酶联免疫吸附测定
酶联免疫法;酶联免疫吸附试验法
酶联免疫法;酶联免疫吸附试验法
酶联免疫法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）
是一种常用的免疫学实验技术，用于检测样本中特定蛋白质或其他
分子的存在。
酶联免疫法通过利用特异性抗体与特定抗原结合的原
理来进行检测。
这种方法的原理是将待检测的抗原或抗体与特定的
酶标记的抗体或抗原结合，然后通过酶的底物来检测酶的活性，从
而确定待检测物质的存在或浓度。
酶联免疫法主要分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间
接竞争ELISA等几种类型。
直接ELISA直接将被检测的抗原或抗体
吸附在固相载体上，然后加入与其特异性结合的酶标记的抗体或抗原，通过酶的底物来检测酶活性。
间接ELISA则是在固相载体上吸
附抗原后，再加入特异性抗体和酶标记的抗体，以增强检测的灵敏度。
竞争ELISA则是将待检测的抗原与酶标记的抗原竞争结合，通
过竞争程度来检测待检测物质的浓度。
间接竞争ELISA结合了间接ELISA和竞争ELISA的特点，可以用于检测抗体的浓度。
酶联免疫吸附试验法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种高度敏感和特异性的实验技术，广泛应用于医学诊断、生物学研究和生物制药工业等领域。
它的优点包括操作简便、成本
低廉、高通量性和可定量性等，因此被广泛用于检测疾病标志物、药物残留、植物病原体和基因工程产品等。
同时，酶联免疫法也有一些局限性，比如可能受到干扰物质的影响、需要一定的实验条件和设备等。
因此，在使用酶联免疫法时需要综合考虑其优缺点，并结合具体的实验要求来选择合适的方法和条件。
酶联免疫吸附测定技术
酶联免疫吸附测定技术酶联免疫吸附测定技术（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）是一种常用的分析方法，广泛应用于生物医学研究和临床诊断。
该技术的原理是利用特异性抗体与待测物发生特异性结合，通过酶的催化作用产生颜色反应或荧光信号，从而得到定量或半定量的结果。
下文将详细介绍ELISA的原理、反应步骤以及其应用领域。
一、ELISA的原理ELISA的原理基于抗原与抗体的特异性结合。
它包括固定期（Coating）、阻断期（Blocking）、结合期（Binding）、洗涤期（Washing）和检测期（Detection）五个关键步骤。
1. 固定期（Coating）首先，在微孔板中将待测物固定在表面，这一步又称为固相抗原法。
通常使用多糖、蛋白质等具有反应性的物质将待测物固定在微孔板上。
固定完毕后，洗去多余的待测物。
2. 阻断期（Blocking）为避免非特异性结合和降低背景干扰，需要在上一步后加入阻断缓冲液，如牛血清白蛋白（BSA）或鱼明胶等，使孔洞表面被占满，阻断非特异性吸附位点。
3. 结合期（Binding）加入待测样本和特异抗体，特异抗体可与待测物发生特异性结合，形成抗原-抗体复合物。
一般将待测物样本加入微孔板后，经过一段时间的孵育，使抗原与特异抗体发生结合。
4. 洗涤期（Washing）在结合期后，需进行洗涤步骤以去除未结合的物质。
洗涤缓冲液通常使用含有洗涤剂的磷酸盐缓冲液，洗涤次数及力度需充分保证去除干净。
5. 检测期（Detection）在洗涤期后，加入与特异抗体结合的酶标记二抗，例如辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗兔IgG。
经过孵育后，待测物与酶标记二抗形成复合物。
最后，加入底物使酶催化反应产生颜色或荧光信号。
二、ELISA的应用领域ELISA技术在生物医学研究和临床诊断中具有广泛的应用。
1. 生物医学研究ELISA被用于检测生物样本中的特定蛋白质、肽、抗体和核酸等。
酶联免疫吸附测定法
酶结合物是酶与抗体或抗原联结的产
物。具有酶促反应，显示出生物放大作用。 在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶 (horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷 酸酶(alkaline phosohatase, AP)。
酶的底物
1、HRP催化过氧化物的氧化反应。 供氢体：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB) OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，
最适吸收波长为492nm TMB经HRP作用后共产物显蓝色，用HCL或H2SO4
终止后，由蓝色呈黄色，最适吸收波长为405nm 2、AP为磷酸酯酶
一般采用对硝基苯磷酸酯(p-NPP)作为底物。产物 为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。 用NaOH终止酶反应
阳性对照品(positive control)和阴性对照品 (negative control)
实验器材和药品
固相载体在ELISA测定过程中作为吸附 剂和容器。 最常用的是聚苯乙烯和聚氯乙 烯 。它们有较强的吸附蛋白质的性能，抗 体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的 免疫学活性。 微量滴定板，量滴定板为8×12的96孔 式。ELISA板的特点是可以同时进行大量标 本的检测，并可在特制的比色计上迅速读 出结果。聚苯乙烯经射线照射后，其吸附 性增加。
阴性对照品须先行检测，确定其中不含待 测物质。
