第九章植物细胞培养物的超低温保存及种质库建立

第九章植物细胞培养物的超低温保存及种质库建立
第一节植物细胞培养物超低温保存的概念与作用
植物细胞全能性的发现和证实为植物的种质保存开辟了新的途径。

随着植物细胞工程技术的长足发展，植物细胞培养物超低温保存及种质库的建立日益引起人们的重视，并已取得明显进展。

一、植物细胞培养物超低温保存的概念
种质资源低温保存的英文名称是cryopreservation，从词义看，低温所涉及的温度范围是不确定的。

一般而言，人们将－80℃以下的低温称为超低温，干冰温度即－70℃称为极低温，低温则从4℃往下推（李广武等，1998）。

对植物而言，低温常常是指那些比常温稍低一些的温度。

目前，冷冻诱导保护性脱水的超低温保存和玻璃化处理的超低温保存是常用的植物细胞培养物超低温保存方法。

二、植物细胞培养物超低温保存的作用
1. 保持细胞培养物的遗传稳定性
在细胞培养物的不断继代培养过程中，染色体和基因会发生改变，从而引起基因型的改变，如产生多倍体、非整倍体及染色体消失和染色体易位等。

这些变化导致培养细胞全能性的丧失，即失去形态发生的潜能，或一些具有特殊产物的细胞系和具有某种抗逆性的细胞系有可能在继代培养中丢失重要的性状。

已有的研究表明，细胞培养物在液氮超低温保存中不仅能长期保持形态发生的潜能，而且还能保持遗传性状的稳定性，为细胞克隆遗传稳定性的保持提供了一种理想的方法。

2. 植物种质资源的长期保存
农业的未来取决于人类对植物种质资源的占有和利用程度，但由于农业土地的急剧开发，天然植物种质资源日益遭到严重破坏，尤其是那些稀有、珍贵和濒危植物资源。

因此，建立长期保存植物种质资源库势在必行。

由于细胞培养物能在超低温保存后再生完整的新植株，为植物种质资源的长期保存提供了一条可行而又理想的途径。

体细胞种质库的建立是植物种质资源保存的一个重要方面，因为体细胞能够在人工试管条件下大量迅速繁殖，可以节省种子保存过程中资金的耗费。

3. 农作物优良品种及亲本材料种质的长期保存
种子低温保存是防止良种衰变的一条重要途径，但需要大规模基本建设，且耗资较多。

体细胞培养物超低温保存，体积小，无需大规模基本建设，耗资少，且在低温保存后能迅速大量繁殖。

因此，超低温保存体细胞培养物是农作物优良品种及亲本种质长期保存比较经济的途径。

第二节植物材料超低温冻存的细胞学基础
植物细胞中水分约占细胞总重量的60～90％，而游离水又约占细胞水分的90％，易于冻结。

理论上讲，一般细胞外水的冻结温度为－5～－15 ℃，细胞内游离水的冻结在－25℃。

在－30 ℃时细胞几乎没有非冻结状态的游离水存在，在－100℃温度下结合水并不冻结。

根据Luyet的冻结理论（Luyet 1937），认为细胞游离水的冻结温度－30℃是细胞冻存的安全温度，作为细胞冻存两步冻结法的基础温度。

细胞超低温保存有三个重要操作步骤：一是细胞预冻；二是细胞在－196℃下长期贮存；三是细胞解冻。

第三节植物细胞超低温冻存的设备与方法
一、主要仪器设备
①用于组织培养的全套设备；
②普通电冰箱；
③－60︒C～－80︒C的低温冰箱；
④程序降温器；
⑤装材料的玻璃或塑料试管（5 mL或10 mL，要求封盖严密，不进液氮）；
⑥液氮罐；
⑦光学显微镜和紫外荧光显微镜，后者用于活细胞荧光染色观察；
⑧分光光度计。

二、基本程序
①选择生理年龄和生长状态合适的材料用于超低温保存。

②预培养。

目的是提高细胞抗寒能力，培养时间为3～4周。

包括加速传代、提高培养基渗透压和低温锻炼三个过程。

第一，加速传代以提高分裂细胞的比例。

细胞分裂时体积小，细胞内自由水含量下降，细胞的抗寒力相对提高。

第二，用甘露醇和糖等提高培养基渗透压，从而提高培养组织和细胞的渗透压以增强抗寒能力。

第三，加入脯氨酸或二甲基亚砜（DMSO）进行短期预冷处理20～60 min，然后逐渐降低温度，直至接近0︒C，进行低温锻炼。

③冷处理。

第一，保存材料的温度必须降至0︒C。

第二，加入0︒C预冷的冷冻防护剂（甘油、甘露醇、脯氨酸、糖类、二甲基亚砜等），放置30～45 min。

④慢速降温至－30︒C～－40︒C，停留1～3 h。

⑤投入液氮中－196︒C保存。

⑥保存后化冻：37︒C～40︒C水浴快速化冻。

⑦ TTC法（氯化三苯四氮唑还原法）检测细胞活力。

⑧再培养与遗传稳定性分析，即观察细胞恢复生长速度、生长量、存活率和植株再生，并进行遗传稳定性分析。

第四节植物细胞超低温保存的影响因素
1. 植物材料的选择
研究表明，植物基因型、抗冻性、器官组织和细胞的年龄以及生理状态等对超低温保存的效果影响很大；材料的种类和生理状态与冰冻保护剂、降温冰冻和化冻速度有密切关系，一种冰冻保护剂对某种材料有很好的保护效果，而对另一种材料则可能无效。

