
除了用作探针之外，寡核苷酸还可以作为特异性代理用于调节基因表达。
这种方法被称为小分子RNA疗法，通常是通过抑制靶基因的表达来治疗疾病。
小分子RNA是一类非编码RNA，长度通常小于22个核苷酸。
当小分子RNA与靶基因的mRNA互补时，它可以将靶基因的mRNA降解，从而抑制该基因的表达。
总之，寡核苷酸作为基因探针和小分子RNA都有着非常广泛的应用前景。
在不断地研究和开发中，相信它们将会有越来越多的重大发现和应用。
化学合成的寡核苷酸用途
化学合成的寡核苷酸用途寡核苷酸（Oligonucleotide）是由短链的核苷酸组成的生化分子，由2-20个核苷酸单体组成。
寡核苷酸具有广泛的用途，特别是在分子生物学、遗传学和生物医学领域。
下面将就其用途展开阐述。
1.基因表达调控：寡核苷酸可通过与mRNA结合形成双链结构，从而干扰或抑制蛋白质的合成。
通过设计目标基因序列特异的寡核苷酸，可以实现对特定基因的靶向调控，如沉默基因表达、促进或抑制基因转录等。
2. 诊断和检测：寡核苷酸可以作为靶向探针用于检测和诊断病原体或疾病相关的基因变异。
例如，寡核苷酸可以用于PCR扩增、基因测序、限制性片段长度多态性（RFLP）和串联多重引物放大技术（Multiple某Ligation-dependent Probe Amplification，MLPA）等。
3. 基因敲下（knockdown）：基因敲除是一种利用RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术将寡核苷酸引入细胞中，从而靶向抑制特定基因表达的方法。
通过合成特异性序列的寡核苷酸，可以选择性地降低目标基因的表达水平，从而研究其功能和生物学过程。
4.新药研发：寡核苷酸技术在药物研发领域有广泛应用。
寡核苷酸可以用于研究新型药物的靶向治疗作用，例如抗菌药物、抗病毒药物和抗癌药物等。
此外，寡核苷酸还可以用于改善药物递送系统，提高药物的有效性和选择性。
5.个性化治疗：随着精准医学的发展，寡核苷酸技术在个性化治疗中的应用也越来越重要。
通过对患者基因组进行测序分析，可以精确诊断患者的疾病，设计特异性寡核苷酸进行靶向治疗。
这种个性化治疗可以提高治疗效果，减少不良反应和副作用，为患者带来更好的治疗效果。
总之，寡核苷酸具有广泛的应用领域，其在分子生物学、遗传学和生物医学研究中的作用机制和方法都在不断发展与完善。
寡核苷酸技术的不断更新和突破将为未来的科学研究和医学进步提供更多的可能性和机会。
核酸探针技术及应用
核酸探针技术及应用基因检测技术的发展，使对某些疾病的诊断达到了特异性强、敏感性高及简便快速的目的。
近年来各种血清学方法发展很快，但血清学方法主要是测抗体，是间接的证据随着分子生物学的发展，应用DNA—DNA杂交建立了核酸探针(Probe)技术，该技术是目前基因检测最常用的方法，目前已成为诊断各种感染性疾病，恶性肿瘤，遗传病，检测抗生紊的耐药性，法医学鉴定及从分子水平上研究发病机制与流行病学规律等方面的一种重要手段。
本文主要介绍了核酸探针技术的原理，核酸分子杂交方法及核酸探针的应用等方面。
一、核酸探针技术的原理DNA 或RNA 片段能识别特定序列基因的DNA 片段，能与互补的核苷酸序列特异结合，这种用同位素非同位素标记的单链DNA片段即为核酸探针。
核酸探针技术是将双链DNA 经加热或硷处理，使硷基对间的氢链被破坏而变性，解开成两条互补的单链。
它们在一定温度和中性盐溶液条件下，又可按A—T，G—C碱基配对的原则重新组合成双链为复性。
这种重组合只是在两股DNA是互补(同源)或部分互补(部分同源)的条件下才能实现。
正是由于双链DNA的这种可解离与重组合的性质，才可用一条已知的单链DNA，用放射性同位素或其他方法标记后制备成核酸探针，与另一条固定在硝酸纤维素滤膜上的变性单链DNA进行杂交，(另一条DNA链与核酸探针是配对碱基，称为靶)再用放射自显影或其他显色技术检测，以确定有无与探针DNA (或RNA)同源或部分同源的DNA(或RNA)存在。
