基因突变在微生物研究中的应用
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Tn10的随机突变
Tn10及mini-Tn10 Tn10为复合性转座子：长 9.3kb；中央区编码四环素 抗性基因；两侧为两个IS10。 转座频率为10-8 IS10两端有反向重复序列，是转座酶识别位点，中间编码转座酶，其中 IS10L中的转座酶无活性。 mini-Tn10：由IS10两端反向重复序列和中间的抗性基因组成，不编码转 座酶，转座需要有其它元件提供转座酶，转座后稳定，不再次发生转座。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
基因突变可引入生化阻断，利于阐明物质代谢途径
许多细菌的代谢途径是通过筛选突变菌株阐明的
基因突变是研究基因表达调控的主要手段之一
典型的例子就是大肠杆菌乳糖操纵子的发现和阐明
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酶的体内功能需要用突变菌株来鉴定
大肠杆菌DNA复制中有三种DNA聚合酶：I，II和III。体外检测发现
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设计高效的筛选方案
根据研究目的设计筛选方案。
化学诱变剂诱变的简便方法
在平板涂布初发菌株； 将诱变剂颗粒或沾有诱变剂 溶液的滤纸片放在平板中 央； 适合温度，保温培养一定 时间； 收集抑菌圈周围的菌体； 筛选目的突变株。
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采用转座子获得基因突变
总之，基因的功能研究离不开对突变菌株的研究，同突变菌 株的研究也同样需要体外酶学分析。
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基因突变可用于蛋白质与蛋白质的相互作用
有两个基因a，b，分别编 码：A蛋白与B蛋白。 基因a突变造成细胞丧失某 一功能。 如果A和B是完成这一功能 所必须的，也就是说如果A 和B之间存在相互作用，那 么就有可能在a基因的突变 体中筛选到b基因的突变， 并由于这一突变的出现，使 菌体恢复某一功能。 通过研究两者的突变位点，了解这两种蛋白的相互作用机制。
递送载体：将mini-Tn10带入受体菌的λ噬菌体。 一般使用λb22（cI857 Oam29 Pam80）噬菌体为递送载体。特点：复制基因 O和P中各有一个琥珀无义突变（am），使得噬菌体在非抑制菌中不能 复制；cI基因为温度敏感突变cI1857，使得噬菌体DNA，在39℃不能发 生整合；mini-Tn10插入此噬菌体；转座酶基因的表达受tac启动子控制。
大肠杆菌脂肪酸合成代谢中有两个长链酯酰ACP合成酶，均能参与长
链酯酰ACP的延伸反应，分别由fabB和fabF编码。基因突变研究发现fabF突变 后，菌体能生长；而fabB突变后，菌体为不饱和脂肪酸营养缺陷菌株。表明 FabF与FabB的生理功能不同，FabB是不饱和脂肪酸合成的关键酶。体外生物 化学的研究证明了这一点。
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基因突变是认识基因存在的前提
任何一个基因的都是在发现其突变体后才被证实其存在；现代分子生物学 可借助于分析DNA序列来确定基因，但是真正明确是否存在，仍然需要研 究其突变与功能的关系。
基因突变是认识基因功能的基础
lacY与细菌促进扩散： 温度敏感突变与细菌DNA复制： 筛选到许多与细菌DNA复制有关的温度敏感 突变菌株，至少可以分成十类，表明DNA复 制至少有十种蛋白。
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基因突变可用于鉴定抗菌药物物质作用的位点
利福平与依赖DNA的RNA多聚酶的β亚单位牢固结合，抑制细菌RNA的合成， 防止该酶与DNA结合，从而阻断RNA转录过程，使DNA和蛋白的合成停止
利福平
RNA聚合酶
总之，采用基因突变可以研究微生物的生长繁殖、物质与
能量代谢及其他生命现象
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ATS转座酶：在原有的转座酶基因中发生了两个突变，造成134和249 位的半胱氨酸变成了酪氨酸，使得转座频率降低了3倍，但是转座的随 机性增强。
突变原理 携带mini-Tn10的λ噬 菌体感染受体大肠杆 菌。在诱导时，发生 转座，产生随机突变 体库。
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他们都能催化DNA的合成。在大肠杆菌体内这三种酶的生物功能相同吗？ 如何研究它们各自的生物功能？
