细胞转染简介
细胞转染实验总结
细胞转染实验总结引言细胞转染是生物学研究中常用的实验技术，用于将外源DNA、RNA或蛋白质引入到目标细胞中。
通过细胞转染，可以实现基因表达、基因敲除、蛋白质定位等多种研究目的。
本文总结了细胞转染实验的基本原理、常用方法和注意事项。
基本原理细胞转染实验的基本原理是通过物理或化学方法将外源DNA、RNA或蛋白质传递到目标细胞内。
细胞内的转染物质可以在细胞内进行表达、干扰或定位，从而实现对目标细胞功能的研究。
常见的细胞转染方法包括：1.电穿孔法：通过应用电流使细胞膜发生临时孔洞，从而使转染物质进入细胞内。
2.化学转染法：利用聚合物、脂质体等化学物质，将目标物质载体化，并与细胞膜结合，实现内源化学转染。
3.病毒载体介导转染法：利用病毒（如腺病毒、逆转录病毒等）作为载体，传递目标物质到细胞内。
常用方法1. 电穿孔法电穿孔法是细胞转染中常用的物理方法之一。
通过应用高电压或脉冲电场，可以使细胞膜发生临时性孔洞，从而使外源DNA、RNA或蛋白质进入细胞内。
常用的电穿孔方法包括：•电转染：将转染物质与细胞悬浮液混合后施加电脉冲，使细胞膜发生孔洞并吸收转染物质。
•静电转染：将转染物质与带正电荷的载体（如聚乙烯亚胺）混合后，与带负电荷的细胞膜相互吸引，从而将转染物质导入细胞内。
2. 化学转染法化学转染法是一种通过化学物质介导的细胞转染方法。
常用的化学转染法有：•使用聚合物：聚合物（如聚乙烯亚胺、聚合丙烯酸等）能与转染物质结合成复合物，使其稳定且易于细胞摄取。
•脂质体转染：脂质体是由磷脂、胆固醇等成分构成的脂质双层结构，可以包裹转染物质形成脂质体-转染物复合物，通过与细胞膜融合实现内源转染。
3. 病毒载体介导转染法病毒载体介导转染法是细胞转染中较常用的方法之一。
常见的病毒载体包括：•腺病毒：腺病毒是一种双链DNA病毒，可以携带大片段的外源DNA，并有效地传递到目标细胞内。
•逆转录病毒：逆转录病毒（如 lentivirus、retrovirus等）可以将外源RNA逆转录成DNA，然后整合到宿主细胞基因组中。
细胞转染的原理操作步骤以及小技巧
细胞转染的原理操作步骤以及小技巧细胞转染是一种将外源DNA、RNA、蛋白质等分子导入到细胞内的实验技术。
这种技术可以用来研究基因功能、发现新的信号通路和治疗基因疾病等。
下面将介绍细胞转染的原理、操作步骤以及一些小技巧。
一、细胞转染的原理：细胞转染主要通过三种方法实现：物理法、化学法和生物学法。
1.物理法：通过高压、电穿孔、微射流等方式，使细胞膜发生瞬时破裂，从而使DNA、RNA等外源分子进入细胞。
常用的物理法有电穿孔法和基因枪法。
2.化学法：通过化学物质，如聚吡咯、脂质体等，使外源分子与细胞膜结合，从而实现转染。
常用的化学法有聚乙烯亚胺（PEI）法、磷酸钙共沉淀法等。
3.生物学法：通过利用病毒载体将外源基因导入目标细胞，实现基因的转移。
常用的生物学法有腺相关病毒（AAV）转染、逆转录病毒（RETRO）转染等。
二、细胞转染的操作步骤：1.细胞的预处理：根据细胞类型和实验要求，将细胞培养至合适的状态。
通常细胞应处于快速生长期，但还未达到接触抑制的阶段。
对于一些特定的细胞，如悬浮细胞，可能需要将其转接至适当的培养基中。
2.外源分子的准备：将外源DNA、RNA等转染载体制备好。
如将DNA克隆并纯化至高质量的质粒DNA，或将RNA合成或纯化。
根据实验要求选择合适的转染载体。
3.转染方法的选择：根据实验要求选择合适的转染方法，如物理法、化学法或生物学法。
