基因突变在微生物研究中的应用
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总之，基因的功能研究离不开对突变菌株的研究，同突变菌 株的研究也同样需要体外酶学分析。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
基因突变可用于蛋白质与蛋白质的相互作用
有两个基因a，b，分别编 码：A蛋白与B蛋白。 基因a突变造成细胞丧失某 一功能。 如果A和B是完成这一功能 所必须的，也就是说如果A 和B之间存在相互作用，那 么就有可能在a基因的突变 体中筛选到b基因的突变， 并由于这一突变的出现，使 菌体恢复某一功能。 通过研究两者的突变位点，了解这两种蛋白的相互作用机制。
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处理单细胞或单孢子悬液
使每个被处理的细胞均匀接触诱变剂，防止长出不纯菌落。因此，在诱变 时选用单核细胞：放线菌、霉菌处理分生孢子；细菌使用对数期菌体；芽 孢菌处理芽孢。
通过预实验制定最适诱变剂量
一般通过计算致死效率来确定诱变剂量。如制定诱变剂量为致死率达到 80％的诱变剂量。 物理诱变剂剂量：强度×时间，紫外线强度单位是尔格，X射线单位是伦琴 或拉得等。 化学诱变剂剂量：一定温度下诱变剂浓度和处理时间。
Tn10的随机突变
Tn10及mini-Tn10 Tn10为复合性转座子：长 9.3kb；中央区编码四环素 抗性基因；两侧为两个IS10。 转座频率为10-8 IS10两端有反向重复序列，是转座酶识别位点，中间编码转座酶，其中 IS10L中的转座酶无活性。 mini-Tn10：由IS10两端反向重复序列和中间的抗性基因组成，不编码转 座酶，转座需要有其它元件提供转座酶，转座后稳定，不再次发生转座。
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基因突变是认识基因存在的前提
任何一个基因的都是在发现其突变体后才被证实其存在；现代分子生物学 可借助于分析DNA序列来确定基因，但是真正明确是否存在，仍然需要研 究其突变与功能的关系。
基因突变是认识基因功能的基础
lacY与细菌促进扩散： 温度敏感突变与细菌DNA复制： 筛选到许多与细菌DNA复制有关的温度敏感 突变菌株，至少可以分成十类，表明DNA复 制至少有十种蛋白。
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基因突变可引入生化阻断，利于阐明物质代谢途径
许多细菌的代谢途径是通过筛选突变菌株阐明的
基因突变是研究基因表达调控的主要手段之一
典型的例子就是大肠杆菌乳糖操纵子的发现和阐明
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酶的体内功能需要用突变菌株来鉴定
大肠杆菌DNA复制中有三种DNA聚合酶：I，II和III。体外检测发现
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基因突变可用于鉴定抗菌药物物质作用的位点
利福平与依赖DNA的RNA多聚酶的β亚单位牢固结合，抑制细菌RNA的合成， 防止该酶与DNA结合，从而阻断RNA转录过程，使DNA和蛋白的合成停止
利福平
RNA聚合酶
总之，采用基因突变可以研究微生物的生长繁殖、物质与
能量代谢及其他生命现象
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获得基因突变的方法
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基因的随机突变
梯度平板筛选抗药性基因突变
微生物的自发突变率很低，在 10-5-10-10 之间。只有特殊情况时，直接 筛选自发突变的菌株。如采用梯度平板法筛选细菌抗药性突变。
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操作过程 递送载体感染抑制大肠杆菌菌株，制备噬菌体裂解物。 新制备的噬菌体裂解物感染非抑制大肠杆菌受体菌，40 ℃培养。 添加IPTG，诱导转座酶表达。 筛选抗性菌株，获得随机突变体库。 设计合适的方法，获得目的突变体。
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ATS转座酶：在原有的转座酶基因中发生了两个突变，造成134和249 位的半胱氨酸变成了酪氨酸，使得转座频率降低了3倍，但是转座的随 机性增强。
突变原理 携带mini-Tn10的λ噬 菌体感染受体大肠杆 菌。在诱导时，发生 转座，产生随机突变 体库。
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设计高效的筛选方案