因为探针只与靶病原体的DNA或RNA杂交，而不与标本中存在的其他DNA 或RNA 杂交。
二、核酸探针技术的基本方法被检标本用去污剂和酶分解以去除非DNA成分或直接提取DNA，用各种方法处理DNA使其变性，把DNA双螺旋的两条链分开，单链DNA结合于固态基质上，(如滤膜)使其固定。
再加上已制备好的探针进行杂交，探针便可找出已固定的DNA中的互补序列，与之配对结合，然后洗掉未结合部分，由于探针已将放射性同位素掺入，再用x射线敏感的胶片自显影，见黑色影印者即为阳性。
染料法和探针法荧光定量PCR(RT-qPCR)的优缺点比较
染料法和探针法荧光定量PCR（RT-qPCR）的优缺点比较一、荧光染料法(SYBR Green)其原理是：在PCR反应体系中加入过量荧光染料，DNA扩增的过程中，荧光染料特异性地掺入DNA双链，发射荧光信号，随着反应的进行，荧光强度逐渐增强，并且可以实时测量。
如果你要扩增你的目标样品40个循环，在最后一个循环结束时检测到的荧光会比在第10个循环测得的荧光强很多。
优点：1、成本较低，适合大规模的实验。
2、在实验设计阶段非常省时，因为它只需要合适的引物设计。
缺点：1、特异性不是很高。
染料可以插入任何双链DNA，包括引物二聚物和非特异性产物。
2、如果引物二聚体存在或者产物受到污染，得到的结果会不可靠。
3、更容易与低丰度的目标产生非特异性荧光。
需要更多的时间进行结果分析。
二、寡核苷酸探针(Taqman)这种方法涉及使用荧光标记的寡核苷酸(短DNA分子)，探针通常在5 端和3 端都被标记。
在探针的5’端有报告基团，3’端设计淬灭基团，当报告基团接近淬灭基团时，不会检测到荧光信号。
RT-qPCR反应时，寡核苷酸两个基团分离，即可检测到荧光信号，并与PCR产物同步。
使用这种方法的荧光检测依赖于两个过程:1)引物与目标序列的结合(2)探针与引物下游互补序列的结合。
优点：1、更有可能只放大所需的产物，由于引物和探针的结合具有特异性。
2、不需要解离曲线，只有探针与正确的目的序列结合时才能检测到荧光。
3、由于具有特异性，数据更可靠。
4、数据分析时节省时间。
缺点：1、需要大规模实验时耗费成本高。
2、需要更长的时间来设计实验，因为需要好的引物和探针。
总的来说，这两种荧光检测方法都很有效，但对于你的具体实验，可以选择适合的方法。
原位杂交探针设计原则
原位杂交探针大体可分为三类：寡核苷酸探针，CDNA探针，RNA探针。
寡核苷酸探针由25bp左右的核苷酸组成，通常可以由公司合成，由于其序列较短，因此特异性较强，原位杂交时可以区分家族基因，同一基因的不同剪切体，cDNA探针长约500bp左右，可以通过非对称PCR扩增合成，由于探针式DNA，可以有效的避免降解，但DNA和RNA的结合不如RNA与RNA结合强，通常不采用，RNA探针长约500bp左右，通过体外转录合成，如果设计合理，其特异性是可以得到保证的，其主要缺点是容易被RNAse酶降解。
查看原位杂交相关的文献发现，2000年以前的原位杂交常使用放射性标记的寡核苷酸探针，通过胶片曝光来显色，2000年以后的文献常使用RNA探针。
许多肾脏发育的文献虽然有很多原位杂交数据，但却没有附带上探针序列或者用于探针模板克隆的引物，通过了解厦门黄老师斑马鱼和昆明毛炳宇爪蟾中原位杂交探针设计方法，我们可以采用RNA探针。
文献中很难找到关于RNA探针设计的原则，有的文献报道直接用cDNA合成RNA探针。
借鉴爪蟾中原位杂交探针设计流程，以小鼠FGF10的探针设计为例进行介绍。
1.在NCBI数据库中下载该FGF10的mRNA全序列，然后用FGF10的全长在NCBI中进行BLAST 比对分析，比对数据库选择mouse genome+transcript，比对程序选择somewhat similarsequenee 。