阳性对照品在含蛋白保护剂的缓冲液中加 入一定量的待检物质 ，含量约为最低检测 敏感度的10~20倍。
洗涤液 常用的稀释液为含0.05%吐温20的磷酸
盐缓冲液。
酶反应终止液
HRP反应终止液为硫酸，一般采用2mol/L
AP用NaOH终止
实验方法:
1. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于已包被之反应 孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴 性对照孔及阳性对照孔)。 2. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗 体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。 3. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的底物溶 液0.1ml，37℃10～30分钟。 4. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。 5. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果： 反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极 浅。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，以空白对照孔调 零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍， 即为阳性。
酶联免疫吸附剂测定名词解释
酶联免疫吸附剂测定名词解释
酶联免疫吸附剂测定(酶联免疫吸附剂测定,简称酶联测定)是一种用于检测生物分子浓度和活性的实验室方法,通常用于测定蛋白质、核酸、抗体等生物分子的浓度和活性。
酶联测定中,酶和吸附剂被固定在一起,形成一个酶-吸附剂复合物。
当生物分子通过这种复合物进入检测系统时,会被吸附在复合物上,并随着复合物的移动而被检测器检测到。
这种技术可以提高检测灵敏度和特异性,同时减少非特异性反应的干扰。
酶联测定中常用的吸附剂包括葡萄糖凝胶、磷酸凝胶、凝胶电泳剂等。
葡萄糖凝胶常用于检测蛋白质浓度,因为它可以吸附蛋白质,并且可以保持蛋白质的稳定性和流动性,使得蛋白质的检测更加高效和准确。
磷酸凝胶常用于检测核酸浓度和活性,因为它可以吸附核酸,并且可以提高核酸的分辨率和检测效率。
凝胶电泳则常用于检测抗体的浓度和活性,因为它可以检测抗体的特异性和灵敏度,并且可以分离和纯化抗体。
除了吸附剂和酶的选择外,酶联测定的制备和检测过程也需要一定的技术和知识。
例如,需要对吸附剂和酶进行适当的配对和融合,以保证吸附剂和酶的稳定性和活性。
还需要对检测系统进行优化和校准,以确保其准确性和可靠性。
酶联测定是一种高效、灵敏、准确的生物分子检测方法,可以用于测定多种生物分子的浓度和活性,包括蛋白质、核酸、抗体等。
随着酶联测定技术的不断发展和完善,它将成为生物学研究和实验室分析中不可或缺的工具。
酶联免疫吸附测定名词解释
酶联免疫吸附测定名词解释酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种用于检测生物样本中特定抗原或抗体的定量分析方法。
该方法结合了免疫学技术和酶学技术，可广泛应用于临床诊断、药物研发和生物学研究等领域。
ELISA的基本原理是利用特异性抗体与待测物质（抗原或抗体）结合，在固定的固相支持物上进行特异性结合。
通常情况下，ELISA方法包括四个主要步骤：涂覆、孵育、洗涤和检测。
1.涂覆：将特异性抗体或待测物质固定在微孔板的底部或其他固相材料上。
涂覆后，待测物质能够与后续加入的样本中的抗原或抗体结合。
2.孵育：将待测样本加入到涂覆好的微孔板中，样本中的抗原或抗体能够与固定在底部的特异性抗体结合。
3.洗涤：通过反复加入缓冲液并倒掉的方法，去除非特异性结合的物质，以减少干扰。
4.检测：加入与被测抗原或抗体结合的酶标记抗体，形成免疫复合物。
随后，再加入酶底物，使酶催化产生反应物。
根据反应物的产生量，可以定量测定待测物的浓度。
ELISA方法使用方便、操作简单，能够高效地进行大规模样本的处理和分析。
根据具体的检测目的和待测物质性质的不同，ELISA方法可分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA、夹心ELISA等不同类型。
此外，近年来还发展了一些改进的ELISA方法，如荧光ELISA和化学发光ELISA等。
ELISA方法在临床诊断中广泛应用，可以用于检测感染性疾病、自身免疫病、肿瘤标记物等。
此外，ELISA方法还可以用于药物研发，如筛选药物靶点、评估药物吸收、分布、代谢和排泄等。
在生物学研究中，ELISA方法可以用于分析蛋白质相互作用、表达水平的检测和鉴定、细胞因子测定等。
酶联免疫吸附实验实验报告
酶联免疫吸附实验实验报告一、实验目的酶联免疫吸附实验（ELISA）是一种常用的免疫学检测技术，本实验旨在通过实际操作，掌握 ELISA 的基本原理、操作步骤和结果分析方法，检测样本中特定抗原或抗体的含量。
二、实验原理ELISA 的基本原理是将抗原或抗体固定在固相载体（如聚苯乙烯微量反应板）表面，然后加入待测样品，使其与固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。
接着，加入酶标记的第二抗体（或抗原），形成抗原抗体酶标抗体复合物。
最后，加入底物，通过酶催化底物显色，根据显色的程度来定量或定性分析待测样品中抗原或抗体的含量。
