环境生物修复中高效基因工程菌的构建策略_刘和.
基因工程技术在环境保护中的应用
基因工程技术在环境保护中的应用一、概述随着人类社会的快速发展，环境问题日益严重，如何在保护环境的同时实现可持续发展成为了全球共同关注的焦点。
在这个背景下，基因工程技术的出现为环境保护提供了新的可能。
基因工程技术，又称为遗传工程技术或基因操作技术，它是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种的DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
基因工程技术在环境保护领域的应用，旨在通过改良生物、治理污染、修复生态等方式，为环境保护提供新的技术支撑。
在环境保护领域，基因工程技术可以应用于污染物的生物降解、生物修复、生物监测等方面。
通过基因工程技术，可以培育出具有高效降解污染物能力的微生物，从而提高污染物的处理效率。
同时，基因工程技术还可以用于修复受损的生态系统，如土壤、水体等，帮助恢复生态平衡。
基因工程技术还可以用于监测环境污染状况，为环境保护提供及时、准确的信息。
基因工程技术在环境保护中的应用也面临着一些挑战和争议。
例如，基因改造生物的安全性问题、基因污染问题、以及伦理道德问题等。
在推动基因工程技术在环境保护中的应用时，需要充分考虑其可能带来的风险和挑战，并采取相应的措施加以防范和应对。
基因工程技术在环境保护中具有广阔的应用前景和重要的价值。
未来随着技术的不断进步和研究的深入，基因工程技术在环境保护领域的应用将会更加广泛和深入。
同时，也需要加强对其可能带来的风险和挑战的研究和防范，以确保其在环境保护中的安全、有效和可持续应用。
1. 简要介绍基因工程技术的概念和发展历程。
基因工程技术，是一门涉及生物学、化学和工程学的交叉学科，其核心概念在于通过人工干预和操作生物体的基因组，从而创造出新的生物体或改变已有生物体的性状。
这一技术的发展，不仅推动了科学研究的深入，也为环境保护提供了新的可能。
基因工程技术的发展历程可以追溯到20世纪初的基因突变研究。
基因工程与环境修复
基因工程与环境修复基因工程与环境修复随着人口的持续增长和工业化的快速发展，人类活动对环境造成的破坏也越来越严重。
环境修复成为当务之急，而基因工程技术的应用则给环境修复提供了新的解决方案。
基因工程是一门利用分子生物学和遗传学原理，通过技术手段对生物的基因组进行修改、重组和整合的技术。
基因工程技术可以在基因层面上改变生物的遗传特征，使其具备更强的抗逆性和适应性。
在环境修复方面，基因工程技术可以通过修改和重组微生物的基因组，使其能够对环境中的有害物质进行降解。
例如，几十年前，地下油污泥的处理一直是一个难题。
然而，通过基因工程技术，科学家成功地将油降解菌的降解能力提高了10倍以上。
利用这些经过基因工程改良的菌株，可以更好地处理地下油污泥，最大程度地降低水源污染风险。
此外，基因工程技术还可以用于修复土壤中的污染物。
例如，某些化学物质的使用会导致土壤中的微生物数量和多样性的减少，使得土壤的修复变得异常困难。
通过基因工程技术，我们可以将具有特定降解能力的微生物基因导入到受损的土壤中，让它们在土壤中生长和繁殖，从而加速土壤的修复过程。
除了可以用于降解和修复有害物质，在环境修复中基因工程技术还可以用于增强植物的抗逆性。
作为地球上最重要的生物系统之一，植物不仅提供我们所需的食物和氧气，还能吸附空气污染物和土壤中的有害物质。
然而，环境中的污染物和气候变化给植物的生长和发育带来了很大的压力。
通过基因工程技术，我们可以向植物中引入抗逆基因，使植物能够更好地抵抗逆境胁迫，提高其生长速度和适应能力，从而更好地修复受损的环境。
虽然基因工程技术在环境修复中具有巨大潜力，但也面临一些挑战和争议。
首先，基因工程技术尚未被广泛接受，并且存在一定的风险和不确定性。
其次，基因工程修复可能会导致生态系统的改变和不良影响，例如引入的基因可能会在自然界中传播，对当地生态系统产生不利影响。
因此，在应用基因工程技术进行环境修复之前，必须进行严格的风险评估和环境监测。
生物技术在环境修复中的应用有哪些
生物技术在环境修复中的应用有哪些在当今社会，随着工业化和城市化进程的加速，环境污染问题日益严峻，给人类的生存和发展带来了巨大的挑战。
为了应对这些挑战，人们不断探索和创新环境修复技术，其中生物技术以其独特的优势和潜力，在环境修复领域发挥着越来越重要的作用。
生物技术，简单来说，就是利用生物有机体或其组成部分来解决问题或生产有用物质的技术。
在环境修复中，生物技术主要通过微生物、植物和酶等生物手段，对受污染的土壤、水体和大气等环境介质进行治理和修复，以恢复其生态功能和服务价值。
一、微生物修复技术微生物在环境修复中扮演着至关重要的角色。
它们具有强大的代谢能力和适应能力，可以分解和转化各种有机污染物和无机污染物。
例如，一些细菌和真菌可以将石油、农药等有机污染物作为碳源和能源进行代谢，将其转化为无害的物质。
生物强化技术是微生物修复中的一种常用方法。
通过向受污染环境中引入特定的高效降解微生物菌株，可以提高污染物的降解效率。
这些菌株通常经过筛选和培养，具有较强的污染物降解能力和环境适应性。
生物刺激技术则是通过向环境中添加营养物质、电子受体等，刺激土著微生物的生长和代谢活性，从而增强其对污染物的降解能力。
例如，向受石油污染的土壤中添加氮、磷等营养元素，可以促进微生物的生长和繁殖，加速石油的降解。
此外，微生物燃料电池技术也是一种新兴的微生物修复技术。
该技术利用微生物在代谢过程中产生的电子，通过外电路形成电流，同时实现污染物的降解和电能的产生，具有良好的应用前景。
二、植物修复技术植物修复是一种绿色、可持续的环境修复技术。
植物可以通过吸收、挥发、稳定和降解等方式，去除环境中的污染物。
植物吸收是植物修复中最常见的方式。
一些植物具有超积累能力，可以从土壤中吸收大量的重金属，并将其积累在地上部分。
通过收割这些植物，可以有效地去除土壤中的重金属污染物。
植物挥发则是指植物将某些污染物吸收后，通过蒸腾作用将其转化为气态物质释放到大气中。
基因工程菌设计方案
基因工程菌设计方案一、研究背景基因工程菌是指利用基因工程技术对微生物中的基因进行修改和调整，以实现特定功能或生产特定产物的微生物。
基因工程菌的应用范围非常广泛，可以用于生物药物的生产、生物能源的开发、环境修复等多个领域。
在生物药物领域，基因工程菌可以用于大规模生产蛋白质药物，如胰岛素、人类生长激素等。
在生物能源领域，基因工程菌可以用于合成生物柴油、生物乙醇等可再生能源。
在环境修复领域，基因工程菌可以用于处理污水中的有害物质，修复受污染的土壤等。
随着生物技术的不断发展，基因工程菌的应用前景越来越广阔。
因此，设计基因工程菌的研究显得尤为重要。
下面将以基因工程菌在生物能源领域的应用为例，介绍基因工程菌设计方案的具体步骤。
二、研究目的本研究旨在设计一种能够高效合成生物柴油的基因工程菌，通过调整其代谢通路，促进生物柴油合成酶的表达，从而实现高效生产生物柴油的目的。
三、实验步骤1. 选择合适的宿主菌在设计基因工程菌之前，首先需要选择一个适合的宿主菌。
宿主菌的选择需要考虑其生长速度、代谢特点、操作方便性等因素。
目前常用的宿主菌包括大肠杆菌、酿酒酵母、拟杆菌等。
在生物柴油合成方面，大肠杆菌是一种常用的宿主菌，具有快速生长、易操作等优点。
2. 确定目标基因生物柴油的合成需要多个酶参与，因此首先需要确定参与生物柴油合成的目标基因。
常用的目标基因包括脂肪酸合成酶、脂肪酸酶、脂酰辅酶A合成酶等。
3. 构建表达载体在确定目标基因后，需要将这些基因导入到宿主菌中进行表达。
为此，需要构建一个合适的表达载体。
表达载体的构建包括选择适当的启动子、选择合适的表达基因等。
同时，还需要考虑构建选择标记的载体，以便筛选转化成功的菌株。
4. 转化宿主菌构建好表达载体后，需要将其导入到宿主菌中进行转化。
转化可采用化学转化、电穿孔转化、电渗转化等方法。
在转化后，通过筛选标记来筛选出转化成功的菌株。
5. 验证目标基因表达转化成功的菌株中，目标基因是否能够成功表达是一个关键问题。
基因工程菌的构建
PCR扩增技术
（一）在PCR反应管中加入2× PCR Premix 12.5ul （二）向此反应管中加入 2ul Control Template 和10.5 ul的Primer Pair 1，混匀 （三）向反应管中滴加一滴石蜡油 （四）按以下条件进行PCR反应： 94℃ 94℃ 55℃ 72℃ 1分钟 30秒钟 30秒钟 30秒钟 循环30次 1次
