放线菌新种分类鉴定-文档资料

放线菌新种分离鉴定
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实验目的
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实验方法
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实验结果
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总结
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1、实验目的
本实验通过对分离得到的放线菌新种从形态学、 生理生化反应特征、和分子遗传分类学方面进行鉴 定，证明其是以前从未发现的新种。
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2、实验方法
2.1 分离方法 2.2 16SrRNA基因序列测定
温度耐受实验
➢将菌株接种在高氏一号培养基上，分别在4℃、10 ℃ 、16 ℃ 、20 ℃ 、 28℃、37℃、45℃培养，每周观察一次，四周结束，重复2次。
盐耐受实验
➢高氏一号培养基内加入不同浓度的NaCI(l%，3%，5%，7%，10%，15% ，20%)28℃培养，每周观察一次，四周结束，重复2次。
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2.3.2 化学分类
A
细胞壁化学组分
B
磷酸类脂测定
C
甲基萘醌测定
D
脂肪酸测定
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A.细胞壁化学组分
➢放线菌的细胞壁主要成分为肽聚糖，根据肽聚糖 分子中肽链第3位氨基酸的种类，种间肽桥和邻近的 四肽交联的位置来决定放线菌细胞壁型的划分。
➢Lechevalier等（1976）根据放线菌细胞壁的化学组 分和全细胞水解液糖型，将放线菌归为9个主要类群 和4个糖型。
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c. 淀粉水解
➢将菌株点种在淀粉琼脂平板上，待菌落生长良好时， 在菌落周围滴加碘液检测淀粉水解酶活性的强弱。 ➢滴加碘液后培养皿背景呈蓝黑色,菌落四周若不变色， 或移开菌落后滴加新碘液，菌落下得培养基仍不变色， 表示淀粉水解阴性；若变成透明无色则为阳性，说明 产生淀粉酶水解淀粉。
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2.3.1 表观特征
A
电镜观察
B
培养特征
C 生理生化特征
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A. 电镜
➢取菌体后,3%戊二醛固定4h, 0.1M磷酸缓冲液漂洗。 ➢酒精梯度脱水，在30%、50％、70％、80%、100％依次脱 水，其中100％酒精2次，每次10min。 ➢乙酸异戊脂置换，50%一次，100%两次。 ➢Eiko公司XD-1型二氧化碳临界点干燥器干燥，Eiko公司IB3型离子镀金仪喷金镀膜。 ➢JEOL公司JSM-840扫描电镜观察。
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B. 培养特征
➢参照国际链霉菌规划中有关放线菌的培养特征描述 所采用的标准培养基进行培养特征测定。 ➢所用培养基有:ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、察氏琼脂、 马铃薯浸汁琼脂、营养琼脂，平板接种，28℃培养7， 14，21，28d后分别观察并记录基内菌丝、气生菌丝的 生长情况及可溶性色素。
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i. 碳源利用和氮源利用（本实验利用BIOLOG板）
➢碳源：D-葡萄糖，蔗糖，L-树胶醛糖，D-果糖，D-木糖，鼠李糖， I-肌醇，棉子糖，D-甘露醇，纤维素。 ➢不加碳源的基础培养基作为阴性对照。
➢氮源: KNO3，NaNO2，尿素， (NH4)2SO4，丝氨酸，烟酰胺，酪氨 酸， DL-天冬氨酸，L-甲硫氨酸，DL-丙氨酸，L-精氨酸，L(+)-谷氨 酸，甘氨酸，L-苯丙氨酸，腺嘌呤。 ➢不同氮源按0.5%的浓度加入，培15天后，将各种氮源上的生长状况 与不加氮源的基础培养基上的生长状况作比较。
e. 牛奶凝固与胨化
➢将待测菌种接种在脱脂牛奶管中，观察牛奶凝固与胨化现象。 ➢若牛奶有凝块则为凝固，继续培养，凝固后有液体出现，进一步水解 成液体，则为胨化，一般先凝固后胨化。
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f. 硝酸盐还原试验
➢将待测菌种接在硝酸盐液体培养基中，置室温下培养，1、 3、5d取样测定。每株菌作复本，另两管作对照。 ➢培养液中加入格里氏试剂A、B液各一滴，如呈现粉红色、 玫瑰红色，表明硝酸盐还原阳性，如无红色出现，则加1， 2滴二苯胺试剂，如呈蓝色，表示培养液中仍有硝酸盐存在， 硝酸盐还原属阴性，若不呈蓝色，表示硝酸盐和亚硝酸盐 都已还原成其他物质，仍
d. 脲酶的产生
➢有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变 为碱性，酚红呈粉红色。尿素酶不是诱导酶，因为不论底物尿素是否存 在，细菌均能合成此酶。其活性最适pH为7.0。
➢挑取18~24h待试菌培养物大量穿刺接种于琼脂斜面，不要到达底部， 培养1～4d观察结果，如为阴性应继续培养一下，作最终判定，变为粉红 色为阳性。
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g. H2S的产生
➢某些细菌能分解含硫化合物如胱氨酸、甲硫氨酸而产生硫化氢 气体，若于培养基中加入柠檬酸铁铵或醋酸铵，则与硫化氢作用 生成硫化亚铁或硫化铅（黑色）沉淀。
h. 黑色素的产生
➢将供试菌株接种在酪氨酸培养基斜面管上，培养 7 d 和 14 d 观 察结果，培养基被染成褐色或者黑色即说明该菌产生黑色素。
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b. 明胶液化
➢ 取明胶培养基试管作穿刺接种，另有两支不接种作空白 对照。于28°C培养箱中培养。 ➢ 培养2、7、10、14和30天的试管，放入4°C冰箱或置于 冷水中30min，然后进行观察。 ➢ 如明胶凝块部分或全部变为可流通的液体，则明胶水解 阳性。 ➢ 如明胶凝块呈固体，则明胶水解阴性。 ➢ 若菌体未生长，可能是不能在明胶培养基上生长。
2.3 鉴定方法
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2.1 分离方法
➢近年来出现了胞外多糖胶与动孢溶液相结合的分离方法、再水化离心 法、极高频辐射法、噬菌体定向分离法和蔗糖梯度离心法等用 于稀有放线菌选择性分离的方法。
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2.2 16SrRNA基因序列测定
➢放线菌基因组的提取 ➢16SrRNA基因扩增 ➢胶回收 ➢连接 ➢转化 ➢测序研究
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C. 生理生化实验
➢生理生化特性的测定主要包括: pH、盐浓度和温度耐受性，明胶液化，淀粉水解，脲酶 的产生，牛奶胨化和凝固，硝酸盐还原，H2S的产生，黑 色素的产生，唯一碳、氮源利用等试验。
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a. pH、盐浓度和温度耐受性
pH耐受实验
➢在高氏一号培养基中分别加入pH缓冲液，空白培养基作阴性对照，28℃ 培养，每周观察一次，四周结束，重复2次。