根据研究目的设计筛选方案。
化学诱变剂诱变的简便方法
在平板涂布初发菌株； 将诱变剂颗粒或沾有诱变剂 溶液的滤纸片放在平板中 央； 适合温度，保温培养一定 时间； 收集抑菌圈周围的菌体； 筛选目的突变株。
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采用转座子获得基因突变
诱变处理获得基因突变
利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，在促进其突 变率显著提高的基础上，采用简便、快速高效的筛选方法从中挑选出少 数符合目的的突变株。
基因诱变遵循的原则
选择简便有效的诱变剂
物理诱变剂：紫外线、X射线、γ射线和wk.baidu.com中子等。最常用是紫外线。 化学诱变剂：烷化剂、碱基类似物和吖啶类化合物。最常用的烷化剂 有N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、甲基磺酸乙酯(EMS) 、甲基亚 硝基脲(NMU)、硫酸二乙酯(DES)、氮芥、乙烯亚胺和环氧乙烷等。
递送载体：将mini-Tn10带入受体菌的λ噬菌体。 一般使用λb22（cI857 Oam29 Pam80）噬菌体为递送载体。特点：复制基因 O和P中各有一个琥珀无义突变（am），使得噬菌体在非抑制菌中不能 复制；cI基因为温度敏感突变cI1857，使得噬菌体DNA，在39℃不能发 生整合；mini-Tn10插入此噬菌体；转座酶基因的表达受tac启动子控制。
大肠杆菌脂肪酸合成代谢中有两个长链酯酰ACP合成酶，均能参与长
链酯酰ACP的延伸反应，分别由fabB和fabF编码。基因突变研究发现fabF突变 后，菌体能生长；而fabB突变后，菌体为不饱和脂肪酸营养缺陷菌株。表明 FabF与FabB的生理功能不同，FabB是不饱和脂肪酸合成的关键酶。体外生物 化学的研究证明了这一点。
他们都能催化DNA的合成。在大肠杆菌体内这三种酶的生物功能相同吗？ 如何研究它们各自的生物功能？
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DNA聚合酶I由polA编码，polA突变对细胞的生长和体内DNA合成无影响。 DNA聚合酶III由polC编码。polC的温度敏感突变菌株，在高温时不能合成 DNA，并对菌体致死。这说明DNA聚合酶I对大肠杆菌是非必需的，而聚合 酶III对菌体是必须的。后来证明聚合酶I参与DNA损伤修复，而聚合酶III参与 DNA的复制。
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基因突变可用于蛋白质与蛋白质的相互作用
有两个基因a，b，分别编 码：A蛋白与B蛋白。 基因a突变造成细胞丧失某 一功能。 如果A和B是完成这一功能 所必须的，也就是说如果A 和B之间存在相互作用，那 么就有可能在a基因的突变 体中筛选到b基因的突变， 并由于这一突变的出现，使 菌体恢复某一功能。 通过研究两者的突变位点，了解这两种蛋白的相互作用机制。
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处理单细胞或单孢子悬液
使每个被处理的细胞均匀接触诱变剂，防止长出不纯菌落。因此，在诱变 时选用单核细胞：放线菌、霉菌处理分生孢子；细菌使用对数期菌体；芽 孢菌处理芽孢。
通过预实验制定最适诱变剂量
一般通过计算致死效率来确定诱变剂量。如制定诱变剂量为致死率达到 80％的诱变剂量。 物理诱变剂剂量：强度×时间，紫外线强度单位是尔格，X射线单位是伦琴 或拉得等。 化学诱变剂剂量：一定温度下诱变剂浓度和处理时间。
Tn10的随机突变
Tn10及mini-Tn10 Tn10为复合性转座子：长 9.3kb；中央区编码四环素 抗性基因；两侧为两个IS10。 转座频率为10-8 IS10两端有反向重复序列，是转座酶识别位点，中间编码转座酶，其中 IS10L中的转座酶无活性。 mini-Tn10：由IS10两端反向重复序列和中间的抗性基因组成，不编码转 座酶，转座需要有其它元件提供转座酶，转座后稳定，不再次发生转座。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
基因突变是认识基因存在的前提
任何一个基因的都是在发现其突变体后才被证实其存在；现代分子生物学 可借助于分析DNA序列来确定基因，但是真正明确是否存在，仍然需要研 究其突变与功能的关系。
基因突变是认识基因功能的基础
lacY与细菌促进扩散： 温度敏感突变与细菌DNA复制： 筛选到许多与细菌DNA复制有关的温度敏感 突变菌株，至少可以分成十类，表明DNA复 制至少有十种蛋白。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