一般情况下，物理法适用于悬浮细胞，化学法适用于贴壁细胞，而生物学法适用于大多数细胞类型。
4.细胞转染操作：a.物理法：i.电穿孔法：将细胞悬浮于含有外源分子的缓冲液中，然后通过电穿孔仪的电极或电穿孔板进行电穿孔。
ii. 基因枪法：使用基因枪将外源分子直接“枪”入目标细胞中。
b.化学法：i.PEI法：将PEI与外源DNA或RNA按一定比例混合，在适当条件下形成复合物，然后添加至目标细胞中。
ii. 磷酸钙共沉淀法：将外源DNA与磷酸钙按比例混合，并静置形成磷酸钙- DNA沉淀，然后加入至目标细胞中。
细胞转染操作方法
细胞转染操作方法一、细胞转染简介细胞转染是指将外源性DNA、RNA、蛋白质等分子通过物理或化学手段导入到细胞内，从而改变细胞的基因表达或功能。
常见的细胞转染方法包括病毒载体介导转染、电穿孔法、钙磷共沉淀法和化学转染法等。
其中，化学转染法是最为常用的方法之一，因为它具有操作简便、成本低廉和适用于多种类型的细胞等优点。
二、实验前准备1. 细胞培养：选择适当的培养基和培养条件，使得细胞处于生长状态。
2. 转染试剂：选择合适的化学转染试剂，如Lipofectamine 2000、PolyJet等。
3. 质粒DNA：准备所需的质粒DNA，并进行纯化和测定浓度。
4. 培养皿：准备适当大小和形状的培养皿，以满足实验需要。
5. 显微镜：准备显微镜以观察细胞转染效果。
三、实验步骤1. 细胞接种：将需要转染的细胞接种到培养皿中，使其达到适当的生长状态。
2. 质粒DNA和化学转染试剂混合：根据试剂说明书的建议，将质粒DNA和化学转染试剂混合，形成转染复合物。
3. 转染复合物与细胞接触：将转染复合物滴加到培养皿中，让其与细胞接触。
4. 培养：将培养皿放入恰当的培养箱中，并按照所选细胞类型的要求进行培养。
5. 观察效果：经过适当时间后，使用显微镜观察细胞转染效果。
若需要，可以通过Western blot、PCR等方法进行进一步验证。
四、注意事项1. 选择适当的化学转染试剂，并按照说明书建议操作。
2. 转染前需要保证质粒DNA纯度和浓度足够，并进行必要的测定。
3. 细胞密度和培养时间应根据所选细胞类型进行调整。
4. 转染复合物与细胞接触时间不宜过长或过短，一般在4-6小时左右。
5. 培养过程中需要注意细胞状态的变化，并根据需要进行适当的处理。
五、实验结果解读通过细胞转染操作，可以实现外源性DNA、RNA、蛋白质等分子的导入，从而改变细胞的基因表达或功能。
实验结果可以通过Western blot、PCR等方法进行进一步验证。
高中生物选修三专题二细胞转染知识点
高中生物选修三专题二细胞转染知识点本文档旨在介绍高中生物选修三专题二细胞转染的相关知识点。
1. 什么是细胞转染？细胞转染是将外源DNA、RNA或蛋白质导入靶细胞的过程。
通过细胞转染可以实现基因转染、基因抑制和蛋白质表达等应用。
2. 细胞转染的应用领域细胞转染在生物学研究和生物技术领域具有广泛的应用。
主要包括以下方面：- 基因功能研究：通过转染外源基因，研究基因在细胞中的功能及调控机制。
- 基因治疗：将修饰好的基因导入患者的细胞，来治疗某些遗传性疾病。
- 蛋白质表达和纯化：利用细胞转染技术可在细胞中高效表达目的蛋白质，并进行纯化和鉴定。
3. 细胞转染的方式细胞转染有多种方式，常见的包括以下几种：- 化学转染：利用化学物质（如离子型聚合物、脂质体等）将外源DNA导入细胞中。
- 非化学转染：利用物理方法（如电穿孔、微注射等）或生物病毒（如腺病毒、慢病毒等）将外源DNA导入细胞中。
4. 常用的细胞转染试剂- 钙磷共沉淀试剂：通常用于化学转染，能够有效将外源DNA 送入细胞内。