因此，应选择适宜的材料用于超低温保存，同时采取符合材料特性的各种措施，以保证超低温保存效果。

细胞组织培养物的再培养年龄明显影响超低温保存后的存活率，指数生长期和滞后期的幼龄细胞抗冻能力强，存活率高。

一般液体悬浮培养细胞以再培养5～7天为宜；固体培养基培养的愈伤组织为10～15天。

体细胞胚的超低温保存以幼龄球形胚的存活率最高，心形胚次之，子叶形胚存活率最低。

2. 材料的预处理
为使保存材料达到超低温保存所要求的生理状态，常对要保存的材料进行预处理，以促进细胞分裂与分化的同步化，减少细胞内自由水的含量，增强细胞的抗寒能力。

预处理的方法：
①调控细胞分裂与分化同步化，提高指数生长期细胞数量。

Withers等（1977）指出，
有丝分裂前或稍后的细胞抗冻能力强，处于这个时期的细胞在超低温保存后存活率高。

②将保存材料在糖浓度较高的培养基上或在加有诱导抗寒力物质或冰冻保护剂（如脱落酸、山梨醇、脯氨酸和二甲基亚砜等）培养基上预培养，提高超低温保存效果。

③低温锻炼以提高液氮保存后细胞存活率。

3. 冰冻保护剂
冰冻保护剂的类型很多，常用的有二甲基亚砜、甘油、糖和糖醇类物质、一些氨基酸、多肽及聚乙二醇等，在超低温保存过程中可以降低冰点、促进过冷却和“玻璃态化”的形成；提高溶液的粘滞性，阻止冰晶的生长；使膜物质分子重新分布，防止细胞内结冰的伤害；稳定细胞内大分子结构，尤其是膜结构，防止低温伤害。

研究认为，采用复合冰冻保护剂能显著提高超低温保存后细胞和组织的存活率。

如10% 或5% 二甲基亚砜与一定浓度的甘油或糖和糖醇结合，可明显提高超低温保存后材料的存活率。

应用复合冰冻保护剂可使各种成分的保护作用得到综合协调发展，产生累加效应，而且彼此间可以减小或消除单一成分对细胞的毒害作用。

提示：
①冰冻保护剂应该易溶于水，在适当浓度下对细胞无毒害作用，化冻后容易从组织细胞中清除。

②为了降低冰冻保护剂中某些有毒成分的毒害作用，冰冻保护剂的预处理应该在低温（0︒C）下进行，而且处理时间不宜过长，一般以30～45 min为宜。

4. 降温冰冻方法
降温冰冻方法是影响超低温保存效果的一个关键因素。

因此，用于超低温保存的材料经冰冻保护剂在0︒C预处理30～40 min后，要选择适宜的降温冰冻方法对材料立即降温冰冻，最后保存于液氮中。

目前降温冰冻方法有快速冰冻法、慢速冰冻法、两步冰冻法和逐级冰冻法。

快速冰冻法是将材料从0︒C或者其他预处理温度直接投入液氮，降温速度在每分钟1 000︒C以上。

应用该方法的关键在于，利用超速冷冻使细胞内的水分迅速通过冰晶生长的危险温度区，马上降到－196︒C的安全温度，避免细胞内结冰。

对于种子、花粉、球茎和块根等高度脱水的植物材料及茎尖分生组织，都可以采用快速冰冻法。

慢速冰冻法是以每分钟0.1︒C～10︒C的降温速度，将材料从0︒C降到－70︒C左右后，立即浸入液氮，或者以此种速度连续降到－196︒C。

采用该种方法可以使细胞内水分有充足的时间不断流到细胞外结冰，从而使细胞内水分减少到最低限度，达到良好脱水效应，避免细胞内结冰。

对于大多数植物的成熟材料而言，采用慢速冰冻法比较适宜。

两步冰冻法是将慢速冰冻法与快速冰冻法相结合的慢速冰冻法。

第一步是将材料慢速从0︒C降到一定的预冻温度，使细胞达到适当的保护性脱水；第二步是将材料迅速投入液氮中冰冻。

逐级冰冻法是制备不同等级温度的冰浴，如－10︒C、－15︒C、－23︒C、－35︒C或－40︒C等，要保存的材料在0︒C经冰冻保护剂预处理后，逐步通过这些温度，而且在每一处理温度上停留一定时间，一般4～6 min，然后迅速将材料投入液氮。

5. 化冻方法
化冻方法是影响超低温保存材料效果的又一重要因素。

适宜的化冻方法可以避免在化冻过程中产生细胞内的次生结冰，防止在化冻吸水过程中水的渗透冲击对细胞膜体系的破坏。

对大多数植物材料而言，一般采用快速化冻方法，即将液氮保存后的材料在37︒C～40︒C温水浴中化冻。

对于木本植物的冬芽，在超低温保存后必须在0︒C低温下进行慢速化冻才能达到良好效果。

化冻操作过程中应注意：①冰冻保存后的细胞或组织十分脆弱，操作时应该小心谨慎，避免机械损伤；②发现试管内冰融解，应立即将试管转移到20︒C水浴中，进行洗涤和再培养，避免热伤害作用。