Zebrafish seqRNAsChoose Search SetO Human genomic 卑transcript @Mouse genom c ■+ trans匚「ipt O Others (nr etc.)Manse genomic plus hanscript Mcuss G+TPrcarain SelectionOpiimire for0 Highly similar sequences i mega blast)0 More dissi milar sequences [discontiguous meg ablaut)® Somev/hat similar sequences iblastn)Choose a BLAST algorithm ■&得出的比对结果中有一幅图谱，显示比对序列与数据库中序列的相似性，探针应设计在与其它基因不存在明显相似性的区段，在比对结果的图谱中选择可变区。
等位基因特异的寡核苷酸
等位基因特异的寡核苷酸等位基因特异的寡核苷酸（allele-specific oligonucleotides）是一种用于基因分型和检测单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNPs）的分子探针。
这种探针具有高度的特异性，可以区分不同等位基因的差异，因此在生命科学研究和临床诊断中有广泛的应用。
等位基因特异的寡核苷酸主要用于基因分型。
基因分型是指确定个体在某个基因位点上拥有哪种等位基因的过程。
等位基因特异的寡核苷酸探针通过与特定的等位基因序列匹配，只能特异性地杂交并扩增对应的DNA片段。
这样，我们就可以在PCR扩增产物中检测到不同等位基因的存在与否，从而确定个体的基因型。
比如，对于一个SNP位点，如果我们用两个具有不同等位基因的寡核苷酸分别作为引物，进行PCR扩增后的产物是可以区分两个等位基因的。
除了基因分型，等位基因特异的寡核苷酸还可以用于评估基因表达的异质性。
由于基因表达受多种因素的调节，不同等位基因的基因表达也有可能存在差异。
因此，我们可以利用等位基因特异的寡核苷酸探针，检测特定等位基因的表达水平，并评估不同等位基因表达的差异性。
这种方法已经在研究人类、动物和植物等领域中得到广泛的应用。
除了以上两个应用，等位基因特异的寡核苷酸还可以用于检测病原体和捕捉人工合成DNA。
由于病原体和人工合成DNA序列中通常存在特异性的序列变异，我们可以利用等位基因特异的寡核苷酸探针，设计特异性的PCR引物，从而实现病毒和人工合成DNA的快速、特异性检测。
总之，等位基因特异的寡核苷酸是一种广泛应用于基因分型、基因表达分析和病原体检测等分子探针。
它具有高度的特异性和灵敏性，可以方便快捷地检测生物样本中的等位基因差异和病原体的存在，对于生命科学研究和临床诊断具有非常重要的意义。
taqman探针原理
taqman探针原理TaqMan探针原理。
TaqMan探针是一种广泛应用于分子生物学领域的核酸检测技术，它以其高度特异性和灵敏度在基因表达分析、基因突变检测、病毒核酸检测等方面发挥着重要作用。
TaqMan探针的原理基于荧光共振能量转移技术，下面我们将详细介绍TaqMan探针的工作原理。
TaqMan探针是一种双标记的寡核苷酸探针，包括一个荧光素和一个荧光淬灭素。
在PCR扩增过程中，TaqMan探针与待检测的靶标DNA序列特异性结合，当Taq聚合酶在扩增过程中到达TaqMan探针的结合位点时，它会具有3'→5'外切酶活性，开始在探针的5'端和3'端之间的靶标DNA序列上进行切割。
这导致荧光素和荧光淬灭素被分离，从而释放出荧光信号。
PCR扩增过程中，每一个TaqMan探针都会释放出荧光信号，而这些信号的累积可以被检测仪器实时监测到。
TaqMan探针的工作原理可以简单概括为“切割-释放-检测”。
在PCR扩增的每一个循环中，TaqMan探针都会与靶标DNA序列结合并被Taq聚合酶切割，释放出荧光信号。
通过实时监测这些荧光信号的累积，可以准确地确定靶标DNA序列的存在与数量。
TaqMan探针的工作原理使得它在核酸检测中具有很高的特异性和灵敏度。
首先，TaqMan探针与靶标DNA序列的特异性结合确保了检测结果的准确性，不会受到非特异性扩增的干扰。