- 脂质体试剂：也是一种常用的化学转染试剂，能够有效将外源DNA导入细胞。
5. 细胞转染的注意事项在进行细胞转染实验时，需要注意以下几点：- 转染体系的选择：根据实验的要求，选择合适的细胞株、转染试剂和转染方法。
- 转染效率的优化：通过调节转染试剂浓度、孵育时间等参数，优化转染效率。
- 遗传毒性的考虑：某些化学转染试剂或病毒载体可能对细胞产生毒性作用，需要进行合适的对照组和评估。
- 数据分析和解释：对转染后的细胞进行相应指标检测，结合对照组进行数据分析和解释。
以上是高中生物选修三专题二细胞转染的相关知识点介绍，希望能对您的学习有所帮助。
细胞转染
• •
•
尽管转染效率因细胞类型的不同而异，在104个转染 细胞中只有大约一个细胞可以稳定整合DNA (不论使用 的是线性还是环状DNA)。 没有一种方法可以适用于所有细胞和所有实验。必须 根据您的细胞类型和实验要求选择理想的方法，必须具 有高转染效率、低血细胞毒性、对正常生理学的影响最 小，且使用简单、可重复。
选择转染策略？
定因素是实验的时间范围和最终目标。
瞬时转染细胞一般在转染后24–96小时收集，常用于研 究基因或基因产物的短期表达效应，执行RNA干扰(RNAi)介可以更快速地提供结果；因为mRNA在胞浆中表达，无需 转移到细胞核，无需转录，转染数分钟后即可在部分系统 中表达转染mRNA。
• 使用选择性培养基培养时，未转染的细胞或瞬时转染 细胞都将会死亡，而表达一定水平的抗生素抗性基因 或可以补偿必需基因缺陷的细胞则可以存活。选择标 记物可保护生物体不受选择性试剂影响，这些选择性 试剂通常会杀死生物体或干扰其生长。 • 亦可利用报告基因来筛选成功转染的细胞。用于转染 子筛选的报告基因则可以轻松鉴别出包含报告基因的 细胞。
相比之下，当需要长期基因表达或转染细胞需要在多个 实验中使用时，则更多地选择稳定转染。由于将DNA载体整 合至染色体中的概率较低，因此细胞的稳定转染更麻烦、 更具挑战性，需要选择性筛选和克隆分离。因此，稳定转 染通常用于大规模的蛋白质生产、长期药理学研究、基因 治疗或长期基因调控机制研究。
三、转染的技术
2.转染的应用 • 基因表达
转染最常通过使用质粒载体在培养细胞(或动物 模型)中表达目的蛋白。另外，将带有可检测的标 记物及其他修饰的蛋白质导入细胞，可用于启动子 和增强子序列或蛋白间相互作用的研究。
• 基因抑制
转染的另一个常用用途是通过RNA干扰(RNAi)抑 制特定蛋白质的表达。
细胞转染的原理
细胞转染的原理一、细胞转染的基本概念细胞转染是指将外源性DNA或RNA等物质导入到细胞内，以达到改变细胞基因表达或功能的目的。
它是生物学研究中常用的技术手段之一，广泛应用于基因治疗、药物筛选和基因功能研究等领域。
二、细胞转染的方法1. 化学法：通过化学试剂（如聚乙烯醇、离子脂质体等）将DNA或RNA导入到细胞内。
这种方法简单易行，但毒性较大且效率不高。
2. 物理法：通过机械冲击（如电穿孔）、高压注射、微注射等方式将DNA或RNA直接注入到细胞内。
这种方法效率较高，但操作复杂且对细胞有一定伤害。
3. 病毒载体法：利用病毒作为载体将DNA或RNA导入到细胞内。
这种方法效率高，但存在安全隐患和限制性较大。
三、化学法转染原理1. 离子脂质体介导转染离子脂质体是由阳离子表面活性剂和阴离子脂质组成的复合物，具有良好的生物相容性和可生物降解性。
在转染过程中，DNA或RNA与离子脂质体形成复合物，通过静电作用与细胞膜结合并进入细胞内。