空白和阳性阳性重组子的鉴定阳性重组子的鉴定11限制性酶切法限制性酶切法22互补法互补法33插入失活法插入失活法44杂交筛选法杂交筛选法constructionexpressionvectorconstructionexpressionvectorncoiccatggggtaccxhoictcgaggagctc实验操作实验操作碱裂解法小量制备质粒碱裂解法小量制备质粒dnadnapuc18puc18接种子液至接种子液至7575gmlampgmlamp的的5mllbmllb培养基培养基37od60010加氯霉素100gml37过夜14ml培养液6000rpmmin沉淀加100冰预冷溶液剧烈振荡弃去上清尽可能除净培养液室温20min200新配制溶液快速颠倒混匀冰浴5min150冰预冷溶液温和振荡冰浴5min上清加入450l饱和酚混匀12000rpm2min上清加入450l氯仿异戊醇混匀12000rpm2min上清加入300l异丙醇2030min12000rpm离心5min50070乙醇洗涤沉淀12000rpm2min弃上清空气干燥10min2012000rpm5mindnadna的含量纯度与分子量的电泳法测定的含量纯度与分子量的电泳法测定一选择合适的水平电泳仪二选择孔径大小合适的点样梳三制备琼脂糖凝胶四用电泳缓冲液溶解凝胶加入eb达05微克毫升摇匀铺胶五在电泳槽中加入电泳缓冲液六待测的样品中加入指示剂进行点样七打开电源开关电压控制在5vcm左右八待dna各条带分开后电泳结束dnadna的酶切与连接的酶切与连接酶切反应体系酶切反应体系ddhddh2219l19l19l19l1010buffer25l25lbuffer25l25l质粒质粒dnapbr322dnapbr322ecori05l05lecori05l05l37376565101015min15min终止反应终止反应样品加入样品加入1010loadingbuffer05lloadingbuffer05l核酸电泳核酸电泳连接反应体系ddh85l10buffer45l酶切dnapbr32220l酶切dnapuc1810lt4dnaligase1615其余连接产物用于转化重组重组dnadna的转化的转化一caclcacl22法制备大肠杆菌感受态细胞法制备大肠杆菌感受态细胞03ml03ml菌种接种于菌种接种于30mllb30mllb培养基培养基37190rpmod60003
降解难降解物质基因工程菌的构建和运用-精品文档
清华大学环境学院
Thank you
果并不明显：污泥浓度为5g/L时，对两种废水水样中 镍去除率仅为7.31%和10.62%。 •采用基因工程菌-活性污泥曝气处理电镀废水取得了 较好的效果。
现代环境生物学课程报告
• 基因工程菌-活性污泥联用处理电镀废水时，在pH
值为3-7的范围内，电镀废水中的总镍去除效果较 好：两种电镀废水的去除率分别达到75.42%和 83.47%以上。 • 基因工程菌-活性污泥联用对废水中总镍的吸附速率 比较快，在振荡吸附30min后，两种电镀废水的总 镍去除率分别达到了70.52%和75.34%，完成了 总去除率的80%以上
Tod和xyl 基因能降 解甲苯
现代环境生物学课程报告
• 甲苯的代谢途径共有5 种,但都是先通过甲苯单加氧酶或双加氧酶形
成邻苯二酚这个关键中间产物, 然后通过邻位切割或间位切割开环。 P. putida在有氧条件下，的代谢途径如图1a
Tod基因能转化甲 苯为2-hydroxy6-oxo-2,4heptadienoate
现代环境生物学课程报告
处理实际废水的应用：
•菌株：本实验所构建的表达ATCC6538镍钴转运酶
NiCoT基因的重组菌E.coliBL21 •活性污泥：采自广州市猎德污水处理厂，离心后使 用，含水率为82.5% •废水：广东省阳江市某电镀厂两个不同车间
现代环境生物学课程报告
处理效果：
•当活性污泥单独投加时，对电镀废水中镍的去除效
现代环境生物学课程报告
案例二：基因工程菌—活性污泥法处理含镍电镀废水
• 背景：
电镀镍生产清洗过程中产生的废水往往含有过量的镍， 对人类健康有很大影响。 用于处理含镍废水的方法中，生物吸附法较于其他物理 化学方法在反应速度和运行成本等方面更有优势。但是也 存在对环境因素敏感、选择性差等不足，希望通过基因工 程技术的引入解决这些问题。 目前国内外利用基因工程菌处理重金属废水还处于实验 室研究阶段，距离实际工程应用有一定差距。基因工程菌 在吸附机理和工程应用的影响因素等方面的研究还有待进 一步开展。
基因工程菌介绍汇报
基因工程菌的构建方法
原
生
质
体
融
这些编码酶的基因有时也会存在于染色体中而并不全部存在于质粒上
合 技
。还有的菌中的染色体和质粒会编码具有降解同一化合物但是途径不 相同的酶，并且几种酶相互补充共同产生作用。原生质体融合技术是 将多个细胞的优势部分转入到同一个细胞中，主要利用了微生物细胞
术
共生或互生作用原理，原生质体融合技术因具有育种效率高、致育性
01 基因工程菌的基本原理 02 基因工程菌的构建方法 03 基因工程菌在环境治理中的应用 04 基因工程菌的构建与应用展望
PART ONE
01 基因工程菌的 基本原理
基因工程菌的基本原理
基因工程菌是指利用基因工程 ，将目的基因导入细菌体内使 其表达，产生所需要的蛋白的 细菌。
通过基因工程可以将来自任何 一种生物的基因放置到与其毫 无亲缘关系的寄生生物中，因 此可按人类的医院改造或创造 出新的生物特性或生物类型。
谢谢各位聆听
Davison等研究发现sdsA和sdsB两个基因决定了假单胞菌是否能降解十二烷基 硫酸钠(SDS)。Jovcic等进一步研究了十二烷基硫酸钠(SDS)降解菌 Pseudomonas sp.ATCC19151基因表达时，发现基因sdsA使该菌能利用SDS 为唯一碳源，基因sdsB能调控基因sdsA的转录。
农药类污染物降解基因工程菌
农药是一类有毒化学物质，是较难处理的环境污染物之一。有机农药的结构复 杂和降解这些农药的代谢途径差异性大，导致了单一微生物种群降解效率不高 。所以构建高效降解多种农药的多功能工程菌则成为目前研究的前沿和热点。
Song等分离到一株以1,2,4-三氯苯为唯一碳源的施氏假单胞菌THSL-1，并将施 氏假单胞菌THSL-1 的质粒，用Ca2+诱导大肠杆菌转化法，转化到E.coli JM109 中，得到转化子能以1,2,4-三氯苯为唯一碳源生长，且对1,2,4-三氯苯有降解作 用，但有待进一步检验质粒遗传的稳定性。
环境生物修复中高效基因工程菌的构建策略_刘和.
浙江大学学报 (农业与生命科学版 28(2 :208~212, 2002Journal of Zhej i ang Un iversity (A gric 1&L ife Sci 1收稿日期 :2001204202基金项目 :浙江省科学技术厅重点资助项目 (001103258 作者简介 :刘和 (1974- , 男 , 江西吉安人 , 博士生 , 主要从事环境生物技术的研究 .文章编号 :100829209(2002 022*******环境生物修复中高效基因工程菌的构建策略刘和 , 陈英旭(浙江大学环境工程系 , 浙江杭州 310029摘要 :通过对环境污染物的生物降解机制及妨碍污染物降解的因素进行分析 , 提出了几种高效基因工程降解菌的构建策略 , 包括重组污染物降解基因以优化污染物降解途径、重组污染物摄入相关基因以改善对污染物的生物可利用性和重组环境不利因子抵抗基因以增强其环境适应性等Λ关键词 :生物修复 ; 基因工程菌 ; 污染物降解基因 ; 中图分类号 :X 502文献标识码 :AL I U H e , CH EN Y ing 2(t . E ng ineering , Z hej iang U niv . , H ang z hou 310029, Ch inaCon ies genetically eng i neered bacter i a for env ironm en t biore m edi ation . Journal of Zhejiang U (A gric 1&L ife Sci 1 , 2002, 28(2 :2082212Abstract :Genetically engineered bacteria ho ld p rom ising po tential in the future app licati ons of bi o rem e 2diati on . T h is paper p resents several constructi on strategies of genetically engineered bacteria fo r the bi o rem ediati on purpo se th roughanalyzing the bi odegradati on m echanis m s of po llutants and encum ber 2ing facto rs fo r efficacy of bi odegradati on . T hese strategies include op ti m izati on of the degradati on path 2w ays , i m p rovem ent of the bi oavailability to po llutants and enhancem ent of the abilities of to lerance to the environm ental hazardous facto rs .Key words :bi o rem ediati on ; genetically engineered bacterium ; po llutant catabo lic gene ; environm entalbi o techno logy受污染环境的生物修复技术是一项蓬勃发展的环境污染治理技术 , 因其对受污染环境的生态风险小、费用低廉而日益引起各国政府部门和环境科学研究者的关注Λ微生物丰富的生物多样性决定了其代谢类型与污染物降解途径的广泛多样 , 因此在实际中得到了更多的应用Λ然而受微生物对污染物特别是难降解污染物的降解能力所限 , 生物修复技术具有修复周期长的明显缺点 , 阻碍了这一技术在现实中的发展和应用Λ构建高效的基因工程菌可以显著提高污染物的降解效率 [1], 它为解决生物修复周期长等问题提供了崭新的途径Λ环境微生物尤其是细菌中的污染物降解基因、降解途径等许多污染物降解机制的阐明为构建具有高效降解性能的污染物降解基因工程菌提供了可能[2]Λ本文通过对污染物生物降解机制以及阻碍污染物降解的相关因素进行分析 , 提出几种高效基因工程菌的构建策略Λ1优化污染物的降解途径1. 