三、实验材料与设备1、材料待测样品：＿____标准品：＿____包被抗体：＿____酶标抗体：＿____底物溶液：＿____洗涤液：＿____终止液：＿____2、设备酶标仪微量移液器恒温培养箱聚苯乙烯微量反应板四、实验步骤1、包被将包被抗体用包被缓冲液稀释至适当浓度，加入聚苯乙烯微量反应板的孔中，每孔100 μL，4℃过夜。
2、封闭次日，弃去孔内液体，用洗涤液洗涤 3 次，每次 3 分钟。
然后每孔加入200 μL 封闭液，37℃孵育 1 小时。
3、加样弃去封闭液，洗涤 3 次。
将待测样品和标准品用稀释液稀释至适当浓度，分别加入孔中，每孔100 μL，37℃孵育 1 小时。
4、加酶标抗体弃去孔内液体，洗涤 3 次。
每孔加入100 μL 酶标抗体，37℃孵育 1 小时。
5、显色弃去孔内液体，洗涤 3 次。
每孔加入100 μL 底物溶液，37℃避光孵育 15 30 分钟，直至显色明显。
6、终止反应每孔加入50 μL 终止液，终止反应。
7、测定吸光度使用酶标仪在 450 nm 波长处测定各孔的吸光度值。
五、实验结果1、标准曲线的绘制以标准品的浓度为横坐标，对应的吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
2、待测样品浓度的计算根据待测样品的吸光度值，在标准曲线上查出其对应的浓度。
六、结果分析1、准确性分析将测定结果与已知标准值进行比较，计算相对误差，评估实验的准确性。
酶联免疫吸附法标准
酶联免疫吸附法标准
酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种常用的免疫分析技术，用于检测和定量分析特定蛋白质或其它
分子的存在。
这种分析方法是基于抗原与抗体的高度特异性结合原理。
以下是酶联免疫吸附法的一般标准步骤：
1. 准备微孔板：将酶标板的孔洞涂覆有抗原或抗体，使其吸附
在微孔板上。
2. 样本处理：将待检样本经过必要的预处理，如稀释、清洗等。
3. 加入样本：将处理好的样本加入到微孔板中，使抗原或抗体
与样本中的目标物质结合。
4. 免洗步骤：根据实验需要，可能需要进行一些免洗步骤来清
除非特异性结合物质。
5. 加入检测抗体：加入检测抗体，用于与目标物质结合。
6. 再次免洗步骤：如有需要，进行免洗步骤来清除非特异性结
合物质。
7. 加入酶标记抗体：加入酶标记抗体，它与检测抗体结合形成
复合物。
8. 加入底物：加入底物，使酶作用并产生可测量的信号。
9. 反应停止：加入反应终止剂停止酶反应，停止信号产生。
10. 信号检测：使用酶标仪或其他测量设备测量底物反应产生的
信号强度。
11. 数据分析：根据标准曲线或其他定量方法，计算样品中目标
物质的浓度。
需要注意的是，ELISA的具体步骤可能会因实验目的、样品类型
等因素有所差异，以上所述仅为一般标准步骤。
酶联免疫吸附试验
技术创新：新型的酶联免疫吸附试验技术不断涌现如荧光标记技术、量子点标记技术等提高了检测的灵敏度和特异性。
市场需求：随着生物技术的不断发展酶联免疫吸附试验在临床诊断、食品安全、生物医药等领域的需求不断增长。
发展趋势：随着检测技术的不断进步酶联免疫吸附试验将朝着更快速、更准确、更自动化的方向发展。
应用领域拓展：酶联免疫吸附试验的应用领域不断拓展如肿瘤标志物检测、病毒检测、食品安全检测等为各领域的发展提供了有力支持。
荧光标记技术：提高灵敏度降低背景干扰
磁珠分离技术：快速分离抗原抗体提高试验速度
酶联免疫吸附试验在交叉学科领域的应用前景
酶联免疫吸附试验在生物医学领域的应用
酶联免疫吸附试验在环境监测领域的应用
酶联免疫吸附试验在农业科技领域的应用
酶联免疫吸附试验在食品安全检测领域的应用
酶联免疫吸附试验的市场需求与发展趋势
联合检测：将酶联免疫吸附试验与其他检测方法相结合提高检测的灵敏度和特异性。
标准化和规范化：建立酶联免疫吸附试验的标准化和规范化操作流程确保试验结果的准确性和可靠性。
酶联免疫吸附试验的发展趋势
PRT SIX
酶联免疫吸附试验的技术创新与突破
自动化技术：提高试验效率降低人为误差
微孔板技术：简化操作减少样本用量
PRT TWO
酶联免疫吸附试验的定义
酶联免疫吸附试验是一种常用的免疫分析技术
通过酶与抗体或抗原的结合实现对目标分子的定量或定性检测
酶可以放大信号提高检测的灵敏度和特异性
酶联免疫吸附试验广泛应用于生物学、医学等领域
酶联免疫吸附试验的原理
洗涤去除未结合的成分后加入底物显色通过颜色反应判断待测物的浓度。
阻断酶联免疫吸附试验：将抗体先固定在固相载体上再用酶标记的抗原进行检测最后加入底物显色。
酶联免疫吸附实验ppt课件
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第四.五部分: 注意事项(1)
1、手工洗板时，甩尽孔内液体，每孔加洗涤 液350μl，静止30秒后甩尽液体，在厚迭吸 水纸上拍干，洗4次。
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工作液 100ul/孔，封住板孔， 37℃孵育60分钟。
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第四.三部分: 实验方法和步骤
9、洗板4次。 10 、除空白孔外，加入1：100稀释的酶结合
工作液(100 ul/孔).封住板孔, 37℃孵育30分 钟. 11 、洗板4次. 12、各孔加入显色剂100 ul/孔,避光37℃孵育 10-20分钟。 13、各孔加入终止液100ul/孔,混匀后即刻测 A450值(5分钟内)。15ຫໍສະໝຸດ 第四.三部分: 实验方法和步骤
5、从密封袋中取出所需板条，其它板条密封放回 4℃