此外，离子脂质体还能促进细胞内吞作用和溶酶体逃逸，提高转染效率。
2. 聚乙烯醇介导转染聚乙烯醇（PEI）是一种阳离子聚合物，在水中能形成稳定的颗粒。
在转染过程中，PEI与DNA或RNA形成复合物，通过静电作用与细胞膜结合并进入细胞内。
PEI不仅能促进细胞内吞作用和溶酶体逃逸，还能与核糖体结合并促进基因表达。
四、化学法转染优缺点1. 优点：简单易行、操作方便、不需要专门设备。
2. 缺点：毒性较大、效率低、对不同类型的细胞有一定限制。
五、物理法转染原理1. 电穿孔法电穿孔法利用电场作用使细胞膜通透，形成微小孔道，从而将DNA或RNA导入到细胞内。
电穿孔法的优点是操作简单、效率高，但缺点是对细胞有一定伤害。
2. 高压注射法高压注射法是通过高压气流将DNA或RNA直接注入到细胞内。
这种方法效率高，但对细胞有较大的伤害。
3. 微注射法微注射法是在显微镜下使用微针将DNA或RNA直接注入到单个细胞内。
细胞转染技术课件
研究基因功能
基因表达调控
通过转染特定基因，研究其在细胞内的表达调控机制，有助于深入 了解基因的功能和作用。
基因敲除与敲入
利用转染技术将特定基因敲除或敲入细胞中，以探究基因对细胞生 长、分化等过程的影响。
表观遗传学研究
通过转染特定因子或抑制剂，研究表观遗传修饰对基因表达的调控作 用。
与合作。
降低对细胞的毒性
寻找低毒性的转染试剂
研发和选用对细胞毒性更低的转染试剂，减轻对细胞的损伤。
控制转染条件
优化转染条件，如降低转染浓度、减少转染时间等，以减轻对细胞的毒性。
细胞株的选择
选用对转染更具有耐受性的细胞株，降低转染过程中的毒性。
发展新型的转染技术与方法
非病毒载体转染技术
研究和发展非病毒载体转染技术，如纳米材料、基因 编辑技术等，以实现更高效、安全的基因转移。
体内转染技术
探索和发展体内转染技术，提高基因治疗在临床应用 中的效果和安全性。
跨物种转染技术
研究和发展跨物种转染技术，拓宽基因功能研究和基 因治疗的应用范围。
CHAPTER 06
案例分析：某基因的功能研 究
研究背景与目的
某基因在肿瘤发生发展中的重要作用
近年来，研究发现某基因在多种肿瘤中高表达，可能与肿瘤的发生、发展、转移等过程 密切相关。
提高转染效率的方法
预处理细胞
通过药物处理、电穿孔等方式预处理细胞，可以提高细胞膜的通 透性，有利于转染试剂进入细胞。
共转染
同时转染多个基因或质粒，可以提高转染效率和基因表达水平。
筛选稳定转染细胞株
通过药物筛选或克隆选择等方法，筛选出稳定表达目的基因的细胞 株，可以长期保存和应用。
细胞转染
磷酸钙法
即磷酸钙共沉淀转染法，先将DNA和氯化钙混合， 然后加入到PBS中慢慢形成DNA磷酸钙沉淀，最 后把含有沉沉淀的混悬液加到培养的细胞上， 通过细胞胞膜的内吞作用摄入DNA。磷酸钙似乎 还通过抑制血清中和细胞内的核酸酶活性而保 护外源DNA免受降解。
磷酸钙法
核酸以磷酸钙-DNA共沉淀物的形式出现时，可 使DNA附在细胞表面，利于细胞吞入摄取，或通 过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内， 进入细胞的DNA仅有1%～5%可以进入细胞核中， 其中仅有不到1%的DNA可以与细胞DNA整合，在 细胞中进行稳定表达，基因转导的频率大约为 10-4，这项技术能用于任何DNA导入哺乳类动物 进行暂时性表达或长期转化的研究。此方法对 于贴壁细胞转染是最常用并首选的方法。
脂质体转染法
阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸 根通过静电作用，将DNA分子包裹入内，形成 DNA脂复合物，也能被表面带负电的细胞膜吸附， 再通过融合或细胞内吞进入细胞。
脂质体转染法
脂质体转染法
1. 脂质体转染适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养 细胞，可用于瞬时转染和稳定转染。 2. 转染效率高，比磷酸钙法高5-100倍。 3. 能够把DNA和RNA转染到各种细胞。 4. 转染的稳定性好，可重复性高。 5. 转染时最好不加血清和抗生素。 6. 阳离子脂质体细胞毒性相对较高，对部分细胞可 能会干扰细胞的代谢。由于脂质体对细胞有一定 的毒性，所以转染时间一般不超过24小时。 7. 常用细胞类型：cos-7 、BHK、NIH3T3 、Hela等。
理想的细胞转染
转染效率高，不影响细胞正常生理活动 细胞毒性 重复性好 安全 方法简单 省时、经济
报告基因
细胞转染知识点总结
细胞转染知识点总结一、细胞转染的基本原理1.细胞膜的通透性细胞膜是生物细胞的保护屏障，对大多数物质具有选择性通透性。
它具有疏水性，对水溶性分子和带电离子有较高的抵抗力。
因此，要将外源DNA/RNA或蛋白质引入细胞内，就需要突破细胞膜的屏障。
2.转染技术的原理细胞转染的原理是通过物理方法或化学方法破坏细胞膜的结构，使得外源基因或蛋白可以穿过细胞膜，进入细胞内。
外源基因或蛋白进入细胞后，可以在细胞内表达并产生相应的生物学效应。
3.转染方法的选择根据转染的实验目的和特定的细胞类型，可以选择不同的转染方法。
常用的转染方法包括化学转染、电穿孔法、超声转染、直接微注射等。
不同的转染方法有各自的优缺点，可以根据实验需要进行选择。
二、常用的细胞转染方法1. 化学转染化学转染是利用化学物质破坏细胞膜结构，引入外源DNA或蛋白质的一种转染方法。
常用的化学转染试剂包括有机阴离子试剂如聚乙烯亚胺（PEI），阳离子表面活性剂如脂质体和脂质体样微粒等。
这些试剂可以与DNA或蛋白发生静电相互作用，形成复合物，穿过细胞膜进入细胞内。
2. 电穿孔法电穿孔法是利用电场作用引导外源DNA或蛋白进入细胞内的转染方法。
通过施加电脉冲，使细胞膜通透性增加，从而实现外源基因或蛋白质的引入。
电穿孔法转染简单、高效，适用于各种细胞类型。
3. 超声转染超声转染是利用超声波破坏细胞膜结构，引入外源DNA或蛋白质的转染方法。
超声波作用在细胞膜上会形成微小孔道，从而促进外源基因或蛋白的穿过。
超声转染操作简单，对细胞损伤小，适用于多种细胞类型。
4. 直接微注射直接微注射是指利用显微注射器将外源DNA或蛋白质直接注射进入细胞内的转染方法。
这种方法不受细胞膜的限制，能够确保外源基因或蛋白的输入量和准确性。
但微注射操作技术要求高，效率较低。
5. 基因枪法基因枪法是利用高压气枪射击金属微粒和DNA复合物，使复合物穿过细胞膜进入细胞内的转染方法。
基因枪法操作简单，转染效率高，适用于植物细胞和哺乳动物细胞。
简析细胞转染
细胞转染是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术。
在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中，其应用越来越广泛。
转染方式有瞬时转染：外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。
）和稳定转染： (外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。