1重组互补代谢途径有机污染物在降解菌编码的一系列酶催化作用下 , 逐步从复杂大分子化合物降解成简单的无机小分子化合物Λ一些难降解有机污染物特别是人工合成化合物 (xenob i o tics 还需要不同降解菌之间的协同代谢或经共代谢等复杂机制才能最终得以降解 , 这无疑降低了污染物的降解效率Λ因为污染物代谢产物在不同降解菌间的跨膜转运是耗能过程 , 对细菌来说这是一种不经济的营养方式Λ另外 , 某些污染物的中间代谢产物可能具有毒性或对代谢活性有抑制作用 , 如不能被迅速代谢利用 ,谢过程产生抑制作用Λ菌降解污染物的种类、在显著差异 ,重组 ,途径组合起来以构建具有特殊降解功能的超级降解菌 , 可以有效地提高微生物的降解能力 , 从而提高生物修复效率Λ近年来 , 随着对污染物降解机理的逐步阐明及分子生物学实验手段的飞速发展 , 运用污染物互补降解途径重组策略已构建出越来越多的超级降解工程菌Λ多氯联苯 (PCB s 是自然环境中广泛存在的一类难降解污染物ΛPCB s 在好氧条件下通过细菌 bp h A 基因编码的联苯双加氧酶催化联苯裂解 , 生成氯代苯甲酸 (CBA 以及异戊二烯酸Λ后者最终降解成 CO 2和 H 2O , 但细菌对 CBA 因缺乏相应的降解基因而不能继续降解Λ由于 CBA 对联苯双加氧酶具有强烈的抑制作用 , 使整个 PCB s 的降解效率显著降低Λ与此同时 , 某些细菌中发现的脱卤素基因 , 如 P seud o m onas aerug inosa 142中的 ohb 以及 A rth robacter g lobif or m is KZT 1中的 f cb 等 , 它们能迅速脱除 CBA 上的氯 , 使 CBA 顺利进入后续降解步骤 , 同时也解除了 CBA 对整个降解途径的抑制作用Λ因此用脱卤素基因和bp h 基因构建的重组体 bp h ∷ ohb 弥补了 PCB 的代谢缺陷Λ实际上 , 自然界细菌在污染物的选择压力下相互间的同源基因也存在着遗传交换和重组 , 以形成新的污染物降解途径 , 但是概率极低Λ运用互补代谢途径重组策略可以极大地扩展细菌的污染物降解范围以及增强细菌对污染物特别是难降解污染物的降解能力 , 这对于提高生物修复的效率无疑具有重要意义Λ1. 2改变污染物代谢产物流向污染物降解过程中由于抑制性中间代谢产(end 2p p,Λ, 使抑制性中间产物不生成或尽快转化 , 从而提高污染物降解效率Λ例如 , 苯、甲苯、二甲苯 (B TX 是环境中常见的石油化工污染物 , 它们单独存在时被细菌通过 TOL 或 TOD 两种途径降解 , 但两种途径都存在缺陷 :TOD 途径中 , 二甲苯降解产生的中间产物 3, 62二甲基邻苯二酚是一截止式代谢产物 (dead 2end p roduct , 因不能被后续的加氧酶识别而导致二甲苯降解不完全Λ而在 TOL 途径中 , 降解 B TX 的 P . p u tid a m t 22菌体内不存在识别苯的加氧酶 , 致使苯不能被降解而在环境中积累Λ然而研究发现 , P . p u tid a m t 22菌体内的对甲基苯甲酸脱氢酶能识别 TOD 途径中经甲苯双加氧酶催化苯降解产生的二羟基二氢对二甲苯 , 使之得以完全降解Λ因此 , 可以通过将 TOD 途径中编码甲苯双加氧酶的基因转移到P . p u tid a 的 TOL 途径中 , 利用 TOL 途径中的脱氢酶来催化 TOD 途径中生成的二羟基二氢对甲苯 , 使二甲苯不再进入 3, 62二甲基邻苯二酚途径Λ这样通过TOL 和 TOD 途径整合到一起 , 污染物降解前段利用 TOD 途径 , 后段利用 TOL 途径 , 通过改变污染物的代谢流向而将 B TX 完全降解 (见图 1所示Λ902第 2期刘和 , 陈英旭环境生物修复中高效基因工程菌的构建策略图中实线表示 TOL 途径 , 虚线表示 TOD 途径 , 箭头上的横截线分别表示TOL 和TOD Λ缩写说明 :TDO :甲苯双加氧酶 ; BCG :顺式 21, 22二羟基 21, 22二氢苯 ; XCG :顺式 21, 22二羟基 21, 22XO :二甲苯氧化酶 ; BADH :苯甲醇脱氢酶 ; BALDH :苯甲醛脱氢酶 ; BA :苯甲酸 ; :; ; BA CG:顺式 22, 32二羟基 22, 32二氢苯甲酸 ; TA CG:顺式 22, 322TA CGDH:顺式 22, 32二羟基 22, 32二氢对甲基苯甲酸脱氢酶 ; CTL :邻苯二酚 ; 42M ::22, 32双加氧酶图 F ig . BTX degradati on pathw ay1. 3 DNA (DNA shuffling 最早是由 Stemm er 提出的一项对蛋白质进行人工体外快速定向进化的方法[3]Λ常规的 PCR 中 , 需要设计特定的引物对选定的DNA 片段进行扩增Λ然而 , DNA 体外随机拼接技术既依赖于 PCR , 又不同于传统的 PCR 技术Λ这一 DNA构建策略可以简单概括为重组、扩增、筛选三个阶段 , 以上步骤反复进行直至得到所希望的重组酶蛋白Λ其一般过程是将一组不同来源的基因 DNA 或来自同一基因不同突变体的 DNA 经 DNA 酶随机切割消化 , 获得 DNA 随机酶切片段混合体 , 以此混合体在不加引物的情况下进行 PCR 扩增ΛDNA 酶切割的 DNA 片段因相互间的同源性进行随机互补 , 并以此为引物 , 经 PCR 扩增 , DNA 分子复制 , 从而获得大量 DNA 不同区域间的随机重组的新 DNA 突变体Λ完成这一 PCR 随机扩增后 , 再加入特定引物进行最后的 PCR 扩增 , 便可获得全长基因的 PCR 产物Λ将 PCR 产物在寄主细胞中表达 , 筛选出理想的突变体 , 如此多次循环Λ由于同源基因 DNA 体外随机拼接是一项效率极高的 DNA 重组技术 , 它能够在极短的时间内筛选出所需要的 DNA 重组蛋白 , 因此这一技术又被称为蛋白质定向进化技术Λ这一先进的 DNA 重组策略可以运用于污染物降解基因的重组Λ双加氧酶是细菌体内广泛存在的一类多组分复合酶 , 它们通过将两个氧原子激活、加合到苯环上的方式活化苯环 , 使其进入后续的裂解开环步骤Λ由于双加氧酶是催化芳香化合物降解的一系列酶中最重要的酶之一 , 它对底物的选择特异性决定了细菌对污染物的降解范围 , 它对底物的降解效率很大程度上决定了芳香化合物的降解速率Λ因此 , 双加氧酶编码基因应该是 DNA 随机拼接技术的理想材料ΛB u rkhord eria cep acia LB 400和 P . p seud oa l 2ca lig enes KF 707是两株降解性能迥异的 PCB 降解菌 , 前者的污染物选择范围宽于后者 , 而后者则对 PCB 同系物中的某些污染物具有更高的降解效率Λ尽管如此 , 它们的PCB 双加氧酶编码基因 bp h A 1却具有极高的同源性 , 运用 DNA 随机拼接策略将两株菌的 bp h A 1基因重组 , 筛选后得到的双加氧酶重组体不但具有更高的降解活性 , 而且还能降解一些其亲本双加012浙江大学学报 (农业与生命科学版第 28卷氧酶所不能降解的苯和甲苯类单环芳香化合物[4]Λ2提高污染物生物可利用性2. 1重组表面活性剂编码基因污染物的生物可利用性与生物修复效果密切相关ΛBo s m a 等人认为污染物的生物可利用性在多数情况下决定了生物修复的可行性及修复效率[5]Λ尽管目前的研究结果不尽一致 , 但是普遍认为 , 表面活性剂能通过改善疏水性化合物的水溶性和表面张力等理化性质而提高其生物可利用性Λ而生物表面活性剂由于具有高表面活性、对热和 pH 值波动的稳定性好、低毒性和生物可降解性而比化学表面活性剂有着更广泛的应有优势Λ但由于生物表面活性剂的生产得率较低 , 因此现在的趋势是利用基因工程的量Λ, 这些工程Λ而提高污染物生物可利用性的另一途径是直接对污染物降解基因和表面活性剂编码基因进行重组 , 然后转化到合适的宿主菌中表达Λ如将从R hod ococcus ery th rop olis IGT S 8分离得到的脱硫基因 d sz 转化到产生鼠李糖脂的假单胞菌中可使构建的工程菌的生物脱硫效率明显提高[6]Λ2. 2重组污染物跨膜转运基因污染物降解速度还与微生物细胞对污染物的摄取速率有关 , 提高污染物的摄取速度有助于提高污染物的降解速度Λ例如 , 许多芳香烃类化合物进入降解细菌内部需要依靠细胞膜上的透性酶载体蛋白 , 这类酶蛋白不但对不同的底物具有特异性 , 甚至对化合物分子的空间构象也有选择性Λ因此将这些膜转运蛋白编码基因重组到污染物降解菌中可以提高其对污染物的摄取效率Λ另外 , P . p u tid a 的 42羟基苯甲酸转运蛋白 Pcak 还具有生物趋化作用Λ某些降解细菌中质粒编码的膜转运蛋白 N ahY 对细菌的降解底物萘也有趋化作用[7]Λ这些特殊的生物学现象的发现及其机理的阐明将为构建此类基因工程菌提供坚实的理论基础Λ3增强细菌的环境适应性3. 