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DNA聚合酶I由polA编码，polA突变对细胞的生长和体内DNA合成无影响。 DNA聚合酶III由polC编码。polC的温度敏感突变菌株，在高温时不能合成 DNA，并对菌体致死。这说明DNA聚合酶I对大肠杆菌是非必需的，而聚合 酶III对菌体是必须的。后来证明聚合酶I参与DNA损伤修复，而聚合酶III参与 DNA的复制。
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处理单细胞或单孢子悬液
使每个被处理的细胞均匀接触诱变剂，防止长出不纯菌落。因此，在诱变 时选用单核细胞：放线菌、霉菌处理分生孢子；细菌使用对数期菌体；芽 孢菌处理芽孢。
通过预实验制定最适诱变剂量
一般通过计算致死效率来确定诱变剂量。如制定诱变剂量为致死率达到 80％的诱变剂量。 物理诱变剂剂量：强度×时间，紫外线强度单位是尔格，X射线单位是伦琴 或拉得等。 化学诱变剂剂量：一定温度下诱变剂浓度和处理时间。
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获得基因突变的方法
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基因的随机突变
梯度平板筛选抗药性基因突变
微生物的自发突变率很低，在 10-5-10-10 之间。只有特殊情况时，直接 筛选自发突变的菌株。如采用梯度平板法筛选细菌抗药性突变。
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诱变处理获得基因突变
利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，在促进其突 变率显著提高的基础上，采用简便、快速高效的筛选方法从中挑选出少 数符合目的的突变株。
基因诱变遵循的原则
选择简便有效的诱变剂
物理诱变剂：紫外线、X射线、γ射线和快中子等。最常用是紫外线。 化学诱变剂：烷化剂、碱基类似物和吖啶类化合物。最常用的烷化剂 有N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、甲基磺酸乙酯(EMS) 、甲基亚 硝基脲(NMU)、硫酸二乙酯(DES)、氮芥、乙烯亚胺和环氧乙烷等。
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操作过程 递送载体感染抑制大肠杆菌菌株，制备噬菌体裂解物。 新制备的噬菌体裂解物感染非抑制大肠杆菌受体菌，40 ℃培养。 添加IPTG，诱导转座酶表达。 筛选抗性菌株，获得随机突变体库。 设计合适的方法，获得目的突变体。
Tn10及mini-Tn10 Tn10为复合性转座子：长 9.3kb；中央区编码四环素 抗性基因；两侧为两个IS10。 转座频率为10-8 IS10两端有反向重复序列，是转座酶识别位点，中间编码转座酶，其中 IS10L中的转座酶无活性。 mini-Tn10：由IS10两端反向重复序列和中间的抗性基因组成，不编码转 座酶，转座需要有其它元件提供转座酶，转座后稳定，不再次发生转座。
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基因突变可引入生化阻断，利于阐明物质代谢途径
许多细菌的代谢途径是通过筛选突变菌株阐明的
基因突变是研究基因表达调控的主要手段之一
典型的例子就是大肠杆菌乳糖操纵子的发现和阐明
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酶的体内功能需要用突变菌株来鉴定
大肠杆菌DNA复制中有三种DNA聚合酶：I，II和III。体外检测发现
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设计高效的筛选方案
根据研究目的设计筛选方案。
化学诱变剂诱变的简便方法
在平板涂布初发菌株； 将诱变剂颗粒或沾有诱变剂 溶液的滤纸片放在平板中 央； 适合温度，保温培养一定 时间； 收集抑菌圈周围的菌体； 筛选目的突变株。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
采用转座子获得基因突变
总之，基因的功能研究离不开对突变菌株的研究，同突变菌 株的研究也同样需要体外酶学分析。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
基因突变可用于蛋白质与蛋白质的相互作用
有两个基因a，b，分别编 码：A蛋白与B蛋白。 基因a突变造成细胞丧失某 一功能。 如果A和B是完成这一功能 所必须的，也就是说如果A 和B之间存在相互作用，那 么就有可能在a基因的突变 体中筛选到b基因的突变， 并由于这一突变的出现，使 菌体恢复某一功能。 通过研究两者的突变位点，了解这两种蛋白的相互作用机制。
递送载体：将mini-Tn10带入受体菌的λ噬菌体。 一般使用λb22（cI857 Oam29 Pam80）噬菌体为递送载体。特点：复制基因 O和P中各有一个琥珀无义突变（am），使得噬菌体在非抑制菌中不能 复制；cI基因为温度敏感突变cI1857，使得噬菌体DNA，在39℃不能发 生整合；mini-Tn10插入此噬菌体；转座酶基因的表达受tac启动子控制。