)主要方法如下：
影响转染效率的因素有很多，具体如下：
1.转染试剂
要选择高效、低毒、方便、廉价的转染试剂。
2.细胞状态
一般低的细胞代数（<50）能确保基因型不变。
最适合转染的细胞是经过几次传代后达到指数生长期的细胞。
3.细胞密度
细胞密度对转染效率有一定的影响。
不同的转染试剂，要求转染时的最适细胞密度各不相同。
4.血清
血清的存在会影响DNA-转染复合物的形成，但只要在复合物形成时用无血清培养基或PBS来稀释DNA和转染试剂就可以了。
5.DNA质量
DNA质量对转染效率影响非常大。
一般的转染技术基于电荷吸引原理，如果DNA不纯，如带少量的盐离子，蛋白，代谢物污染都会影响转染复合物的形成及转染的进行。
细胞转染简介ppt课件
3.DNA片断的重组连接
粘端连接方法要点
平端连接方法要点
①单酶单切点 防自身环化， ①平端，平端连接；
希望定向插入；
②Linker连接酶切产生粘端连接；
③Adaptor衔接目的基因和载体；
②双酶双切点 定向克隆，构
④同源同聚尾，克隆cDNA的最好
建表达载体的最好用此法； 方法
③利用同裂解酶产生相同粘 ⑤T载体，PCR产物T/A克隆法连
（1）逆转录病毒 （2）腺病毒
28
四 转染后筛选
• 筛选所选用的抗生素跟转染所用的质粒上 所带的真核筛选抗性基因有关的 。
• 标有neo（实际上应该是neo resistance） 的载体，指载有降解新霉素的基因，新霉 素作用于原核和真核细胞，对两者都有杀 伤作用。用于转染后，稳定表达外源基因 细胞的阳性筛选。
（1）电穿孔法
利用高压电脉冲对细胞膜的干扰，使其 形成利于核酸进人的微孔。电穿孔技术可用于 瞬时转染和稳定转染，可方便地用于悬浮细胞， 重现性好，但需要较多的细胞。影响转染效率 的主要因素是脉冲强度和持续时间。必须找到 能够使核酸有效释放而又不杀死细胞的最佳平 衡点。
26
(2）显微注射法 该法虽然费力，但却是非常有效的将核
A. 典型的哺乳动物细胞表达载体需要以下顺式作用元 件:
a.启动子 b.增强子 c. 多聚腺苷酸化信号 d. 药物选择 标记基
e. 报告基因 f.表位标签
11
B.常用的哺乳动物表达质粒载体 a. pcDNA3.l b. pSI c. pCMV-HA d. pBudCE4.1 e. pTRE
12
2）病毒型载体
38
• 6 时间进度 • 一般原则提示：要确保最终结果的成功；
细胞转染实验
细胞转染实验简介细胞转染是一种将外源基因或荧光探针引入细胞的技术，用于研究基因功能、蛋白质表达以及信号通路等。
本文将为您介绍细胞转染实验的基本原理、实验步骤以及常见注意事项。
基本原理细胞转染是一种通过改变细胞外液环境，使细胞吸收外源基因或荧光探针的技术。
转染可采用多种方式实现，包括化学转染、电转染、病毒转染等。
不同的转染方法适用于不同类型的细胞和研究目的。
在化学转染中，常用的转染试剂有脂质体和阳离子聚合物。
脂质体是由磷脂和胆固醇组成的小囊泡，可以包裹外源基因形成脂质体-基因复合物。
阳离子聚合物是带正电荷的聚合物，可以和DNA形成复合体进入细胞。
电转染是利用高压脉冲将DNA导入细胞。
通常使用电穿孔仪产生的短暂高压电场，使细胞膜通透性增加，从而使DNA进入细胞。
病毒转染是将外源基因植入病毒载体中，通过感染细胞，使外源基因整合到细胞染色体中。
实验步骤1. 准备细胞选择合适的细胞系进行转染实验。
不同细胞系对转染方法和试剂的适应性有所差异。
常见细胞系如293T、HeLa、CHO 等。
2. 培养细胞将选定的细胞系按照相应的培养条件在细胞培养皿中培养至达到合适的密度，一般为70-90%的密度。