1增强细菌的抗毒能力污染物降解菌在生物修复应用中要充分发挥降解性能就必须提高其对环境毒物的抵抗能力Λ许多芳香烃类污染物由于具有高度的疏水性而易在细菌细胞膜的脂质层积累 , 对细菌产生毒性Λ通过对此类化合物具有高度耐受性的细菌细胞膜结构进行研究后发现 , 构成细胞膜脂质双层的脂肪酸空间构象全部由顺式转变成反式结构 , ,, :细胞内这些耐受机制促使细菌在高浓度芳香烃类污染环境下得以生存Λ由于以上抗毒机制的相关编码基因已经得到分离 , 因此将污染物降解基因转入到此类细菌中可构建出对有毒污染物具有更强耐受力的基因工程菌 , 这将是提高细菌降解能力的有效途径Λ3. 2增强细菌的放射线耐受性许多微生物对放射线具有耐受性 , 但目前分离到的放射线耐受菌多属产芽孢菌 , 而且很多还是致病菌 , 因而限制了它们的应用Λ对D einococcaceae 属细菌的研究发现 , 它们具有一些与众不同的特性 , 如繁殖体也具有高活度放射线耐受性 , 基因在不发生突变的前提下可完整地表达 , 无致病性 , 易分离培养等 , 这些特性使其成为最有希望用于放射性环境下进行生物修复的细菌Λ因此 , 将污染物降解基因转化到这类菌体中便有可能构建出耐受放射环境的污染物降解菌Λ将 P . p u tid a 中分离得到的甲苯双加氧酶基因 tod C 1C 2A 转移到 D . rad iod u rans 中 , 构建的工程菌能在高放射性压力下降解甲苯、氯苯以及3, 42二氯丁烯[8]Λ另外 , 将编码汞离子还原酶的 m er A 基因转化 D . rad iod u rans 得到的细菌可在 6000rad h 的放射环境下将浓度极高的(30~50Λm o l L H g 2+转化成无 112第 2期刘和 , 陈英旭环境生物修复中高效基因工程菌的构建策略毒、易挥发性的H g 0+[9]Λ与此类似 , 一些其它的耐受重金属环境及极寒或极热环境条件的相关编码基因也被克隆分离出来 , 将这些基因与污染物降解基因重组可得到耐极端环境条件的污染物降解菌 , 这一构建策略为极端环境条件下的生物修复提供了可能Λ致谢 :感谢白晓慧博士在本文完成过程中提供的帮助ΛReferences :[1] L aw rence P W , N eil C B . 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N a t . , 18:85290.最近 , 浙江大学农业与生物技术学院教授周雪平等先后发现和命名了两种植物新病毒 , 这是为数不多的由我国科技工作者独立发现和命名的植物新病毒Λ据了解 , 周雪平等在对植物 DNA 病毒研究中 , 在云南烟草上分离了多种病毒分离物 , 经生物学、血清学及病毒基因组全序列测定 , 从中发现了两种新病毒 , 遂分别命名为云南烟草曲叶病毒 (Tobacco leaf curl Yunnan V irus 和烟草曲基病毒(Tobacco curly shoo t V irus Λ有关结果已先后在《 A rch ives of V iro logy 》和《科学通报》上发表Λ据介绍 , 周雪平等曾于 1997年在国际上首次发现植物DNA 病毒基因组重组可产生新病毒 , 有关研究结果在国际上引起了广泛关注Λ目前 , 他们正在继续开展植物 DNA 病毒基因组结构、功能及致病机理研究Λ该项研究得到国家杰出青年基金的资助Λ——本刊编辑室 212浙江大学学报 (农业与生命科学版第 28卷。
基因工程菌构建的方法和步骤
基因工程菌构建的方法和步骤基因工程菌，听起来是不是像科幻电影里那些高科技生物？别急，咱们先从“基因”开始说起。
基因就像是DNA的密码，而工程菌呢，就是那些能读懂这些密码、把信息变成实际成果的小精灵。
想象一下，你是一位科学家，手里有一堆神秘的DNA序列，想要把它们变成有用的蛋白，这不就是一场神奇的旅程吗？你得有个好伙伴——那就是你的工程菌。
选一个合适的菌种吧，就像挑一个合适的朋友一样重要。
有的菌种擅长生产抗生素，有的则擅长合成维生素，还有的能把废物变黄金。
选对菌种，就像找到了宝藏，接下来就是搭建实验室了。
实验室里得有个小舞台，让菌子们尽情表演。
你得准备好培养基，这可是微生物的“饭”，得营养均衡才能长得壮。
还得给它们准备个舒适的家——摇床或者恒温箱，让它们在最适宜的温度下安家落户。
别忘了，还得时不时来点“表演”的观众——显微镜和各种检测工具，看看它们长成什么样，有没有出错。
接下来是最关键的一步：将DNA序列注入到工程菌中。
这个过程就像把一段段代码输入电脑，让它们变成可以执行的程序。
记得要慢慢来，别急，就像我们慢慢学走路一样，一步步来，才不会摔倒。
当看到那些小小的菌子们在显微镜下闪闪发光，就知道成功了。
不过，别急着庆祝，还得继续观察它们的“表演”。
看看它们是否按照预期工作，有没有出现什么“小插曲”。
如果有问题，就像遇到了一个小麻烦，需要耐心解决。
把这些有趣的小家伙们送到市场上去，让更多的人知道它们的价值。
就像我们的产品经过测试后上市一样，让更多人享受到科技带来的便利。
这就是构建基因工程菌的全过程，虽然听起来有点复杂，但每一步都是那么有趣。
就像我们小时候玩积木一样，虽然一开始会弄得一团糟，但最终能看到自己的作品，那种成就感真是无法言喻。
所以，下次当你看到那些小小的生物时，不妨想想自己在这个过程中扮演的角色，也许你会发现更多的乐趣呢！。
阿维菌素高产有效组分基因工程菌的构建
阿维菌素高产有效组分基因工程菌的构建阿维菌素是一种广泛存在于土壤中的黄赤霉菌所分泌的18-membered环内脂肽类抗生素，具有广谱抗菌活性，对多种革兰氏阳性和阴性细菌、真菌和原虫均有活性。
由于其良好的抗菌效果，阿维菌素被广泛应用于医学和农业领域。
然而，阿维菌素的生产量较低，且含量不稳定，制约了其在实际应用中的发挥。
因此，利用基因工程手段构建高效阿维菌素生产菌株，成为了缓解现有问题的关键所在。
本文介绍了阿维菌素高产有效组分基因工程菌的构建方法，主要包括基因克隆、表达载体构建、转化及筛选。
以下分别进行详细阐述。
1. 基因克隆从阿维菌素产生菌株中分离出阿维菌素的生物合成基因簇，然后通过PCR扩增得到所需的基因片段。
通常的基因片段选择包括阿维菌素前体合成基因avmB、avmC、avmD、avmE、avmF、avmG、avmH、avmI、avmJ、avmK、avmL，以及调控基因avmR、avmS、avmT等。
2. 表达载体构建将基因片段与表达载体进行连接。
常用的表达载体包括pET、pUC、pGEX等。
在构建过程中需要注意的是，合理选择启动子、信号肽、标签等元素，以使得蛋白表达量高且方便纯化。
3. 转化及筛选将表达载体转化至宿主菌中，可使用大肠杆菌等细菌作为宿主。
利用适当的筛选方法，如抗生素耐受性筛选法、荧光标记筛选法等，选出具有高阿维菌素生产能力的高效基因工程菌株。
值得注意的是，在构建高阿维菌素生产的基因工程菌株时，需要考虑法律法规等问题，避免破坏环境和人类健康。
此外，不仅仅是阿维菌素，其他抗生素的基因工程构建也需要遵守相应的规范。
总体来说，通过基因工程手段构建高效阿维菌素生产菌株，对于满足社会对高效抗生素的需求，增强我国在生物药物领域的竞争力等方面都具有重要意义。
基因工程技术在环境监测与保护中的创新应用
基因工程技术在环境监测与保护中的创新应用在当今社会，环境保护已成为全球关注的焦点议题。
随着科技的不断发展，基因工程技术作为一种前沿的科学手段，正逐渐在环境监测与保护领域展现出其独特的创新应用，为解决环境问题带来了新的希望和可能性。
基因工程技术能够帮助我们更精确地监测环境中的污染物。
传统的环境监测方法往往存在着精度不高、检测范围有限等问题。
而基因工程技术的出现改变了这一局面。
例如，利用基因重组技术，可以构建出对特定污染物高度敏感的生物传感器。
这些生物传感器通常是经过基因改造的微生物或细胞，它们能够感知并响应环境中的微量污染物，通过产生特定的信号来指示污染物的存在和浓度。
这种方法具有高度的灵敏性和特异性，能够检测到传统方法难以察觉的低浓度污染物，为环境监测提供了更准确的数据支持。
以重金属污染监测为例，科学家们通过将重金属结合蛋白的基因导入到细菌中，使其能够在接触到重金属离子时发出荧光。
这样，只需要检测荧光的强度，就可以快速、准确地判断环境中重金属的含量和种类。
此外，还有利用转基因植物作为生物监测器的研究。
通过将与污染物响应相关的基因转入植物中，观察植物的生长状况、生理指标以及基因表达的变化，从而评估环境的污染程度。
在环境污染物的降解方面，基因工程技术同样发挥着重要作用。
许多自然存在的微生物虽然具有一定的降解污染物的能力，但效率往往较低。
通过基因工程手段，可以对这些微生物进行改造，增强它们的降解能力。
比如，将编码降解酶的基因进行优化和增强表达，或者引入来自其他物种的高效降解基因，使微生物能够更快速、有效地分解各种污染物。
以石油污染为例，某些细菌原本就具有分解石油中部分成分的能力。
科学家们利用基因工程技术，对这些细菌的基因进行改造，使其能够产生更多、更高效的分解石油的酶，从而大大提高了石油降解的效率。