其次，TaqMan探针释放的荧光信号可以实时监测到，使得检测结果可以在PCR扩增过程中得到，大大缩短了实验周期。
此外，TaqMan探针还可以同时检测多个靶标DNA序列，适用于复杂样品的分析。
除了在科研领域的应用，TaqMan探针在临床诊断、食品安全监测、环境污染检测等领域也发挥着重要作用。
例如，在临床诊断中，TaqMan探针可以用于检测病原微生物的核酸，帮助医生准确诊断疾病。
在食品安全监测中，TaqMan探针可以用于检测食品中的致病微生物，确保食品安全。
核酸探针的种类
核酸探针的种类基因探针根据标记方法不同可粗分为放射性探针和非放射性探针两大类，根据探针的核酸性质不同又可分为DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针及寡核苷酸探针等几类，DNA探针还有单链和双链之分。
下面分别介绍这几种探针。
(一)DNA探针DNA探针是最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。
现已获得DNA探针数量很多，有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针。
这类探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。
这些DNA片段须是特异的，如细菌的毒力因子基因探针和人类Alu探针。
这些DNA探针的获得有赖于分子克隆技术的发展和应用。
以细菌为例，目前分子杂交技术用于细菌的分类和菌种鉴定比之G+C百分比值要准确的多，是细菌分类学的一个发展方向。
加之分子杂交技术的高敏感性，分子杂交在临床微生物诊断上具有广阔的前景。
细菌的基因组大小约5×106bp，约含3000个基因。
各种细菌之间绝大部分DNA是相同的，要获得某细菌特异的核酸探针，通常要采取建立细菌基因组DNA文库的办法，即将细菌DNA切成小片段后分别克隆得到包含基因组的全信息的克隆库。
然后用多种其它菌种的DNA作探针来筛选，产生杂交信号的克隆被剔除，最后剩下的不与任何其它细菌杂交的克隆则可能含有该细菌特异性DNA片段。
将此重组质粒标记后作探针进一步鉴定，亦可经DNA序列分析鉴定其基因来源和功能。
因此要得到一种特异性DNA探针，常常是比较繁琐的。
探针DNA克隆的筛选也可采用血清学方法，所不同的是所建DNA文库为可表达性，克隆菌落或噬斑经裂解后释放出表达抗原，然后用来源细菌的多克隆抗血清筛选阳性克隆，所得到多个阳性克隆再经其它细菌的抗血清筛选，最后只与本细菌抗血清反应的表达克隆即含有此细菌的特异性基因片段，它所编码的蛋白是该菌种所特有的。
用这种表达文库筛选得到的显然只是特定基因探针。
对于基因探针的克隆尚有更快捷的途径。
寡核苷酸探针荧光原位杂交操作流程-细胞爬片
寡核苷酸探针原位杂交操作流程-细胞爬片一、材料准备：1.细胞爬片:细胞爬片经固定液-4%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.0-7.6），含有1/1000 DEPC，固定15min。
经无水乙醇、95%、85%和75%乙醇各2min脱水。
2.探针: 多聚寡核苷酸探针-FITC 2ug/ml二、 FISH操作流程1.暴露mRNA 核酸片段：细胞爬片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（1ml 3% 柠檬酸加2 滴浓缩型胃蛋白酶，混匀），37℃消化5 分钟。
2.原位杂交用PBS 洗3 次×5 分钟。
蒸馏水洗1 次。
3.无水乙醇、95%、85%和75%乙醇各2min脱水。
4.预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20-30%甲酰胺150ml 以保持湿度。
按每张爬片滴加20μl预杂交液。
恒温箱37℃ 2小时。
吸取多余液体，不洗。
5.杂交:按每张切片20μι杂交液(内含寡核苷酸探针-FITC,2.0ug/ml)，加在切片上。