6、除空白孔外，分别将不同浓度标准品/标本100ul/ 孔加入板条的相应孔中，标准品和标本应作双复 孔或三复孔。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育 90分钟。
7、洗板4次。 8、除空白孔外，加入1:100稀释的生物素化抗体(2a)
• 2、将浓缩洗涤液（4）用双蒸水稀释(1:20)。未 用完的放回4℃。
• 3、标准品:以标准品/标本稀释液(1b)1.0ml复溶冻 干标准品(1a), 静置15分钟后混匀，按说明稀释至 所需浓度，再进行倍比稀释至所需浓度。未用完 的复溶标准品放入-20℃保存, 稀释的标准品不应 重复使用。
• 4、可根据实际情况，将标本做适当倍数稀释(可 做预实验，以确定稀释倍数)。
酶联免疫吸附剂测定名词解释
酶联免疫吸附剂测定名词解释
酶联免疫吸附剂测定（ELISA）是一种常用于检测抗原或抗体的实验方法。
ELISA利用酶标记的抗体与待测样品中的抗原或抗体结合，并通过酶催化反应产
生可测量的信号。
该方法具有高灵敏度和高特异性的优点，因此在医学诊断、生物研究和药物开发等领域得到广泛应用。
酶标记抗体是一种通过与抗原或抗体结合并被酶标记的抗体分子。
酶标记抗体在ELISA中起到关键作用，它可以与待测样品中的抗原或抗体发生特异性结合，并通过酶催化反应产生可观测的信号。
抗原是一种能够引起免疫系统产生抗体的分子。
抗原可以是病原体、外来物质或自身组织中的蛋白质、多糖或其他化合物。
在ELISA中，抗原通常被用作检测方法的目标。
抗体是免疫系统产生的一类特殊蛋白质，具有与抗原结合的能力。
抗体可以通过与抗原结合来识别和清除病原体，参与免疫应答过程。
在ELISA 中，抗体可以用于检测待测样品中的特定抗原。
酶联免疫吸附测定法
检测方法
检测方法
双抗体夹心法 双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下： 一、将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。 二、加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相 抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。 三、加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体 上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。 四、加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。 根据同样原理，将大分子抗体分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。 在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针 对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶 标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分 别用于包被固相载体和制备酶结合物。
酶联免疫吸附测定法
保持其免疫活性的测定方法
01 检测简介
03 注意事项
目录
02 基本原理 04 检测步骤
05 检测方法
07 酶标记法
目录
06 标记用酶 08 效果测定
基本信息
1971年瑞典学者Engvall和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液 中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)。 ELISA已成为分析化学领域中的前沿课题，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术( immunoenzymatic techniques )的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。
免疫酶联免疫吸附实验报告
免疫酶联免疫吸附实验报告一、引言免疫酶联免疫吸附实验（ELISA），是一种常用于检测抗原或抗体的方法。
该实验利用酶的特异性反应来定量或定性测定目标物在样品中的存在量。
本实验旨在通过免疫酶联免疫吸附实验检测目标抗原的存在。
二、实验材料和方法 1. 实验材料 - ELISA板：含有特异性抗体的孔板 - 样品：待测的抗原溶液 - 阻断缓冲液：用于防止非特异性结合 - 洗涤缓冲液：用于洗涤ELISA板 - 特异性抗原抗体：用于与目标抗原结合 - 辣根过氧化物酶标记的二抗：与特异性抗原抗体结合 - 底物溶液：用于酶的反应产生可测量的产物2.实验方法•准备ELISA板：加入特异性抗体溶液并孵育，以使其在孔板上固定•添加阻断缓冲液：加入阻断缓冲液，以防止非特异性结合•加入样品：将待测样品加入孔板，并孵育使其与特异性抗体结合•洗涤：用洗涤缓冲液洗涤孔板，以去除未结合的物质•添加辣根过氧化物酶标记的二抗：加入与特异性抗原抗体结合的辣根过氧化物酶标记的二抗，使其与目标抗原结合•洗涤：用洗涤缓冲液洗涤孔板，以去除未结合的物质•加入底物溶液：加入底物溶液，并孵育使酶反应发生•反应停止：加入反应停止液，以停止酶反应•测量吸光度：使用ELISA阅读器测量吸光度，得到结果三、实验结果与讨论本实验使用ELISA方法成功检测到了目标抗原的存在。
在测量吸光度的过程中，我们发现样品中目标抗原与特异性抗体发生特异性结合，而其他非特异性的物质则被洗涤缓冲液去除。
根据实验结果，我们可以通过吸光度的数值判断样品中目标抗原的含量或存在与否。