细胞应确保处于快速生长期，以提高转染效率。
3. 转染试剂的选择根据实验的需要选择合适的转染试剂。
常见的转染试剂有脂质体试剂（如Lipofectamine™）和阳离子聚合物试剂（如PolyJet™）。
4. 转染实验操作将所需的转染试剂加入适量的培养基中，并充分混合。
注意避免产生气泡，以免影响转染效率。
将转染试剂溶液缓慢滴加到含有细胞的培养皿中。
5. 恢复培养条件将含有转染试剂的培养皿置于恢复培养条件下，通常为37℃、5% CO2的培养箱中。
细胞需要一定时间来恢复并表达外源基因。
6. 分析转染效率通过荧光显微镜观察细胞是否发出荧光信号。
如果转染的是荧光探针，则直接观察细胞是否发出特定颜色的荧光。
如果转染的是外源基因，则需要进一步通过PCR或Western blot 等技术来验证外源基因是否成功表达。
细胞转染 Protocol
细胞转染是一种常用的生物技术，用于将外源基因或药物引入细胞中。
下面是细胞转染的实验原理、所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。
一、实验原理细胞转染是利用细胞膜的通透性，将带有特定基因或药物的载体分子导入细胞内。
常用的载体分子包括病毒载体和非病毒载体。
病毒载体如腺病毒、逆转录病毒等，能将外源基因高效地导入细胞中，但可能对细胞产生一定毒性。
非病毒载体如脂质体、阳离子聚合物等，相对安全，但导入效率较低。
通过细胞转染，可以实现对基因的表达调控，探索基因功能和药物筛选等研究。
二、所需试剂和耗材1.试剂：o培养基：如DMEM、F12等，用于细胞培养。
o血清：如胎牛血清，提供细胞生长所需的营养物质。
o抗生素：如青霉素、链霉素等，用于防止细胞污染。
o转染试剂：如Lipofectamine、Effectene等，用于细胞转染。
o DNA或RNA：携带目的基因的质粒或寡核苷酸。
2.耗材：o细胞培养瓶、板：用于细胞培养。
o离心管：用于细胞转染后洗涤和离心。
o移液器及枪头：用于精确加样。
o过滤器：用于过滤溶液中的杂质。
o无菌水：用于稀释和配制溶液。
三、实验仪器1.实验室搅拌器：用于混合溶液。
2.高速冷冻离心机：用于离心和分离细胞。
3.水浴锅：用于加热溶液。
4.无菌工作台或超净工作台：用于进行无菌操作。
5.分光光度计：用于测量细胞生长状况和转染效率。
6.荧光显微镜：用于观察细胞转染后荧光蛋白的表达情况。
7.CO2培养箱：提供细胞培养所需的气体环境。
四、准备工作1.仔细阅读实验步骤和注意事项，了解所需的试剂和耗材及其使用方法。
2.准备好所需的试剂和耗材，并确保它们处于保质期内。
3.检查实验室内是否具备上述实验仪器，并确保其正常运行。
4.用70%乙醇擦拭实验台面，以确保无菌环境。
5.用高压蒸汽灭菌法灭菌所有的实验器具，包括离心管、移液器等，需在适当的压力和温度下进行灭菌处理，以消除所有潜在的污染源。
细胞转染原理
细胞转染原理细胞转染是指将外源DNA或RNA导入到细胞内的过程，以实现对细胞进行基因表达或功能调控的研究。
在细胞转染中，常用的方法包括转染剂介导转染、电穿孔转染和病毒载体介导转染等。
转染剂介导转染是最常用的细胞转染方法之一。
转染剂可以与外源DNA或RNA形成复合物，通过与细胞膜结合，将外源DNA或RNA送入细胞内。
转染剂通常为阳离子型表面活性剂，例如聚乳酸-聚赖氨酸共聚物（PLL-PLA）、聚乳酸-聚乙二醇共聚物（PLL-PEG）等。