将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。
如检测细胞爬片内的DNA需85-95℃变性6-8min；如检测细胞爬片内的RNA则无需变性。
6.恒温箱37℃杂交过夜(16h)。
7.杂交后洗涤:揭掉盖玻片，37℃水温的2×SSC 洗涤5 分钟×2 次；37℃ 0.5×SSC 洗涤15 分钟×1 次; 37℃0.2×SSC 洗涤15 分钟×1 次。
或75℃, 0.3XSSC洗5-8min。
8.PBS洗2*3min。
9.用内含0.001%DAPI缓中甘油封片,-20℃保存备用。
1。
核酸检测探针法
核酸检测探针法
核酸检测探针法是一种分子生物学技术，用于检测DNA或RNA序列中的特定序列。
该技术基于DNA或RNA序列的互补配对原理，通过引入特定的探针来检测目标序列。
探针通常由一条能够与目标序列互补配对的寡核苷酸链和一种荧光素或荧光染料组成。
当探针与目标序列配对时，荧光素或荧光染料会被激发并发出荧光信号，从而表明目标序列存在。
核酸检测探针法被广泛应用于疾病诊断、基因表达分析和病原体检测等领域。
例如，在新型冠状病毒疫情期间，核酸检测探针法被用于检测病毒的存在，以便进行疫情监测和诊断。
与传统的检测方法相比，核酸检测探针法具有灵敏度高、特异性强、操作简便、快速和自动化等优点。
然而，该技术也存在一些局限性，如需要特定的设备和试剂、样本处理要求高和可能存在假阳性或假阴性结果等。
因此，在使用该技术时需要结合具体的实验设计和严格的质量控制措施，以确保结果的准确性和可靠性。
- 1 -。
aso探针杂交原理
aso探针杂交原理
ASO（Allele-Specific Oligonucleotide）探针杂交原理是一种用于检测特定基因突变的分子生物学技木。
ASO探针是一种短的寡核苷酸序列，其序列与目标基因的突变位点相匹配。
ASO探针杂交原理利用了DNA双链的亲和性，即只有在完全互补的情况下，ASO 探针才能与目标DNA序列杂交结合。
在实验中，首先要设计ASO探针，确保其与目标基因突变位点完全互补。
然后，将待测样品DNA进行变性处理，使其变为单链状态，接着将ASO探针与待测样品DNA进行杂交反应。
如果样品中存在与ASO探针互补的突变位点，ASO探针将与之结合形成稳定的双链结构；反之，如果样品中不存在该突变，则ASO探针无法结合。
最后，通过不同的检测方法（如凝胶电泳、比色反应等）来检测ASO探针与待测样品DNA的结合情况，从而判断目标基因是否存在突变。
ASO探针杂交原理的优点在于其高度特异性和敏感性，能够准确检测单核苷酸多态性（SNP）等微小的基因突变。
然而，其缺点在于需要事先知道待测样品中可能存在的突变位点，并且需要针对每个突变设计特定的ASO探针，因此在大规模筛查中的应用受到一定
的限制。
总的来说，ASO探针杂交原理在分子诊断和基因突变筛查中具有重要的应用价值。
基因的克隆、表达、检测原理步骤
应用于植物病原检测的实时荧光定量PCR张艳杰植物病理学20131130029摘要：实时荧光定量PCR技术是这些年兴起的可以定量DNA的新技术，广泛应用于植物病原检测、转基因检测、信号转导、植物抗病检测、微生物指标等；本文综述了实时荧光定量PCR技术的原理及其在植物病原菌检测中的应用。
关键词：实时荧光定量PCR 探针分子信标病原检测植物病害诊断和病原检测对病害防治具有重要意义，只有明确了病原的种类及侵染时期，才能制定合理的防治策略，控制损失，而在病害发生前进行病害的早期诊断，能够实现病害的早期预防和防治，从而采用及时的防治办法，更好地控制病害的发生。
传统的检测方法有平板稀释法、酶联免疫法、传统PCR等，一般不能实现早期检测，而且大多只能进行定性检测。
而近些年发展起来的实时荧光定量检测技术，不仅可以进行定性，还可以进行定量，可以实现在病害未显症时的早期微量检测。
实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