同样，对于难以降解的有机污染物，如多氯联苯、农药等，基因工程也为其治理提供了新的途径。
通过改造微生物的基因，使其能够适应更复杂的污染环境，并有效地将这些污染物转化为无害物质。
合成生物学在生物修复中的应用与前景
合成生物学在生物修复中的应用与前景在当今时代，环境污染问题日益严峻，对人类的生存和发展构成了巨大威胁。
传统的物理和化学修复方法虽然在一定程度上能够减轻污染，但往往存在成本高、效率低、易造成二次污染等缺点。
而合成生物学作为一门新兴的交叉学科，为生物修复领域带来了新的希望和机遇。
合成生物学旨在通过设计和构建新的生物体系，实现对生物功能的定制和优化。
在生物修复中，合成生物学可以从多个方面发挥作用。
首先，利用合成生物学技术可以改造微生物的基因，使其具备更强的降解污染物的能力。
例如，对于一些难以降解的有机污染物，如多氯联苯、石油烃等，科学家们可以通过基因工程的手段，将编码降解酶的基因导入到微生物中，使其能够高效地分解这些污染物。
此外，还可以对微生物的代谢途径进行重新设计，使其能够将污染物作为碳源和能源进行利用，从而实现污染物的彻底去除。
其次，合成生物学可以构建人工合成的微生物群落。
在自然环境中，微生物群落之间存在着复杂的相互作用关系，这种相互作用对于污染物的降解具有重要意义。
通过合成生物学的方法，可以构建具有特定功能的微生物群落，使其能够协同作用，提高生物修复的效率。
比如，将具有不同降解能力的微生物组合在一起，形成一个“降解联盟”，可以同时处理多种污染物，并且能够适应复杂多变的环境条件。
再者，合成生物学还可以开发新型的生物传感器。
生物传感器能够实时监测环境中的污染物浓度和分布情况，为生物修复提供重要的信息支持。
通过将特定的基因与报告基因（如荧光蛋白基因）相连，构建出能够对污染物产生响应的生物传感器。
当环境中存在污染物时，生物传感器会发出信号，从而帮助我们及时了解污染状况，制定更加有效的修复策略。
在实际应用中，合成生物学已经在生物修复领域取得了一些令人瞩目的成果。
例如，在土壤污染修复方面，科学家们利用合成生物学技术改造了一种名为假单胞菌的微生物，使其能够高效降解土壤中的农药残留。
经过处理后的土壤，农药残留量显著降低，土壤质量得到了明显改善。
环境污染生态修复技术（复习资料）
环境污染⽣态修复技术（复习资料）1.⽣态修复：指利⽤⽣态系统的⾃我恢复能⼒，辅以⼈⼯措施，使遭到破坏的⽣态系统逐步恢复或使⽣态系统向良性循环⽅向发展。
2.⽣态恢复是指对受到⼲扰、破坏的⽣态环境修复使其尽可能恢复到原来的状态。
3.⽣态修复是指根据⼟地利⽤计划，将受⼲扰和破坏的⼟地恢复到具有⽣产⼒的状态，确保该⼟地保持稳定的⽣产状态，不再造成环境恶化，并与周围环境的景观（艺术欣赏性）保持⼀致。
4.⽣态重建是指通过外界⼒量使完全受损的⽣态系统恢复到原初状态。
5.⽣态改建是指通过外界⼒的⼒量使部分受损的⽣态系统进⾏改善，增加⼈类所期望的⼈⼯特点，减少⼈类不希望的⾃然特点。
6.⽣态改良是指将被⼲扰和破坏的⽣境恢复到使它原来定居的物种能够重新定居，或者使原来物种相似的。
7.提问：⼈们在⼀⽚空地上种上花草，这就是绿化，也是⽣态恢复。
这种说法是否正确？ν绿化不等于⽣态修复，只是⽣态修复的⼿段之⼀。
恢复⽣态是恢复当地⽣物多样性、⽣态的完整性以及周围环境的协调性和⽣态系统⾃我维持性。
绿化最终不能达到⾃我维持能⼒。
8.⽣态修复的特点1)严格遵循循环再⽣、和谐共存、整体优化、区域分异等⽣态学原理2)影响因素多⽽复杂：影响⽣命活性的因素3)多学科交叉：环境⼯程、⽣态学、物理学、化学、植物学、微⽣物学、分⼦⽣物学及栽培学等多学科.9.修复机制ν 1）污染物的⽣物吸收与富集机制ν 2）有机污染物的⽣物降解机制ν 3）有机污染物的转化机制ν 4）⽣态修复的强化机制10.⽣物富集：⽣物个体或处于同⼀营养级的许多⽣物种群，从周围环境中吸收并积累某种元素或难分解的化合物，导致⽣物体内该物质的平衡浓度超过环境中浓度的现象，⼜叫⽣物浓缩11.有机污染物的⽣物降解机制ν有机污染物⾸先通过物理沉降，形成沉淀；ν然后会被⽔中的细菌等微⽣物分解，分解为⽆机物，也就是⼀些矿质元素，这些物质⼜会被⽔中的藻类等⾃养型⽣物利⽤；ν这样有机物就被⽣物所降解了12.有机污染物的转化机制ν物理转化机制: 扩散、⼤量流动和进⼊⼤⽓中三种主要的运动⽅式；ν化学转化机制: ⽔解反应、光解反应、氧化还原反应和异构化反应13.强化机制包括：ν提⾼⽣物本⾝的修复能⼒；——反复驯化ν提⾼污染物的可⽣物利⽤性，如深层曝⽓、投⼊营养盐、投加添加剂等。
高效菌筛选方法及策略PPT课件
关键，一般采用酶解法去壁。多酶混合除壁效果较好。
影响因素：菌体前处理、菌龄、酶浓度、酶处理 温度、PH、渗透压稳定剂（不仅起保护原生质体免于 膨裂，而且还有助于酶和底物的结合。
原生质体对渗透压极其敏感，低渗引起细胞破裂。 多采用甘露醇、山梨醇、蔗糖等有机物和氯化钾和氯 化钠等无机物。稳定剂的浓度一般均在0.3-0.8mol/L 之间。
切酶只能识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使 每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开（切
割DNA分子）
作用结果：平未端及粘性未端 .
32
• 什么叫黏性末端？
被限制酶切开的DNA两条单链的切口， 带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互 补配对，这样的切口叫黏性末端。
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33
• 要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几 个切口？可产生几个黏性末端？
始于1976年，最早是在动物实验中发现的， 后来早微生物中得以应用。使细胞间基因重组 的频率大大提高了，已大于10-1 （而诱变育种 一般仅为10-6 ）。发生基因重组亲本的选择范 围更大，可以在不同种、属、科，甚至更远缘 的微生物之间进行。
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14
三. 原生质体融合
在有些情况下，两种或多种微生物在共同存
• 运载体的作用有哪些？
作用一：作为运载工具，将外源基因转移到 受体细胞中去。
作用二：利用运载体在受体细胞内，对外源 基因进行大量复制。
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38
（一）载体
基因克隆载体条件：
（1）具有能使外源DNA片段组入的克隆位 点。
（2）能携带外源DNA进入受体细胞或游离 在细胞质中进行自我复制，或整合到染色 体DNA上随DNA复制而复制。
大连理工大学2020—2021学年第2学期环境科学《环境学》期末考试试卷(附答案)
大连理工大学2020-2021学年第2学期《环境学》考试试卷（A卷）考试范围：《环境学》；满分：100分；考试时间：120分钟院/系__________学号__________注意事项：1．答题前填写好自己的姓名、班级、考号等信息一、名词解释（共6题，每题4分，共24分）1．环境效应2．热岛效应3．水体富营养化4．固化／稳定化5．环境基准6．循环经济二、简答题（共5题，每题8分，共40分）1．简述城市垃圾的类型、危害、常见处理方法及其优缺点。
2．简述污水处理生物除磷原理并举例典型生物除磷工艺。
3．土壤胶体的种类有哪些？4．转基因技术对生态环境保护有哪些影响？（正面的和反面的）5．试说明不同污染物在水体中的迁移转化规律。
三、论述题（共3题，每题12分，共36分）1．人居环境舒适的内涵？2．试根据大气污染物的迁移转化规律论述如何减轻我国普遍存在的雾霾问题?3．生态入侵的途径及其主要危害和防治方法。
大连理工大学2020-2021学年第2学期《环境学》考试试卷（A卷）【参考答案】一、名词解释（共6题，每题4分，共24分）1．环境效应是指自然过程或者人类的生产和生活活动会对环境造成污染和破坏，从而导致环境系统的结构和功能发生变化的过程。
环境效应按起因可分为自然环境效应和人为环境效应；按环境变化的性质可分为环境生物效应、环境化学效应和环境物理效应。
2．热岛效应是指由于人的活动和工业生产，使得城市温度比周围郊区温度高的现象。
一般大城市年平均气温会比郊区高0.5～1℃，产生热岛效应的原因包括：①城市蓄热量较大，水的径流快，蒸发量少，失热也少；②燃烧放出的热量多；③人口集中，由人体发出的热量较多。
3．水体富营养化是指由于大量的氮、磷、钾等元素排入到流速缓慢、更新周期长的地表水体，使藻类等水生生物大量地生长繁殖，有机物产生的速度远远超过消耗速度，水体中有机物积蓄，破坏水生生态平衡的过程。
出现富营养化现象后，水体会呈现蓝色、红色、棕色、乳白色等，这种现象在江河湖泊中称为水华，在海中称为赤潮。
基因工程菌构建流程
基因工程菌构建流程1. 目标基因的获取- 哎呀呀，这就像是在一个巨大的基因宝库中寻宝一样！比如说，我们想要构建一个能生产某种特殊蛋白质的基因工程菌，那首先得找到编码这个蛋白质的基因呀。
就好比你要找一本特定的书，你得先知道它叫啥名字，然后去书架上把它找出来！可以通过从生物基因组中提取，或者人工合成等方法来得到这个目标基因呢。