通常情况下，吸光度数值越高，说明目标抗原的含量越高。
需要注意的是，在进行ELISA实验时，实验操作的准确性和仪器的稳定性对结果的准确性有重要影响。
因此，在实验过程中，我们应严格控制实验条件，并对仪器进行校准。
四、实验结论免疫酶联免疫吸附实验是一种有效的检测目标抗原的方法。
通过特异性抗体与待测样品中的目标抗原结合，再通过酶的特异性反应，我们可以通过测量吸光度来判断目标抗原的存在与否。
酶联免疫吸附法
酶联免疫吸附试验ELISA一种酶联免疫技术。
用于检测包被于固相板孔中的待测抗原（或抗体）。
即用酶标记抗体，并将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相载体表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，最后通过酶作用于底物后显色来判断结果。
酶联免疫吸附试验（以下简称ELISA）:是酶免疫测定技术中应用最广的技术。
其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。
常用的ELISA法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。
ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。
此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。
滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。
因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。
此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。
用于标记抗体或抗抗体的酶须具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室温下稳定；反应产物易于显现；能商品化生产。
目前应用较多的有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP应用最广。
1•辣根过氧化物酶（HRP）过氧化物酶广泛分布于植物中，辣根中含量最咼，从辣根中提取的称辣根过氧化物酶（HRP），是由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白（含糖量18%）,分子量约40000,约由300个氨基酸组成，等电点为pH3-9，催化反应的最适pH值因供氢体不同而稍有差异，一般多在pH5左右。
此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。
酶联免疫吸附试验(双抗夹心法)原理
酶联免疫吸附试验（ELISA），又称酶联免疫吸附测定法，是目前广泛用于生物化学和免疫学领域的一种重要实验方法。
该技术结合了免疫学和生物化学的原理，能够高灵敏、高特异地检测抗原或抗体的存在，对临床诊断、生物医学研究以及生物制药等领域有着广泛的应用。
在本文中，我们将深入探讨酶联免疫吸附试验的原理、方法和应用。
一、酶联免疫吸附试验原理酶联免疫吸附试验的原理主要是利用酶标记抗体、抗原和底物的相互作用来检测特定物质的存在。
在双抗夹心法中，试验基本步骤如下：1. 用待测抗原溶液在固相酶标记抗体包被的微孔板上，充分接触和结合。
2. 经洗涤后，底物溶液被加入，并与酶标记抗体包被的复合物结合。
3. 底物受酶催化分解后，生成有色产物，通过比色法测定其光密度，间接测定抗原的含量。
在实验过程中，我们不能忽视的是标本处理、试剂选用、仪器操作等一系列实验细节，这些都对实验结果的准确性和重复性有着重要的影响。
二、酶联免疫吸附试验的方法不同类型的酶联免疫吸附试验方法包括间接法、夹心法、竞争法和直接法等。
在这次我们重点讨论的是双抗夹心法。
该方法通过将待测抗原与固相酶标记抗体和液相抗体结合，从而提高了对待测抗原的灵敏度和特异性。
这种方法在免疫学研究、传染病诊断和药物检测等方面具有重要的应用价值。
除了双抗夹心法，间接法通过检测待测抗体也是常用的酶联免疫吸附试验方法。
在实验设计中，根据不同的研究目的和样本特性，我们可以选择不同的方法来进行实验设计和操作。
三、酶联免疫吸附试验的应用酶联免疫吸附试验在临床诊断、疫苗研制、传染病监测、生物药品开发等领域有着广泛的应用。
它能够高灵敏、高特异地检测抗原或抗体的存在，为疾病诊断和药物研发提供了重要的技术支持。
在临床诊断中，酶联免疫吸附试验被广泛应用于传染病的早期诊断和鉴定。
HIV抗体检测、甲型肝炎抗原检测等都是通过酶联免疫吸附试验来完成的。
酶联免疫吸附试验还被应用于药物和疫苗的开发和监控过程中，能够全面地评价新药和疫苗的免疫原性和保护效果。
酶联免疫吸附测定法
酶联免疫吸附测定法
肝纤维化指标的检测一直以来都是肝脏疾病的重要检测项目之一，主要包括肝纤维化指标α2-MG和ALT等，其中，酶联免疫吸附测定法（ELISA）已经成为肝纤维化指标检测的首选方法。
酶联免疫吸附测定法是一种利用特异性抗原抗体对特异宿主物质（如肿瘤酶，血清蛋白等）的特异性结合作用，再用活性抗体对特异物质的抗体进行检测，从而测定样品中某特异物质的浓度的实验技术。
酶联免疫吸附测定法的实验流程主要分为七个步骤。
摘要：
第一步：将 Elisa 的板子放在石英培养皿里，用微量移液器从管内取出特异宿主物质（如肿瘤酶，血清蛋白等），将其缓慢移液至 Elisa 板子上（有多种不同形式的Elisa 板，根据測试物质的种类和浓度来决定板子的类型），使得每个池中均有特定数量的特异宿主物质。
第二步：用抗宿主物质抗体制备样品，将样品中的宿主物质与板中的宿主物质结合，产生免疫复合物。