该技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，该技术与常规PCR相比，具有许多优点[1]：第一，操作简便，有较高的敏感性及快速高效；第二，由于扩增在封闭体系中完成并对其进行实时测定，因此降低了污染的可能性。
第三，既可做定量分析，又可做定性分析；第四，可进行多重扩增，即通过不同的引物设计在同一反应体系中，同时对多个靶基因分子进行扩增；第五，可以在较大浓度范围内（＞107倍）进行定量。
Miguel Montes-Borrego[2]等检测了感染霜霉病的Papaver somniferum在未显症时期，霜霉病菌（Peronospora arborescens）的含量，结果确定，采用实时定量PCR的检测精度为病原体生物量0.110-5557ppm。
Suren K. Samuelian[3]等采用实时定量PCR检测葡萄上Greeneria uvicola和Colletotrichum acutatum的存在，实现了基因组DNA 20fg和10个孢子的检测精度。
(ASO探针)
人们找到6000多种抗生素 广泛应用的抗生素大约200种
全世界每年抗生素产量超过1.0X108kg
产值约100亿美元
3、抗生素的分类
分类方法 抗生素种类
①放线菌产生的抗生素 ②真菌产生的抗生素 ③细菌产生的抗生素 ④植物或动物产生的抗生素
①广谱抗生素 ②抗细菌抗生素 ③抗真菌抗生素 ④抗病毒抗生素 ⑤抗肿瘤抗生素
细菌的抗药性
自然条件下抗药性基因频率低的原因: 细菌抗药性频率增加的原因：
细菌产生抗药性的原因：
抗生素的作用机制
5、菌群失调和毒副作用
正常菌群： 正常菌群的作用： 正常菌群与人体的关系： 滥用抗生素的后果： 举例说明抗生素的毒副作用
抗生素的不良反应
副作用如恶心和呕吐 毒性反应如肝、肾及其它器官损害
基因诊断的应用
感染性疾病的病原诊断
结核病、柯萨奇B3病毒感染的心肌炎、乙型肝炎病毒 （HBV）、丙型肝炎病毒（HCV），爱滋病等
各种肿瘤的生物学特性的判断
遗传病的基因异常分析（包括产前诊断） 器官移植组织配型
法医学中个体识别、亲子鉴定
探讨个人基因信息隐私权的保护：
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第一章 生物科学与健康
后遗反应如链霉素引起永久性耳聋
过敏反应如青霉素引起过敏性休克 药物相互作用引起不良反应 二重感染（病菌抗药性产生）***
6、合理使用抗生素
不自行购买。抗生素是处方药 不主动要求。抗生素是用来对付细菌的， 所以要在确定细菌感染时才有疗效。有90 ％的感冒都不是细菌感染，抗生素并不能 加速复原，不必主动向医师要求开抗生素 不随便停药。抗生素治疗有一定疗程，一 旦需要使用抗生素来治疗，就要按时服药 ，直到药物吃完为止，以维持药物在身体 里的足够浓度，以免制造出抗药性细菌而 让它伺机而起
核酸探针的种类
核酸探针的种类基因探针根据标记方法不同可粗分为放射性探针和非放射性探针两大类，根据探针的核酸性质不同又可分为DNA探针，RNA探针，cDNA探针，cRNA探针及寡核苷酸探针等几类，DNA探针还有单链和双链之分。
下面分别介绍这几种探针。
（一）DNA探针DNA探针是最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。
现已获得DNA探针数量很多，有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针。
这类探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。
这些DNA片段须是特异的，如细菌的毒力因子基因探针和人类Alu探针。
这些DNA探针的获得有赖于分子克隆技术的发展和应用。
以细菌为例，目前分子杂交技术用于细菌的分类和菌种鉴定比之G+C百分比值要准确的多，是细菌分类学的一个发展方向。
加之分子杂交技术的高敏感性，分子杂交在临床微生物诊断上具有广阔的前景。
细菌的基因组大小约5×106bp，约含3000个基因。