2. 载体的选择- 嘿，这载体就像是一辆小货车，得选个合适的呀！它要能把我们的目标基因安全地运送到目的地呢。
常见的载体有质粒呀等等。
就像你要运一个宝贝，得找个结实又合适的箱子来装它，不能太大也不能太小，还得保证在运输过程中不会损坏宝贝，对吧？比如我们选一个能在细菌中稳定存在的质粒来当这个“小货车”。
3. 基因与载体的连接- 哇哦，这一步可重要啦！就好像把宝贝装进箱子后，还得把箱子封好呀。
我们要把目标基因和载体连接起来，形成一个重组载体。
这就好比把钥匙插进锁孔里，得严丝合缝才行呢。
比如用特定的酶把基因和载体切好，再通过化学反应让它们连接在一起，形成一个稳定的整体。
4. 将重组载体导入受体细胞- 哈哈，这就像是把装着宝贝的箱子送到目的地一样！我们要把重组载体导入到受体细胞中，让它在里面发挥作用。
可以用一些方法，像转化呀、转染呀等等。
就好像你要把一个礼物送给别人，你得想办法让它到达那个人手里呀。
比如说用氯化钙处理细菌，让细菌更容易接受重组载体。
5. 筛选含有重组载体的受体细胞- 哟呵，这可不能马虎呀！我们得从一堆细胞中找出那些成功接收了我们的重组载体的细胞呢。
这就像在一堆苹果中找出那个最红最大的一样。
可以通过一些标记呀、抗性呀等等来筛选。
比如说我们的载体上带有一个抗生素抗性基因，那能在含有这种抗生素的培养基上生长的细胞，很可能就是我们要找的含有重组载体的细胞啦。
6. 培养和鉴定基因工程菌- 哈哈，最后一步啦！我们要把筛选出来的细胞培养起来，让它们大量繁殖，成为我们的基因工程菌。
还要对它们进行鉴定，看看是不是真的符合我们的要求呢。
环境生物修复中高效基因工程菌的构建策略
工 程 降 粹 茸的 构 建 革略 ， 包括 重 组 污 染 物 降 粹 基 因 以优 化 污染 物 降 粹 途 径 、 组 污染 物撮 八 相 关 基 因 以 重
致 善 对 污 染 物 的 生 物 可利 用性 和 重 组环 境 不利 固子 抵 抗 基 因飒 增 强 其环 境 适 应 性 等 ．
文章 编 号 ： ０ ８ ９ ０ （ ０ ２ ０ ２ ８ ０ １ ０ —２ ９ ２ ０ ） ２ ０ ０ ５
环 境 生物修 复 中高效 基 因工程菌 的构 建策 略
刘 和 ．陈 英 旭
＜ 江 大 学 环 境 工程 系 ．浙 江 杭州 ３ ０ ２ 浙 １０９
摘
要 ： 过 对 环 境 污 染 物 的 生物 降粹 机 制 厦 妨 碍 污 染 物 降 粹 的 因素 进 行 分 析 ， 出 了几 种 高 效 基 因 通 提
Ｚ ｅｉｎ ｉｅｓｔ （ ｒｃ ｆ ｉ ） ０ ２ ２ （ ） ０ — １ ｂ ｊ ｇＵｎ ｖ ｒｉ Ａｇ ｉ．Ｂ Ｌｉ ２ ａ ｙ ｅ％ ．２ ０ ８ ２ ２ ８ ２ ２
Ａｂ ｔ ａ ｔ ｓ ｒ ｃ ：Ｇｅ ｅ ｉａ ｌ ｎ ｉ ｅ ｒ ｄ ｂ ｃ ｅ ｉ ｈ ｌ ｒ ｍｉ ｉｇ ｐ ｔ ｎ ｉ ｌ ｎ ｔ ｅ ｆ ｔ ｒ ｐｐ ｉ ｔ ｎ ｆ ｉ ｒ ｍｅ ｎ ｔ ｌ ｅ ｇｎ ｅ ｅ ａ ｔ ｒａ ｏ ｄ ｐ ｏ ｓ ｎ ｏ ｅ ｔａ ｉ ｈ ｕ ｕ ｅ ａ ｌ ａ ｉ ｓｏ ｏ ｅ — ｃ ｙ ｃ ｏ ｂ ｄ ａ ｉ ｎ Ｔｈ ｓ ｐ ｐ ｒ ｐ ｅ ｅ ｔ ｅ ｅ ａ ｏ ｓ ｒ ｃ ｉ ｎ ｓ ｒ ｔ ｇ ｅ ｆ ｇ ｎ ｔ ａ ｌ ｎ ｉ ｅ ｒ ｄ ｂ ｃｅ ｉ ｏ ｈ ｉｔ ． ｏ ｉ ａ ｅ ｒ ｓ ｎ ｓ ｓ ｖ ｒ ｌｃ ｎ ｔ ｕ ｔｏ ｔ ａ ｅ ｉｓ ｏ ｅ ｅ ｉ ｌ ｅ ｇ ｎ ｅ ｅ ａ ｔ ｒａ ｆ ｒ ｔ ｅ ｃ ｙ ｂｏ ｅ ｄ ａ ｉ ｎ ｐ ｒ ｏ ｅ ｔ ｒ ｕ ｈ ａ ａ ｙ ｉ ｇ ｔ ｅ ｂ ｏ ｒ ｄ ｔ ｎ ｍｅ ｈ ｎ ｓ ｆ ｐ １ ｔ ｎ ｓ ａ ｄ ｅ ｃ ｍｂ ｒ ｉ ｒ ｍｅ ｉｔ ｕ ｐ ｓ ｈ ｏ ｇ ｎ ｌ ｚｎ ｈ ｄ ｇ ａ ａ ｌ ｃ ａ ｉ ｍｓ ｏ ｏ ］ ａ ｔ ｎ ｎ ｕ ｅ ｏ Ｌ ０ ｕ ｉｇ ｆ ｃ ｏ ｓ ｆ ｒｅ ｆ ａ ｙｏ ｉｄ ｇ ａ ａ ｉ ｎ ｎ ａ ｔ ｒ ｏ ｆｉ ｃ ｆｂｏ ｅ ｒ ｄ ｔ ．Ｔｈ ｓ ｔ ａ ｅ ｉｓ ｉ ｃｕ ｅ ｏ ｔｍｉ ａ ｉｎ ｏ ｈ ｅ ｒ ｄ ｔｏ ａ ｈ ｃ ｏ ｅ ｅ ｓ ｒ ｔ ｇ ｅ ｎ ｌ ｄ ｐ ｉ ｚ ｔ ｆｔ ｅ ｄ ｇ ａ ａ ［ ｎ ｐ ｔ ｏ ｗａ ｓ ｍｐ ｏ ｅ ｎ ｆｔ ｅ ｂ ｏ ｖ ｉ ｂｌ ｙ ｔ ｏ ｌ ｔ ｎ ｓ ａ ｄ ｅ ｈ ｎ ｅ ｎ ｆｔ ｅ ａ ｉ ｔ ｓ ｏ ｏ ｅ ａ ｃ ｏ ｙ ，ｉ ｒ ｖ ｍｅ ｔｏ ｈ ｉａ ａ ｌ ｉ ｔ ｏ ｐ ｌ ａ ｔ ｎ ｎ ａ ｃ ｍｅ ｔｏ ｈ ｂ ｌ ｉ ｆｔ ｌ ｒ ｎ ｅ ｔ ａ ｉ ｕ ｉｅ ｔ ｅ ｅ ｖｒ ｎ ｉ ｎ ａ ｈ ｇ ｒ ｏ ｓ ｆｃ ０ ｓ ｈ Ⅱ ｉｏ ｈ ｅ ｔ １ ａ ａ ｄ ｕ 自 ｔ ｒ ．
高效微生物富集培养基的开发及应用
高效微生物富集培养基的开发及应用一、高效微生物富集培养基的开发背景与重要性随着现代生物技术的发展，微生物在各个领域的应用越来越广泛，包括但不限于医药、农业、环保等。
微生物的高效培养是实现其应用潜力的关键步骤。
高效微生物富集培养基的开发，能够为微生物提供适宜的生长环境，促进其快速繁殖和代谢，从而提高生产效率和产品质量。
开发高效微生物富集培养基的重要性体现在以下几个方面：1. 提高微生物的生物转化效率：通过优化培养基的营养成分，可以提高微生物的生物转化效率，加速目标产物的合成。
2. 促进微生物多样性的开发：不同的微生物对培养基的要求不同，开发多样化的培养基可以满足不同微生物的生长需求，促进微生物多样性的开发。
3. 增强微生物的适应性和稳定性：通过培养基的优化，可以提高微生物对环境变化的适应性，增强其在工业生产中的稳定性。
4. 降低生产成本：通过提高微生物的生长速率和代谢效率，可以减少培养时间和原料消耗，从而降低生产成本。
二、高效微生物富集培养基的开发策略开发高效微生物富集培养基是一个系统工程，需要综合考虑微生物的生理特性、生长环境和目标产物的合成途径。
以下是开发高效微生物富集培养基的主要策略：1. 营养成分的优化：根据微生物的代谢需求，合理搭配碳源、氮源、矿物质和维生素等营养成分，以满足微生物生长和代谢的需要。
2. 培养条件的调控：通过控制温度、pH值、氧气供应等培养条件，为微生物提供适宜的生长环境。
3. 培养基的固体化：对于某些需要附着生长的微生物，可以通过固体化培养基来提供附着表面，促进其生长。
4. 培养基的动态化：通过动态化培养基，模拟微生物在自然环境中的动态生长条件，提高其适应性和代谢活性。
5. 利用生物信息学工具：利用生物信息学工具分析微生物的基因组和代谢途径，指导培养基的设计与优化。
三、高效微生物富集培养基的应用实例高效微生物富集培养基的开发和应用已经在多个领域取得了显著的成果。
以下是一些应用实例：1. 抗生素的生产：通过优化培养基，可以提高抗生素产生菌的生长速率和代谢效率，从而增加抗生素的产量。
生物催化和细胞工程在环境修复中的应用
生物催化和细胞工程在环境修复中的应用环境污染已成为全球性的难题，如何进行有效的环境修复，已经成为社会各界共同关注的问题。
传统的环境修复方法，比如物理修复、化学修复等，虽然有一定的效果，但往往需要大量的投入，费用高昂，而且有时还会产生二次污染的风险。
因此，越来越多的科学家们开始将生物学的技术引入环境修复领域，其中生物催化和细胞工程技术的应用尤为广泛。
一、生物催化技术在环境修复中的应用生物催化技术是指利用微生物、酶等天然生物催化剂，在特定条件下，促进环境污染物的转化、分解、降解等过程，从而达到环境修复的目的。
生物催化技术具有低成本、高效性、环保等优点，在环境修复领域被广泛应用。
1. 微生物在环境修复中的应用微生物是一种天然的生物催化剂，在环境修复中有着广泛的应用。
比如，在油污染的环境中，可以利用石油分解菌、硫酸盐还原菌等微生物降解石油，使其变成无害的化合物，从而达到治理油污染的效果。
此外，微生物还可以用来修复有机废水、重金属污染等环境问题。
2. 酶在环境修复中的应用酶是一种高效的生物催化剂。
在环境修复中，可以利用酶促进污染物的降解。
比如，利用脲酶降解印染废水中的染料，可以使得废水中的染料降解，从而达到处理废水的效果。
二、细胞工程技术在环境修复中的应用细胞工程技术是将基因工程、细胞生物学等学科的知识综合应用于细胞领域的一种技术。
通过对细胞内部的代谢途径、代谢产物等进行改造，从而达到对环境的修复的目的。
细胞工程技术可以应用于有机废水、重金属污染等环境问题的修复。
1. 基因工程在环境修复中的应用基因工程可以利用生物的天然代谢途径，对污染物进行降解。
通过对基因的改造，可以使得细胞具有更高的降解污染物能力和更好的稳定性，从而可以更好地完成环境修复的工作。
2. 细胞生物学在环境修复中的应用细胞生物学借助现代技术的手段，可以研究细胞的生物过程、代谢途径等，并通过改造细胞的代谢途径和产物，来达到修复环境的目的。
比如，利用细胞工程技术对电池废液进行生物处理，可以降解废液中的污染物，从而达到环境修复的效果。
生物基因技术在环境修复中的应用
生物基因技术在环境修复中的应用随着人类社会的不断进步，环境问题愈发引起人们的关注。
污染、气候变化等问题已经成为人们必须面对的问题。