第三步：用抗免疫复合物抗体，将免疫复合物增强，更好地复合到抗体上。
第四步：在抗免疫复合物抗体与免疫复合物的结合上加入适量的碳酸钠溶液，将特异宿主物质从免疫复合物中沉淀出来。
第五步：在强酸性溶液中，将沉淀出来的特异宿主物质，用标准物质进行校准，以确定当前特异宿主物质的浓度。
第六步：加入酶襵显剂，将样品中的特异宿主物质評估出来，再将其与标准物质的浓度做比较，可以得出结果。
第七步：通过计算、整理得出最终结果。
总之，酶联免疫吸附测定法是一种可靠而且高效的肝纤维化指标检测方法，其简便易行的实验流程、灵敏度高和结果准确精确。
应用范围广，且常用于癌症诊断，肝纤维化活性变化诊断，以及肝纤维化指标的检测等等。
酶联免疫吸附法
酶联免疫吸附法
酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)是一种测定有机物，
如抗原、抗体及其相互作用的实验方法，这种方法具有快速、简便以及具有可靠性和重复
性的特点，经过不断的发展和完善，成为迅速灵敏的一种实验方法，广泛应用于临床诊断
和血清学、分子遗传学、免疫学等生物学领域。
ELISA是一种通过生物反应检测抗原还是抗体的技术。
它利用抗原和抗体相互作用，
具有特异性地传导信号，进而加以测定。
从实验步骤上来看：将待检样品经过酶处理及离
心等步骤放入酶联免疫反应杯内，先把杯内的物质表面包覆一层特异性抗体，留存为有特
定特征的抗原受体网；然后将样品加入杯中进行反应，引起免疫反应；最后检测反应结果，依据结果来判断抗原是否存在于样品中。
传统的ELISA号称半定量技术，利用快速、简便、可靠重复性等一系列优点，在临床
医学及航空航天、环境监测等尤其受到重视，且其可以检测到比免疫印迹(immunoblotting)、放射免疫分析(RIA)轻量级微量抗原能量及比色试验更低等浓度的抗原。
ELISA也可以在针对一种抗原和多种抗体检测时使用，因为反应杯上可以印刷多种抗体，形成多个反应区域，检测样品中的抗原分布情况，该方法常称为靶向ELISA。
一般情况，本试验不会受样品的干扰而影响检测结果，因此适合检测各种样品。
ELISA的缺点在于相对RIA，其测定结果范围较窄，量程较短，因此其在被检样品浓
度范围较大时，检出限不能够满足检测要求。
酶联免疫吸附测定法
酶联免疫吸附测定法（ELISA）1.定义 (3)2.原理 (3)2.1抗原抗体反应 (3)2.2免疫测定在临床检验中的应用 (5)3.ELISA的类型 (5)3.1双抗体夹心法测抗原： (6)3.2双抗原夹心法测抗体 (6)3.3间接法测抗体 (6)3.4竞争法测抗体 (7)3.5竞争性测抗原 (7)3.6捕获包被法测抗体 (7)3.7ABS-ELISA法 (8)4.ELISA试剂的组成 (9)4.1固相载体： (9)4.2包被的方式 (9)4.3包被用抗原：天然抗原、重组抗原、合成多肽抗原。
(10)4.4包被的条件： (10)4.5洗涤液： (10)4.7酶的催化性； (11)4.8结合物的制备 (11)4.9结合物的保存 (12)4.10酶的底物 (12)4.11酶反应终止液 (12)4.12参考标准品 (13)4.13加样： (13)4.14保温 (13)4.15保温方式： (13)4.16室温温育的反应 (13)4.17洗涤 (14)4.18显色 (14)4.19比色 (14)4.20酶标比色仪 (15)4.21结果判定 (15)4.22定量测定 (16)4.23ELISA的操作要点 (16)1.定义酶联免疫吸附测定法（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），简称ELISA，采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，对受检物质进行定性或定量分析的一种检测方法。
2.原理采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，可对受检物质的定性或定量分析。
2.1抗原抗体反应2.1.1可逆性抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：Ag+Ab→Ag·Ab抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab]，Ag·Ab的解离程度与K值有关。
酶联免疫吸附测定法elisa
酶联免疫吸附测定法elisa酶联免疫吸附测定法（ELISA）的原理酶联免疫吸附测定法（ELISA）是一种广泛用于生物医学研究和诊断的免疫分析技术。
ELISA 的原理基于抗原抗体特异性结合的原理，通过标记酶的抗体来检测目标抗原或抗体。
ELISA 的种类根据检测方法的不同，ELISA 可分为以下几种类型：直接 ELISA：将待测样品直接加入固定在微孔板上的抗原或抗体上，然后用标记酶的抗体检测。
夹心 ELISA：微孔板固定一层捕获抗体，待测样品通过捕获抗体与检测抗体结合，然后用标记酶的抗体检测。
竞争性 ELISA：待测样品与标记抗原竞争结合固定在微孔板上的抗体，标记抗原和待测样品结合量成反比。
ELISA 的步骤ELISA 的主要步骤包括：抗原或抗体固定：将待测抗原或抗体固定在微孔板上。
样品孵育：将待测样品加入微孔板，进行孵育。
洗涤：去除未结合的样品。
添加标记抗体：加入标记酶的抗体，再次孵育。
洗涤：去除未结合的标记抗体。
底物反应：加入底物，酶促反应产生有色产物。
终止反应：加入终止液，停止酶促反应。
测量吸光度：测量有色产物的吸光度，吸光度与样品中抗原或抗体浓度成正比。
应用ELISA 具有灵敏度高、特异性强、操作简便等特点，广泛应用于以下领域：诊断：检测传染性疾病（如艾滋病毒、乙肝）、自身免疫疾病（如类风湿性关节炎）、癌症标志物等。