基因突变可引入生化阻断，利于阐明物质代谢途径
许多细菌的代谢途径是通过筛选突变菌株阐明的
基因突变是研究基因表达调控的主要手段之一
典型的例子就是大肠杆菌乳糖操纵子的发现和阐明
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
酶的体内功能需要用突变菌株来鉴定
大肠杆菌DNA复制中有三种DNA聚合酶：I，II和III。体外检测发现
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
基因突变可用于鉴定抗菌药物物质作用的位点
利福平与依赖DNA的RNA多聚酶的β亚单位牢固结合，抑制细菌RNA的合成， 防止该酶与DNA结合，从而阻断RNA转录过程，使DNA和蛋白的合成停止
利福平
RNA聚合酶
总之，采用基因突变可以研究微生物的生长繁殖、物质与
能量代谢及其他生命现象
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
获得基因突变的方法
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
基因的随机突变
梯度平板筛选抗药性基因突变
微生物的自发突变率很低，在 10-5-10-10 之间。只有特殊情况时，直接 筛选自发突变的菌株。如采用梯度平板法筛选细菌抗药性突变。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
操作过程 递送载体感染抑制大肠杆菌菌株，制备噬菌体裂解物。 新制备的噬菌体裂解物感染非抑制大肠杆菌受体菌，40 ℃培养。 添加IPTG，诱导转座酶表达。 筛选抗性菌株，获得随机突变体库。 设计合适的方法，获得目的突变体。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
ATS转座酶：在原有的转座酶基因中发生了两个突变，造成134和249 位的半胱氨酸变成了酪氨酸，使得转座频率降低了3倍，但是转座的随 机性增强。
突变原理 携带mini-Tn10的λ噬 菌体感染受体大肠杆 菌。在诱导时，发生 转座，产生随机突变 体库。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
设计高效的筛选方案
根据研究目的设计筛选方案。
化学诱变剂诱变的简便方法
在平板涂布初发菌株； 将诱变剂颗粒或沾有诱变剂 溶液的滤纸片放在平板中 央； 适合温度，保温培养一定 时间； 收集抑菌圈周围的菌体； 筛选目的突变株。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
采用转座子获得基因突变
诱变处理获得基因突变
利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，在促进其突 变率显著提高的基础上，采用简便、快速高效的筛选方法从中挑选出少 数符合目的的突变株。
基因诱变遵循的原则
选择简便有效的诱变剂
物理诱变剂：紫外线、X射线、γ射线和wk.baidu.com中子等。最常用是紫外线。 化学诱变剂：烷化剂、碱基类似物和吖啶类化合物。最常用的烷化剂 有N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、甲基磺酸乙酯(EMS) 、甲基亚 硝基脲(NMU)、硫酸二乙酯(DES)、氮芥、乙烯亚胺和环氧乙烷等。
递送载体：将mini-Tn10带入受体菌的λ噬菌体。 一般使用λb22（cI857 Oam29 Pam80）噬菌体为递送载体。特点：复制基因 O和P中各有一个琥珀无义突变（am），使得噬菌体在非抑制菌中不能 复制；cI基因为温度敏感突变cI1857，使得噬菌体DNA，在39℃不能发 生整合；mini-Tn10插入此噬菌体；转座酶基因的表达受tac启动子控制。
大肠杆菌脂肪酸合成代谢中有两个长链酯酰ACP合成酶，均能参与长
链酯酰ACP的延伸反应，分别由fabB和fabF编码。基因突变研究发现fabF突变 后，菌体能生长；而fabB突变后，菌体为不饱和脂肪酸营养缺陷菌株。表明 FabF与FabB的生理功能不同，FabB是不饱和脂肪酸合成的关键酶。体外生物 化学的研究证明了这一点。
他们都能催化DNA的合成。在大肠杆菌体内这三种酶的生物功能相同吗？ 如何研究它们各自的生物功能？
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
DNA聚合酶I由polA编码，polA突变对细胞的生长和体内DNA合成无影响。 DNA聚合酶III由polC编码。polC的温度敏感突变菌株，在高温时不能合成 DNA，并对菌体致死。这说明DNA聚合酶I对大肠杆菌是非必需的，而聚合 酶III对菌体是必须的。后来证明聚合酶I参与DNA损伤修复，而聚合酶III参与 DNA的复制。