其中，污染更是损害环境和人类的健康的主要原因。
环境污染会对水、土壤、空气造成不同程度的危害，导致生态平衡的失衡，限制了人类的健康和发展。
如何解决环境污染已经成为人们必须面对的问题。
其中，生物基因技术是一种备受关注的环境修复技术。
一、什么是生物基因技术生物基因技术是指运用现代基因技术的方法对生物体的遗传基因进行调整和改造，从而创造出能够满足特定需求的生物体种类。
常见的生物基因技术包括基因克隆技术、基因敲除技术、基因编辑技术等。
这些技术可以被用于培育耐病、高产、抗逆生物种类，用于食品生产、医学领域以及环境修复领域等。
二、随着环境污染问题的加剧，环境修复已经成为了一个迫切的需求。
生物基因技术是一种比较有效的环境修复技术。
一些生物种类能够通过基因工程来增加其对环境污染物的吸收能力，将毒害物质转化为无害物质，并对生态系统进行修复。
例如，一些环境污染物的分解转化需要微生物的介入，比如石油、农药等。
然而，有些环境中这些微生物不足，或者存在的微生物株功能相对较弱，难以起到有效的作用。
这时候，研究人员可以通过利用生物基因技术，将高活性的微生物菌株与废弃物的处理结合起来，利用嫁接、转化或定向进化等技术方法，培育更适合生态修复的菌株。
这些菌株通过代谢和酶的作用，可以高效地将有毒有害物质转化为无毒无害的物质，达到生态修复的目的。
再例如，一些污水处理设备对特定化合物的去除效率很低，导致水质不能满足排放标准。
生物基因技术可以通过改变微生物复合菌群的组成，提高菌株数量及具有去除污染物性质的菌株，从而增强处理污水的效率。
因此，生物基因技术的应用可以有利于优化水资源的利用和保护环境健康。
三、生物基因技术在环境修复的不足虽然生物基因技术的应用在环境修复方面具有一些优点，但是其仍然存在一定的不足。
首先，生物基因技术的应用场景比较有限，只能在处理某些特定的废弃物及有毒物质时取得比较理想的效果。
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浙江大学学报 (农业与生命科学版 28(2 :208~212, 2002Journal of Zhej i ang Un iversity (A gric 1&L ife Sci 1收稿日期 :2001204202基金项目 :浙江省科学技术厅重点资助项目 (001103258 作者简介 :刘和 (1974- , 男 , 江西吉安人 , 博士生 , 主要从事环境生物技术的研究 .文章编号 :100829209(2002 022*******环境生物修复中高效基因工程菌的构建策略刘和 , 陈英旭(浙江大学环境工程系 , 浙江杭州 310029摘要 :通过对环境污染物的生物降解机制及妨碍污染物降解的因素进行分析 , 提出了几种高效基因工程降解菌的构建策略 , 包括重组污染物降解基因以优化污染物降解途径、重组污染物摄入相关基因以改善对污染物的生物可利用性和重组环境不利因子抵抗基因以增强其环境适应性等Λ关键词 :生物修复 ; 基因工程菌 ; 污染物降解基因 ; 中图分类号 :X 502文献标识码 :AL I U H e , CH EN Y ing 2(t . E ng ineering , Z hej iang U niv . , H ang z hou 310029, Ch inaCon ies genetically eng i neered bacter i a for env ironm en t biore m edi ation . Journal of Zhejiang U (A gric 1&L ife Sci 1 , 2002, 28(2 :2082212Abstract :Genetically engineered bacteria ho ld p rom ising po tential in the future app licati ons of bi o rem e 2diati on . T h is paper p resents several constructi on strategies of genetically engineered bacteria fo r the bi o rem ediati on purpo se th roughanalyzing the bi odegradati on m echanis m s of po llutants and encum ber 2ing facto rs fo r efficacy of bi odegradati on . T hese strategies include op ti m izati on of the degradati on path 2w ays , i m p rovem ent of the bi oavailability to po llutants and enhancem ent of the abilities of to lerance to the environm ental hazardous facto rs .Key words :bi o rem ediati on ; genetically engineered bacterium ; po llutant catabo lic gene ; environm entalbi o techno logy受污染环境的生物修复技术是一项蓬勃发展的环境污染治理技术 , 因其对受污染环境的生态风险小、费用低廉而日益引起各国政府部门和环境科学研究者的关注Λ微生物丰富的生物多样性决定了其代谢类型与污染物降解途径的广泛多样 , 因此在实际中得到了更多的应用Λ然而受微生物对污染物特别是难降解污染物的降解能力所限 , 生物修复技术具有修复周期长的明显缺点 , 阻碍了这一技术在现实中的发展和应用Λ构建高效的基因工程菌可以显著提高污染物的降解效率 [1], 它为解决生物修复周期长等问题提供了崭新的途径Λ环境微生物尤其是细菌中的污染物降解基因、降解途径等许多污染物降解机制的阐明为构建具有高效降解性能的污染物降解基因工程菌提供了可能[2]Λ本文通过对污染物生物降解机制以及阻碍污染物降解的相关因素进行分析 , 提出几种高效基因工程菌的构建策略Λ1优化污染物的降解途径1. 1重组互补代谢途径有机污染物在降解菌编码的一系列酶催化作用下 , 逐步从复杂大分子化合物降解成简单的无机小分子化合物Λ一些难降解有机污染物特别是人工合成化合物 (xenob i o tics 还需要不同降解菌之间的协同代谢或经共代谢等复杂机制才能最终得以降解 , 这无疑降低了污染物的降解效率Λ因为污染物代谢产物在不同降解菌间的跨膜转运是耗能过程 , 对细菌来说这是一种不经济的营养方式Λ另外 , 某些污染物的中间代谢产物可能具有毒性或对代谢活性有抑制作用 , 如不能被迅速代谢利用 ,谢过程产生抑制作用Λ菌降解污染物的种类、在显著差异 ,重组 ,途径组合起来以构建具有特殊降解功能的超级降解菌 , 可以有效地提高微生物的降解能力 , 从而提高生物修复效率Λ近年来 , 随着对污染物降解机理的逐步阐明及分子生物学实验手段的飞速发展 , 运用污染物互补降解途径重组策略已构建出越来越多的超级降解工程菌Λ多氯联苯 (PCB s 是自然环境中广泛存在的一类难降解污染物ΛPCB s 在好氧条件下通过细菌 bp h A 基因编码的联苯双加氧酶催化联苯裂解 , 生成氯代苯甲酸 (CBA 以及异戊二烯酸Λ后者最终降解成 CO 2和 H 2O , 但细菌对 CBA 因缺乏相应的降解基因而不能继续降解Λ由于 CBA 对联苯双加氧酶具有强烈的抑制作用 , 使整个 PCB s 的降解效率显著降低Λ与此同时 , 某些细菌中发现的脱卤素基因 , 如 P seud o m onas aerug inosa 142中的 ohb 以及 A rth robacter g lobif or m is KZT 1中的 f cb 等 , 它们能迅速脱除 CBA 上的氯 , 使 CBA 顺利进入后续降解步骤 , 同时也解除了 CBA 对整个降解途径的抑制作用Λ因此用脱卤素基因和bp h 基因构建的重组体 bp h ∷ ohb 弥补了 PCB 的代谢缺陷Λ实际上 , 自然界细菌在污染物的选择压力下相互间的同源基因也存在着遗传交换和重组 , 以形成新的污染物降解途径 , 但是概率极低Λ运用互补代谢途径重组策略可以极大地扩展细菌的污染物降解范围以及增强细菌对污染物特别是难降解污染物的降解能力 , 这对于提高生物修复的效率无疑具有重要意义Λ1. 