氯化钴模拟法构建骨骼肌细胞缺氧模型

氯化钴模拟法构建骨骼肌细胞缺氧模型

李晰;辛世杰;王磊;宋泽;荆玉辰;曹辉;段志泉;张健

【摘要】目的观察CoCl2对体外培养的原代骨骼肌细胞的影响,探讨合理的体外化学模拟低氧模式.方法利用组织贴块法培养并鉴定原代骨骼肌细胞,给予CoCl2处理,观察不同时间和浓度细胞凋亡情况,以及通过免疫印迹及实时定量聚合酶链反应检测低氧诱导因子1α(HIF-1α)、BAX的表达变化情况.结果与对照组比

较,CoCl2处理组的细胞存活率明显下降(P＜0.05),凋亡率明显增加(P＜0.05),且骨骼肌细胞存活率下降程度及细胞凋亡率增加程度均随着氯化钴浓度增加时间延长而升高.HIF-1α、BAX蛋白水平亦随CoCl2浓度升高和时间延长而增加.结论 CoCl2对原代骨骼肌细胞的增殖凋亡及相关基因的表达成呈时间和浓度依赖性,成功建立起一种体外培养原代骨骼肌细胞缺氧诱导模型,可以作为体外研究骨骼肌缺血缺氧的良好模型.

【期刊名称】《中国医科大学学报》

【年(卷),期】2014(043)003

【总页数】4页(P265-268)

【关键词】氯化钴;骨骼肌细胞;凋亡;低氧诱导因子1α

【作者】李晰;辛世杰;王磊;宋泽;荆玉辰;曹辉;段志泉;张健

【作者单位】中国医科大学附属第一医院普外教研室血管甲状腺外科,沈阳110001;中国医科大学附属第一医院普外教研室血管甲状腺外科,沈阳110001;中国医科大学附属第一医院普外教研室血管甲状腺外科,沈阳110001;中国医科大学附属第一医院普外教研室血管甲状腺外科,沈阳110001;中国医科大学附属第一医

院普外教研室血管甲状腺外科,沈阳110001;中国医科大学附属第一医院普外教研室血管甲状腺外科,沈阳110001;中国医科大学附属第一医院普外教研室血管甲状腺外科,沈阳110001;中国医科大学附属第一医院普外教研室血管甲状腺外科,沈阳110001

【正文语种】中文

【中图分类】R654.3

下肢动脉闭塞症是常见的下肢动脉闭塞性疾病，由于下肢缺血时动脉血流减少、组织因缺血等发生不可逆性损伤。细胞坏死、萎缩和间质纤维化等导致骨骼肌损伤。目前对这种肌肉缺血性变化尚无良好的治疗方法。缺血与缺氧常常是相互伴随的，各种研究表明显示，在哺乳系统中，二氯化钴是已经被广泛应用的模拟缺氧环境的化学试剂，能够产生与缺氧缺血相似的反应［1］。因此，为了进一步探讨骨骼肌在缺血缺氧过程中变化机制，我们利用原代骨骼肌细胞在二氯化钴不同浓度和处理时间情况下研究细胞的增殖、活力、凋亡及缺氧相关反应基因的变化，以便建立一个可靠、重复性高、检测方便的骨骼肌缺氧诱导模型，为探索及防治下肢动脉硬化闭塞症奠定基础。

1.1 材料

2～3 d新生SD大鼠，雌雄不限（中国医科大学实验动物中心提供）；DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶（HyClone，美国）；α横纹肌肌动蛋白、TRITC标记的山羊抗兔IgG（博奥森，中国）；低氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）抗体、BAX抗体、GAPDH抗体（Santa Cruz公司，美国）；Real-time PCR试剂盒（TaKaRa公司，日本）；CoCl2、MTT、二甲基亚砜（Sigma，美国）。

1.2 方法

1.2.1 原代骨骼肌细胞培养：应用原代细胞培养方法，2～3 d新生SD大鼠通过机械剥离骨骼肌。骨骼肌剪碎成许多小片，放置于含10%胎牛血清的DMEM，使其贴在培养瓶表面。肌细胞从肌组织爬出，几天后相互融合。原代细胞应用含EDTA 的胰酶消化传代。以5×104密度将细胞接种于培养皿，给予氯化钴不同浓度（0、50、100、200、400 μmol/L）和不同时间（0、4、8、12、24 h）处理。