各种细菌之间绝大部分DNA是相同的，要获得某细菌特异的核酸探针，通常要采取建立细菌基因组DNA文库的办法，即将细菌DNA切成小片段后分别克隆得到包含基因组的全信息的克隆库。
然后用多种其它菌种的DNA作探针来筛选，产生杂交信号的克隆被剔除，最后剩下的不与任何其它细菌杂交的克隆则可能含有该细菌特异性DNA片段。
将此重组质粒标记后作探针进一步鉴定，亦可经DNA序列分析鉴定其基因来源和功能。
因此要得到一种特异性DNA探针，常常是比较繁琐的。
探针DNA克隆的筛选也可采用血清学方法，所不同的是所建DNA文库为可表达性，克隆菌落或噬斑经裂解后释放出表达抗原，然后用来源细菌的多克隆抗血清筛选阳性克隆，所得到多个阳性克隆再经其它细菌的抗血清筛选，最后只与本细菌抗血清反应的表达克隆即含有此细菌的特异性基因片段，它所编码的蛋白是该菌种所特有的。
用这种表达文库筛选得到的显然只是特定基因探针。
对于基因探针的克隆尚有更快捷的途径。
taqman探针原理
3min，但为了结 95℃ 5 min；（可以 果稳定性，最好5min。）
95℃ 5 s ， 58℃ 10 s ， 72℃ 10s ； 72℃ 25s ； 25℃ 1s 。
32个循环
纳米taq配制的mix， 扩PPARa定量
pcr扩增时taq酶的5?3?外切酶活性将探针酶切降解使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离从而荧光监测系统可接收到荧光信号即每扩增一条dna链就有一个荧光分子形成实现了荧光信号的累积与pcr产物形成完全同步
是RNA探针。TaqMan 荧光探针是一种寡核苷酸探 针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂则在 3’末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一 个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射 的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶 的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光 基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接 收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧 光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形 成完全同步。常用的荧光基团是FAM，TET，VIC， HEX。 而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进 行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有 望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。
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寡核酸探针
一般情况下，只要有克隆的探针，就不用寡核苷酸探针。
在DNA序列未知而必须首先进行克隆以便绘制酶谱和测序时，也常应用克隆。
克隆探针一般较寡核苷酸探针特异性强，复杂度也高，从统计学角度而言，较长的序列随机碰撞互补序列的机会较短序列少，克隆探针的另一优点是，可获得较强的杂交信号，因为克隆探针较寡核苷酸探针掺入的可检测标记基因更多。
但是，较长的探针对于靶序列变异的识别能力又有所降低。
对于仅是单个碱基或少数碱基不同的两序列，克隆探针不能区分，往往杂交信号相当。
这既是其优点，又是其缺点。
优点是当用于检测病原微生物时，不会因病毒或细菌DNA的少许变异而漏诊，缺点则是不能用于点突变的检测。