研究：研究抗原抗体相互作用、免疫应答、药物开发等。
食品安全：检测食品中的残留农药、抗生素等。
环境检测：检测水体或土壤中的污染物。
注意事项进行 ELISA 时需要注意以下事项：抗体的特异性和亲和力：使用的抗体必须具有高特异性和亲和力，以确保准确的检测结果。
样品准备：样品应经过适当的处理，去除干扰物质，以获得准确的结果。
优化条件：ELISA 反应条件（如孵育时间、温度）应经过优化，以获得最佳检测灵敏度和特异性。
背景信号：应使用阴性对照进行检测，以去除背景信号的影响。
质量控制：应使用已知浓度的标准品进行质量控制，以确保检测结果的准确性和可重复性。
酶联免疫吸附测定各步骤的意义
酶联免疫吸附测定各步骤的意义1. 酶联免疫吸附测定的第一步呀，那可是像在黑暗中点亮一盏灯一样重要呢。
这一步通常是包被，就是把抗原或者抗体固定在微孔板上。
这就好比给小偷设下了一个个小陷阱，抗原或者抗体就像那些陷阱一样，静静地等待着目标分子的到来。
比如说，我们要检测某种病毒，就把针对这个病毒的抗体包被在板上，病毒要是在样本里，就很可能会被抓住哦。
这一步是整个检测的基础，要是没弄好，后面就全乱套啦，就像盖房子打歪了地基，房子肯定不稳呀。
2. 接下来的封闭步骤可不能小瞧喽。
这就像是给那些小陷阱做个伪装，让它们更隐蔽、更专业。
我们用一些无关的蛋白质溶液去填充微孔板上没被包被到的地方。
这就像在陷阱周围撒上一些树叶啥的，让猎物不容易发现陷阱的破绽。
打个比方，就像我们捉迷藏的时候，躲在一个角落里，然后还拿东西把自己遮一遮，这样就不容易被发现啦。
要是没有封闭好，就可能会有一些乱七八糟的东西粘到板上，干扰检测结果呢，那可就糟心了。
3. 加样这个步骤就像是一场大搜查呢。
把待测样本加进去，这时候样本里的目标分子就像一个个小嫌疑犯，要到我们之前设好的陷阱里接受检查啦。
如果是检测血液里的某种抗体，那血液样本加进去，里面的抗体要是存在，就会被包被在板上的抗原抓住。
这就好比警察在人群里找小偷，每个可疑的人都要被检查一遍，可不能放过任何一个可能的“坏蛋”哦。
4. 温育这个过程呢，有点像让嫌疑犯和陷阱充分交流的时间。
把微孔板放在合适的温度下一段时间，让抗原和抗体充分结合。
这就像两个人在互相了解一样，得给它们点时间去“聊天”，去看看是不是真的匹配。
比如说，相亲的时候，两个人也得坐下来聊一会儿，才能知道合不合适呀。
要是温育时间不够或者温度不对，就像两个人还没聊几句就被分开了，可能就错过了真正的匹配呢。
5. 洗板这个步骤超级关键，就像大扫除一样，把那些无关的东西都清扫出去。
在温育过程中，可能会有一些没有结合的物质还留在板上，这时候就要把它们洗掉。
酶联免疫吸附实验ELISA
酶联免疫吸附实验ELISA
第3页
再加入酶标识抗原或抗体, 也经过反应而结合在固 相载体上。此时固相上酶量与标本中受检
物质量呈一定百分比。加入酶反应底物后, 底物被 酶催化成为有色产物, 产物量与标本中受检物质量 直接相关, 故可依据呈色深浅进行定性或定量分析 。因为酶催化效率很高, 间接地放大了免疫反应结 果, 使测定方法到达很高敏感度。
酶联免疫吸附实验ELISA
第20页
2.1.2 包被方式 将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)。
换言之, 包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面 过程。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是经过物理吸 附结合, 靠是蛋白质分子结构上疏水基团与固相载 体表面疏水基团间作用于。这种物理吸附是非特 异性, 受蛋白质分子量、等电点、浓度等影响。
第18页
惯用检验方法为: 以一定浓度人IgG（普通为 10ng/ml）包被ELISA板各孔，洗涤后每 孔内加入适当稀释度酶标抗人IgG抗体，保温后 洗涤，加底物显色，终止酶反应后，分 别测每孔溶液吸光度。控制反应条件，使各孔读 数在吸光度0.8左右。计算全部读数 平均值。全部单个读数与全部读数均数之差，应 小于10%。
酶联免疫吸附试验（ELISA）
酶联免疫吸附实验ELISA
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1. ELISA原理 ELISA基础是抗原或抗体固相化及抗原或抗
体酶标识。结合在固相载体表面抗原或抗体仍保
持其免疫学活性, 酶标识抗原或抗体既保留其免疫 学活性, 又保留酶活性。
酶联免疫吸附实验ELISA
第2页
在测定时, 受检标本（测定其中抗体或抗原）与固相 载体表面抗原或抗体起反应。用洗涤方法使固相 载体上形成抗原抗体复合物与液体中其它物质分 开。
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操作步骤
每种液体均加100ul
→
包被：1：5000稀释的正 常小鼠血清，4℃过夜
洗涤：3次， 1min/次
→
E E
底物液
洗涤：3次， 1min/次
封闭：5%脱脂奶粉， 37 ℃ 30min
加待检抗体：倍比稀释的兔抗 鼠IgG抗血清，37 ℃ 30min
E
E
→
洗涤：3次， 1min/次
→
空白对照无显色 待测样品显色明显
E
D+ 2H2O
DH2为供氢体， H2O2为受氢体。
DH2一般为无色化合物，经酶作用后氧化成为有色 的产物。
酶 /E
辣根过氧化物酶
底 物/DH2
邻苯二胺 四甲替联苯胺 氨基水杨酸 邻联苯甲胺 2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉 磺酸-6)铵盐