大肠杆菌脂肪酸合成代谢中有两个长链酯酰ACP合成酶，均能参与长
链酯酰ACP的延伸反应，分别由fabB和fabF编码。基因突变研究发现fabF突变 后，菌体能生长；而fabB突变后，菌体为不饱和脂肪酸营养缺陷菌株。表明 FabF与FabB的生理功能不同，FabB是不饱和脂肪酸合成的关键酶。体外生物 化学的研究证明了这一点。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
基因突变是认识基因存在的前提
任何一个基因的都是在发现其突变体后才被证实其存在；现代分子生物学 可借助于分析DNA序列来确定基因，但是真正明确是否存在，仍然需要研 究其突变与功能的关系。
基因突变是认识基因功能的基础
lacY与细菌促进扩散： 温度敏感突变与细菌DNA复制： 筛选到许多与细菌DNA复制有关的温度敏感 突变菌株，至少可以分成十类，表明DNA复 制至少有十种蛋白。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
基因突变可用于鉴定抗菌药物物质作用的位点
利福平与依赖DNA的RNA多聚酶的β亚单位牢固结合，抑制细菌RNA的合成， 防止该酶与DNA结合，从而阻断RNA转录过程，使DNA和蛋白的合成停止
利福平
RNA聚合酶
总之，采用基因突变可以研究微生物的生长繁殖、物质与
能量代谢及其他生命现象
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
ATS转座酶：在原有的转座酶基因中发生了两个突变，造成134和249 位的半胱氨酸变成了酪氨酸，使得转座频率降低了3倍，但是转座的随 机性增强。
突变原理 携带mini-Tn10的λ噬 菌体感染受体大肠杆 菌。在诱导时，发生 转座，产生随机突变 体库。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
他们都能催化DNA的合成。在大肠杆菌体内这三种酶的生物功能相同吗？ 如何研究它们各自的生物功能？
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
DNA聚合酶I由polA编码，polA突变对细胞的生长和体内DNA合成无影响。 DNA聚合酶III由polC编码。polC的温度敏感突变菌株，在高温时不能合成 DNA，并对菌体致死。这说明DNA聚合酶I对大肠杆菌是非必需的，而聚合 酶III对菌体是必须的。后来证明聚合酶I参与DNA损伤修复，而聚合酶III参与 DNA的复制。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
处理单细胞或单孢子悬液
使每个被处理的细胞均匀接触诱变剂，防止长出不纯菌落。因此，在诱变 时选用单核细胞：放线菌、霉菌处理分生孢子；细菌使用对数期菌体；芽 孢菌处理芽孢。
通过预实验制定最适诱变剂量
一般通过计算致死效率来确定诱变剂量。如制定诱变剂量为致死率达到 80％的诱变剂量。 物理诱变剂剂量：强度×时间，紫外线强度单位是尔格，X射线单位是伦琴 或拉得等。 化学诱变剂剂量：一定温度下诱变剂浓度和处理时间。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
获得基因突变的方法
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
基因的随机突变
梯度平板筛选抗药性基因突变
微生物的自发突变率很低，在 10-5-10-10 之间。只有特殊情况时，直接 筛选自发突变的菌株。如采用梯度平板法筛选细菌抗药性突变。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
诱变处理获得基因突变
利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，在促进其突 变率显著提高的基础上，采用简便、快速高效的筛选方法从中挑选出少 数符合目的的突变株。
基因诱变遵循的原则
选择简便有效的诱变剂
物理诱变剂：紫外线、X射线、γ射线和快中子等。最常用是紫外线。 化学诱变剂：烷化剂、碱基类似物和吖啶类化合物。最常用的烷化剂 有N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、甲基磺酸乙酯(EMS) 、甲基亚 硝基脲(NMU)、硫酸二乙酯(DES)、氮芥、乙烯亚胺和环氧乙烷等。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
操作过程 递送载体感染抑制大肠杆菌菌株，制备噬菌体裂解物。 新制备的噬菌体裂解物感染非抑制大肠杆菌受体菌，40 ℃培养。 添加IPTG，诱导转座酶表达。 筛选抗性菌株，获得随机突变体库。 设计合适的方法，获得目的突变体。