这种情况下，通常要采用化学合成的寡核苷酸探针。
合成的寡核苷酸探针具有一些独特的优点：①由于链短，其序列复杂度低，分子量小，所以和等量靶位点完全杂交的时间比克隆探针短，如20nt的寡核苷酸探针在浓度为
100ng/ml，靶序列为1～100pg、1kb片段或3×10-18~3×10-16mol/L时，达到最大程度的杂交只需10min，而用2kb的克隆探针在同样条件下达到完全杂交则需16h。
②寡核苷酸探针可识别靶序列内1个碱基的变化，因为短探针中碱基的错配能大幅度地降低杂交体的Tm 值。
③一次可大量合成寡核苷酸探针（1～10mg），使得这种探针价格低廉，与克隆探针一样，寡核苷酸探针能够用酶学或化学方法修饰以进行非放射性标记物的标记。
尽管克隆探针较特异，但通过细心筛选序列和/或选择相对长的序列（＞30nt）亦可设计出非常特异的寡核苷酸探针。
最常用的寡核苷酸探针有18～40个碱基，目前的合成仪可有效地合成至少50个碱基的探针。
下面是筛选寡核苷酸针的一些原则。
①长18～50nt，较长探针杂交时间较长，合成量低；较短探针特异性会差些。
②碱基成分：G+C含量为40%～60%，超出此范围则会增加非特异杂交。
③探针分子内不应存在互补区，否则会出现抑制探针杂交的“发夹”状结构。
④避免单一碱基的重复出现（不能多于4个），如-CCCCC-。
⑤一旦选定某一序更符合上述标准，最好将序列与核酸库中核酸序列比较，探针序列应与含靶序列的核酸杂交，而与非靶区域的同源性不能超过70%或有连续8个或更多的碱基的同源，否则，该探针不能用。
按上述原则选出的探针会增加成功的机会，选定后进行合成与标记，并摸索合适的杂交条件。
方法是制备几张点有特异靶DNA和不相关DNA的膜，各膜分别在不同温度下与探针杂交，特异靶DNA杂交信号强而非特异DNA不产生任何杂交反应的就是最适杂交温度。
在进行点突变检测杂交的反应时，洗膜条件和温度物选择往往更为重要。
所选漂洗条件必需使野生型靶DNA与探针产生强的杂交信号而突变型靶DNA则不产生杂交信号，这可以通过逐渐提高洗膜温度来完成。
寡核苷酸探针还有一个重要用途。
在用于检测单个碱基差异时尚可采用一种称为寡核苷酸限制（oligonucleotide restriction）的技术。
该技术只有在突变点位于某一限制性内切酶识别位点时才有效。
例如，镰刀状红细胞贫血是因β珠蛋白基因的第6个寡码子由GAG 变成GTG，从而导致所编码氨基酸由酪氨酸变成缬氨酸。
突变的β-珠蛋白功能异常，称作
S珠蛋白，而野生型称为A珠蛋白，其基因型分别为βS和βA。
恰好突变点A→T位于Del I的识别序列CT－NAG之内，这就为设计寡核苷酸限制实验创造了条件。
方法是合成一个长40个碱基的寡核苷酸探针，其5’末端距突变碱基有11个碱基，该探针与βA基因的非编码链互补。
将此探针的5’末端标记上32P。
杂交方法采用液相杂交法，即在液相中将靶DNA 变性解链，然后与探针退火，产生杂交体。
如靶DNA为βA型，则两条链完全互补，并产生Dde I的酶切位点；如待检DNA为βS型，则所形成的杂交体中两条链在突变碱基处不配对，从而不能被Del I所识别。
用Del I消化杂交DNA，显然βA会被切开而βS不被切开。
βADNA 杂交体被切开后，5’端探针序列因只有8个碱基，与杂交链结合不紧而解离，从而产生游离的5’端标记8核苷酸单链。
不被切开的βS杂交体尚可被另一个限制酶Hinf I消化，该酶的识别位点紧靠Del I 识别位点上游。
βS杂交DNA经Hinf I消化后，将释出探针DNA 的5’末端3核苷酸小片段。
βADNA杂交体因已无Hinf I识别序列，故而不能被Hinf I
消化。
这样βA和βSDNA经此寡核苷酸探针杂交和Del I及Hinf I消化后，分别产生游离的8核苷酸（8nt）和3核苷酸（3nt）片段，它们可以经电泳分离后进行放射自显影而获证实。
藉此策略，可轻易将各种β珠蛋白突变型鉴别开，如纯合野生型AA结果为仅有8nt 片段，纯合突变型SS则仅可检出3nt片段，而杂合子AS型则两种片段均存在。