1.2.2 细胞免疫荧光鉴定：免疫荧光染色在以每孔104个细胞密度接种于24孔板。细胞经PBS清洗甲醇固定，5%BSA封闭，兔抗横纹肌肌动蛋白（1∶200）和TRITC标记的山羊抗兔IgG（1∶100）。细胞核用Hoechst 33258染色，成像使用激光共聚焦显微镜（FV1000S-SIM/IX81，Olympus）。

1.2.3 实时定量聚合酶链反应：按照日本TaKaRa公司说明书，采用Trizol处理剪碎的组织并提取总RNA，根据日本TaKaRa公司逆转录试剂盒说明书进行逆转录。应用日本TaKaRa RR420A试剂盒来研究HIF-1α的表达，反应条件为：95℃预

变性30 s；95℃5 s，60℃30 s，40个循环，HIF-1α上游引物为5′-TTGAAGATGTCCCGTTGTA-3′；下游引物为5′-GTGACTCTGGGCTTGACTCTA-3′。内参GAPDH上游引物为5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′；下游引

物为5′-ATGGTGGTGAAGACGCCA-3′。超纯水代替cDNA作为对照。PCR产物的质量监控PCR扩增后的熔融曲线分析。目的基因的表达量通过2-ΔCt方法进行统计。

1.2.4 免疫印迹：细胞在裂解液中充分裂解，于冰上静止15 min后12 000g离心30 min。蛋白含量通过紫外分光光度计检测（UV3103 PYE UNICAM），每个样本上样量40 μg，配置10%聚丙烯酰胺凝胶，煮样后电泳、PVDF膜转膜、5%脱脂牛奶封闭1 h，HIF-1α一抗（1∶100）、BAX一抗（1∶200）、GAPDH为内参（1∶1000），4℃孵育过夜。洗膜后，以二抗（1∶5 000）室温孵育，清洗后ECL发光，应用Quantity One软件计算光密度值。

1.2.5 MTT检测：MTT 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐，Sigma，美国）来检测二氯化钴（Sigma，美国）处理的肌细胞。细胞经过0.05%的胰蛋白酶消化并计数，以每孔100 μL 5 000个细胞铺至96孔板中过夜。细胞

给予氯化钴不同浓度（0、50、100、200、400 μmol/L）和不同时间（0 h、4 h、8 h、12 h、24 h），加入20 μL MTT（每毫升5 mg溶于PBS）于37℃培养4 h。随后除去培养基，每孔加入100 μL二甲基亚砜10 min，使结晶物溶解。酶标仪检测各孔OD值（检测波长570 nm）。

1.3 数据统计学分析

数据均用表示，至少3次以上独立实验，应用SPSS 19.0软件对实验数据进行单

因素方差统计分析（SPSS，Chicago，IL，美国），P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 原代骨骼肌细胞的培养及鉴定

倒置显微镜下观察原代骨骼肌细胞，培养3～4 d后开始有细胞逐渐爬出，随后开始增生，细胞逐渐延展成梭形（图1A）。细胞逐渐增多并相互融合，按一定方向呈有序排列（图1B）。我们利用横纹肌肌动蛋白进行免疫荧光染色，胞质染成红色，表明培养的为骨骼肌细胞（图1C）。

2.2 氯化钴对原代骨骼肌细胞存活及凋亡的影响

MTT结果显示，终浓度为200 μmol/L CoCl2培养不同时间后，骨骼肌细胞存活

率随着时间延长而降低；在不同浓度处理后，骨骼肌细胞的凋亡率也随着浓度的增加而增加。同样，免疫印迹发现促凋亡蛋白BAX也具有相同的趋势（图2，P＜0.05）。

2.3 氯化钴对原代骨骼肌细胞HIF-1α的影响

经200 μmol/L CoCl2处理0、4、8、12和24 h，发现HIF-1α基因和蛋白水平上逐渐升高；同样地，HIF-1 α基因和蛋白表达增高与CoCl2浓度正相关（图3、4，P＜0.05）。