2改变污染物代谢产物流向污染物降解过程中由于抑制性中间代谢产(end 2p p,Λ, 使抑制性中间产物不生成或尽快转化 , 从而提高污染物降解效率Λ例如 , 苯、甲苯、二甲苯 (B TX 是环境中常见的石油化工污染物 , 它们单独存在时被细菌通过 TOL 或 TOD 两种途径降解 , 但两种途径都存在缺陷 :TOD 途径中 , 二甲苯降解产生的中间产物 3, 62二甲基邻苯二酚是一截止式代谢产物 (dead 2end p roduct , 因不能被后续的加氧酶识别而导致二甲苯降解不完全Λ而在 TOL 途径中 , 降解 B TX 的 P . p u tid a m t 22菌体内不存在识别苯的加氧酶 , 致使苯不能被降解而在环境中积累Λ然而研究发现 , P . p u tid a m t 22菌体内的对甲基苯甲酸脱氢酶能识别 TOD 途径中经甲苯双加氧酶催化苯降解产生的二羟基二氢对二甲苯 , 使之得以完全降解Λ因此 , 可以通过将 TOD 途径中编码甲苯双加氧酶的基因转移到P . p u tid a 的 TOL 途径中 , 利用 TOL 途径中的脱氢酶来催化 TOD 途径中生成的二羟基二氢对甲苯 , 使二甲苯不再进入 3, 62二甲基邻苯二酚途径Λ这样通过TOL 和 TOD 途径整合到一起 , 污染物降解前段利用 TOD 途径 , 后段利用 TOL 途径 , 通过改变污染物的代谢流向而将 B TX 完全降解 (见图 1所示Λ902第 2期刘和 , 陈英旭环境生物修复中高效基因工程菌的构建策略图中实线表示 TOL 途径 , 虚线表示 TOD 途径 , 箭头上的横截线分别表示TOL 和TOD Λ缩写说明 :TDO :甲苯双加氧酶 ; BCG :顺式 21, 22二羟基 21, 22二氢苯 ; XCG :顺式 21, 22二羟基 21, 22XO :二甲苯氧化酶 ; BADH :苯甲醇脱氢酶 ; BALDH :苯甲醛脱氢酶 ; BA :苯甲酸 ; :; ; BA CG:顺式 22, 32二羟基 22, 32二氢苯甲酸 ; TA CG:顺式 22, 322TA CGDH:顺式 22, 32二羟基 22, 32二氢对甲基苯甲酸脱氢酶 ; CTL :邻苯二酚 ; 42M ::22, 32双加氧酶图 F ig . BTX degradati on pathw ay1. 3 DNA (DNA shuffling 最早是由 Stemm er 提出的一项对蛋白质进行人工体外快速定向进化的方法[3]Λ常规的 PCR 中 , 需要设计特定的引物对选定的DNA 片段进行扩增Λ然而 , DNA 体外随机拼接技术既依赖于 PCR , 又不同于传统的 PCR 技术Λ这一 DNA构建策略可以简单概括为重组、扩增、筛选三个阶段 , 以上步骤反复进行直至得到所希望的重组酶蛋白Λ其一般过程是将一组不同来源的基因 DNA 或来自同一基因不同突变体的 DNA 经 DNA 酶随机切割消化 , 获得 DNA 随机酶切片段混合体 , 以此混合体在不加引物的情况下进行 PCR 扩增ΛDNA 酶切割的 DNA 片段因相互间的同源性进行随机互补 , 并以此为引物 , 经 PCR 扩增 , DNA 分子复制 , 从而获得大量 DNA 不同区域间的随机重组的新 DNA 突变体Λ完成这一 PCR 随机扩增后 , 再加入特定引物进行最后的 PCR 扩增 , 便可获得全长基因的 PCR 产物Λ将 PCR 产物在寄主细胞中表达 , 筛选出理想的突变体 , 如此多次循环Λ由于同源基因 DNA 体外随机拼接是一项效率极高的 DNA 重组技术 , 它能够在极短的时间内筛选出所需要的 DNA 重组蛋白 , 因此这一技术又被称为蛋白质定向进化技术Λ这一先进的 DNA 重组策略可以运用于污染物降解基因的重组Λ双加氧酶是细菌体内广泛存在的一类多组分复合酶 , 它们通过将两个氧原子激活、加合到苯环上的方式活化苯环 , 使其进入后续的裂解开环步骤Λ由于双加氧酶是催化芳香化合物降解的一系列酶中最重要的酶之一 , 它对底物的选择特异性决定了细菌对污染物的降解范围 , 它对底物的降解效率很大程度上决定了芳香化合物的降解速率Λ因此 , 双加氧酶编码基因应该是 DNA 随机拼接技术的理想材料ΛB u rkhord eria cep acia LB 400和 P . p seud oa l 2ca lig enes KF 707是两株降解性能迥异的 PCB 降解菌 , 前者的污染物选择范围宽于后者 , 而后者则对 PCB 同系物中的某些污染物具有更高的降解效率Λ尽管如此 , 它们的PCB 双加氧酶编码基因 bp h A 1却具有极高的同源性 , 运用 DNA 随机拼接策略将两株菌的 bp h A 1基因重组 , 筛选后得到的双加氧酶重组体不但具有更高的降解活性 , 而且还能降解一些其亲本双加012浙江大学学报 (农业与生命科学版第 28卷氧酶所不能降解的苯和甲苯类单环芳香化合物[4]Λ2提高污染物生物可利用性2. 1重组表面活性剂编码基因污染物的生物可利用性与生物修复效果密切相关ΛBo s m a 等人认为污染物的生物可利用性在多数情况下决定了生物修复的可行性及修复效率[5]Λ尽管目前的研究结果不尽一致 , 但是普遍认为 , 表面活性剂能通过改善疏水性化合物的水溶性和表面张力等理化性质而提高其生物可利用性Λ而生物表面活性剂由于具有高表面活性、对热和 pH 值波动的稳定性好、低毒性和生物可降解性而比化学表面活性剂有着更广泛的应有优势Λ但由于生物表面活性剂的生产得率较低 , 因此现在的趋势是利用基因工程的量Λ, 这些工程Λ而提高污染物生物可利用性的另一途径是直接对污染物降解基因和表面活性剂编码基因进行重组 , 然后转化到合适的宿主菌中表达Λ如将从R hod ococcus ery th rop olis IGT S 8分离得到的脱硫基因 d sz 转化到产生鼠李糖脂的假单胞菌中可使构建的工程菌的生物脱硫效率明显提高[6]Λ2. 2重组污染物跨膜转运基因污染物降解速度还与微生物细胞对污染物的摄取速率有关 , 提高污染物的摄取速度有助于提高污染物的降解速度Λ例如 , 许多芳香烃类化合物进入降解细菌内部需要依靠细胞膜上的透性酶载体蛋白 , 这类酶蛋白不但对不同的底物具有特异性 , 甚至对化合物分子的空间构象也有选择性Λ因此将这些膜转运蛋白编码基因重组到污染物降解菌中可以提高其对污染物的摄取效率Λ另外 , P . p u tid a 的 42羟基苯甲酸转运蛋白 Pcak 还具有生物趋化作用Λ某些降解细菌中质粒编码的膜转运蛋白 N ahY 对细菌的降解底物萘也有趋化作用[7]Λ这些特殊的生物学现象的发现及其机理的阐明将为构建此类基因工程菌提供坚实的理论基础Λ3增强细菌的环境适应性3. 1增强细菌的抗毒能力污染物降解菌在生物修复应用中要充分发挥降解性能就必须提高其对环境毒物的抵抗能力Λ许多芳香烃类污染物由于具有高度的疏水性而易在细菌细胞膜的脂质层积累 , 对细菌产生毒性Λ通过对此类化合物具有高度耐受性的细菌细胞膜结构进行研究后发现 , 构成细胞膜脂质双层的脂肪酸空间构象全部由顺式转变成反式结构 , ,, :细胞内这些耐受机制促使细菌在高浓度芳香烃类污染环境下得以生存Λ由于以上抗毒机制的相关编码基因已经得到分离 , 因此将污染物降解基因转入到此类细菌中可构建出对有毒污染物具有更强耐受力的基因工程菌 , 这将是提高细菌降解能力的有效途径Λ3. 2增强细菌的放射线耐受性许多微生物对放射线具有耐受性 , 但目前分离到的放射线耐受菌多属产芽孢菌 , 而且很多还是致病菌 , 因而限制了它们的应用Λ对D einococcaceae 属细菌的研究发现 , 它们具有一些与众不同的特性 , 如繁殖体也具有高活度放射线耐受性 , 基因在不发生突变的前提下可完整地表达 , 无致病性 , 易分离培养等 , 这些特性使其成为最有希望用于放射性环境下进行生物修复的细菌Λ因此 , 将污染物降解基因转化到这类菌体中便有可能构建出耐受放射环境的污染物降解菌Λ将 P . p u tid a 中分离得到的甲苯双加氧酶基因 tod C 1C 2A 转移到 D . rad iod u rans 中 , 构建的工程菌能在高放射性压力下降解甲苯、氯苯以及3, 42二氯丁烯[8]Λ另外 , 将编码汞离子还原酶的 m er A 基因转化 D . rad iod u rans 得到的细菌可在 6000rad h 的放射环境下将浓度极高的(30~50Λm o l L H g 2+转化成无 112第 2期刘和 , 陈英旭环境生物修复中高效基因工程菌的构建策略毒、易挥发性的H g 0+[9]Λ与此类似 , 一些其它的耐受重金属环境及极寒或极热环境条件的相关编码基因也被克隆分离出来 , 将这些基因与污染物降解基因重组可得到耐极端环境条件的污染物降解菌 , 这一构建策略为极端环境条件下的生物修复提供了可能Λ致谢 :感谢白晓慧博士在本文完成过程中提供的帮助ΛReferences :[1] L aw rence P W , N eil C B . 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N a t . , 18:85290.最近 , 浙江大学农业与生物技术学院教授周雪平等先后发现和命名了两种植物新病毒 , 这是为数不多的由我国科技工作者独立发现和命名的植物新病毒Λ据了解 , 周雪平等在对植物 DNA 病毒研究中 , 在云南烟草上分离了多种病毒分离物 , 经生物学、血清学及病毒基因组全序列测定 , 从中发现了两种新病毒 , 遂分别命名为云南烟草曲叶病毒 (Tobacco leaf curl Yunnan V irus 和烟草曲基病毒(Tobacco curly shoo t V irus Λ有关结果已先后在《 A rch ives of V iro logy 》和《科学通报》上发表Λ据介绍 , 周雪平等曾于 1997年在国际上首次发现植物DNA 病毒基因组重组可产生新病毒 , 有关研究结果在国际上引起了广泛关注Λ目前 , 他们正在继续开展植物 DNA 病毒基因组结构、功能及致病机理研究Λ该项研究得到国家杰出青年基金的资助Λ——本刊编辑室 212浙江大学学报 (农业与生命科学版第 28卷。