4-硝基酚磷酸盐(PNP) 萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐 ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰 甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG) 硝基酚半乳糖苷(ONPG)
实验目的：测小鼠IgG免疫兔血清中抗小鼠IgG抗体的效价 实验材料：包被抗原：小鼠血清
待检抗体/一抗：兔抗小鼠IgG 酶标抗体/二抗：HRP-驴抗兔IgG 聚苯乙烯酶标板 水浴箱 移液器 枪头 包被液：pH9.6的碳酸盐缓冲液 封闭液/ 封：5%脱脂奶粉 稀释液/稀： pH7.4 0.05M的PBS（磷酸盐缓冲液） 洗液：PBST（PBS+0.1%吐温20） 显色液：OPD（邻苯二胺） 终止液/终：2M硫酸
ELISA在医学中的应用
临床疾病诊断中的应用
ELISA检测“非典型肺炎”冠状病毒
ELISA法筛查α-地中海贫血 ELISA法定量检测乙肝抗原两对半
……
基础医学领域的应用 ----ELISA试剂盒商业资讯
ELISA在其他相关领域中的应用
食品安全
法医物证
……
环境卫生
酶催化底物液显色
DH2+ H2O2
（三）双抗体夹心法
只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和 制备酶结合物而建立此法。此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原 ，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。
（四）竞争法
当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原 时，可用此法检测特异性抗体。 小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不 能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。小分子激素、药 物等ELISA测定多用此法。
E
E
→
洗涤：3次， 1min/次
→
空白对照无显色 待测样品显色明显
→
终止液终止显色
加酶标抗体：1:5000稀释的 HRP标记的驴抗兔IgG抗血 清， 37 ℃ 30min
加底物液显色
用示踪物质标记抗体或抗原，使其与相应的抗原或抗体 反应，使微量的、不可见的反应成为可见的或可测定的。
同位素131I标记抗体指示小鼠肿瘤
测定A值：在酶标仪上，根据不同底物设定波长
（OPD底物为490nm，TMB底物为450nm），以 空白孔调零后测各孔OD值。以高于阴性对照孔 OD值2倍为阳性。
结果的判定
空白对照无显色，而样品显色明显且逐渐变浅
待检样品孔显色明显 空白对照
ELISA标准曲线
Ab浓度（ng/ml）
注意事项
对照的设定（阳性对照，阴性对照，空白对照）
显色 反应
橘红色 黄色 棕色 兰色 蓝绿色
黄色 红色 黄色 深蓝色 荧光
测定波长
nm
492 460 449 425 642
400 500 405 420 360,450
碱性磷酸酯酶 葡萄糖氧化酶 β-Ｄ－半乳糖苷
酶
黄色
420
结果的判定
肉眼判定结果：于白色背景上直接肉眼观察。颜
色越深，反应越强；阴性反应为无色或极浅。 根据颜色的深浅，以“＋”、“－”表示。
酶联免疫吸附测定
（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA ）
操作步骤
每种液体均加100ul／孔
→
包被：1：5000稀释的正 常小鼠血清，4℃过夜
洗涤：3次， 1min/次
→
E E
底物液
洗涤：3次， 1min/次
封闭：5%脱脂奶粉， 37 ℃ ，20min
加待检抗体：倍比稀释的兔抗 鼠IgG抗血清，37 ℃ 30min
三大免疫标记技术：放射免疫技术、荧光免疫技术、酶免 疫技术。
2. ELISA的原理、定义及基本分类 3. 实验对照的设立及其意义 4. 了解ELI抗体：1:5000稀释的 HRP标记的驴抗兔IgG抗血 清， 37 ℃ 30min
加底物液显色
倍比稀释法与加样
样 品 管 100µ L 第 一 管 100µ L第 二 管 100µ L第 十 管
S
600µ L
300µ L
300µ L
300µ L
1:400 A B 1 2 3
1:1600
1:6400
…….
4
5
6
7
8
9
10
11
每孔100ul,上下两排一致
从低浓度往 高浓度加,
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ELISA的分类
（一）直接法 （二）间接法 （三）双抗体夹心法 （四）竞争法
（一）直接法
（二）间接法
间接法的原理为 利用酶标记的抗抗体 以检测已与固相结合 的受检抗体，故称为 间接法。 其优点在于只要 变换包被抗原就可利 用同一酶标抗抗体建 立检测相应抗体的方 法。可用于传染病的 诊断。
倍比稀释时，要正确操作；加样时从低浓度向高 浓度方向进行
终止反应的时间：以空白对照孔未显色为准 2M H2SO4具有腐蚀性，操作过程中应避免外溢 将加样枪调到最大量程（见加样枪顶部数字） 将所有剩余液体倒入水池，所有塑料制品开盖回 收到讲台
需要搞清楚的问题
1. 什么是免疫标记技术？为什么要进行标记?
免 疫 荧 光 技 术
用FITC-抗IgM单抗计数B细胞
用FITC-抗IgM单抗计数B细胞
课程内容
ELISA的原理
ELISA的分类
间接ELISA的具体操作 ELISA在医学中的应用实例
ELISA的原理
1.抗原抗体反应的特异性
2.抗原或抗体的固相化
E
3.抗原或抗体的酶标记
间接ELISA