这些阳离子型表面活性剂可以与带负电的DNA或RNA结合，形成带正电的复合物，利用细胞膜上负电荷的磷脂头基与阳离子复合物结合，实现DNA或RNA 的转染。
电穿孔转染是通过短暂应用高压电脉冲来创建细胞膜上的微小孔道，以便外源DNA或RNA能够进入细胞内。
这种方法利用电场脉冲造成细胞膜的破裂和微小孔道的形成，称为电穿孔。
电穿孔方法可以有效地将外源DNA或RNA导入细胞质，但由于电穿孔对细胞的生存性有一定的损伤，因此应注意控制电场强度和脉冲长度，以及适当的电穿孔时间。
病毒载体介导转染是一种专门利用改造后的病毒作为载体将外源DNA或RNA导入细胞内的方法。
常用的病毒载体包括腺病毒（Adenovirus）、衣藻病毒（Chlorella virus）和慢病毒（Lentivirus）等。
这些病毒载体经过改造可以将外源DNA或RNA插入其基因组中，并通过感染细胞实现外源基因的表达。
病毒载体介导转染的优点是高效、特异性强，但也存在着生物安全性和病毒免疫应答的问题。
除了上述方法外，还存在其他一些基于特殊原理的转染方法，如快速制备亲和复合物介导转染、脂质体介导转染、基因枪介导转染等。
这些方法在特定的实验条件下使用，并根据不同的研究需要选择适合的转染方法。
细胞转染技术的发展为基因治疗、基因表达研究和细胞功能研究等领域提供了重要的实验手段。
不同的转染方法适用于不同类型的细胞和外源DNA或RNA的特性，研究人员可以根据实际需求选择适合的细胞转染方法，以实现理想的转染效果。
细胞转染原理
细胞转染原理细胞转染是一种常用的实验技术，用于将外源DNA、RNA或蛋白质等分子引入细胞内，以实现基因敲除、过表达、信号转导研究等目的。
细胞转染技术的原理是利用化学、物理或生物学方法，使外源分子穿过细胞膜，进入细胞内部。
本文将介绍细胞转染的原理及常用的转染方法。
细胞转染的原理主要包括细胞膜渗透性增加、内吞作用和融合作用。
首先，细胞膜渗透性增加是指通过物理或化学手段使细胞膜通透性增加，使外源分子能够穿过细胞膜进入细胞内。
其次，内吞作用是指细胞通过吞噬囊泡将外源分子包裹起来，形成内吞泡，然后将其输送到细胞内部。
最后，融合作用是指外源分子与细胞膜融合，直接进入细胞内。
常用的细胞转染方法包括化学转染、电穿孔法、基因枪法和病毒载体法。
化学转染是利用化学试剂（如聚乙烯亚胺、脂质体等）破坏细胞膜，使外源分子进入细胞内。
电穿孔法是利用电场作用使细胞膜通透性增加，使外源分子进入细胞内。
基因枪法是将外源分子包裹在微粒上，通过高速射击使其穿过细胞膜进入细胞内。
病毒载体法是利用病毒载体将外源分子转染入细胞内。
细胞转染技术在基因工程、细胞治疗、药物筛选等领域具有广泛的应用。
通过转染技术，可以实现基因敲除、外源基因表达、蛋白质功能研究等多种实验目的。
在细胞治疗领域，细胞转染技术可以用于将修饰后的细胞注入患者体内，治疗一些遗传性疾病或癌症。
在药物筛选领域，细胞转染技术可以用于快速筛选药物的活性和毒性，加快新药研发的速度。
总之，细胞转染技术是一种重要的实验手段，可以帮助科研人员进行基因功能研究、新药筛选和细胞治疗等工作。
通过深入了解细胞转染的原理和常用方法，可以更好地应用这一技术，推动科学研究和医学进步。
细胞转染sop
细胞转染步骤细胞转染是将外源分子如DNA，RNA导入真核细胞的技术。
它已成为一种研究基因表达调控，基因突变分析，蛋白质生产的常规方法，其应用范围越来越广。
细胞转染可分为瞬时转染和稳定转染两大类：瞬时转染，外源基因进入受体细胞后，存在于游离载体上，不整合在细胞的染色体上。
此时，外源DNA仍然以附加的形式存在于细胞内，因此，mRNA或蛋白质产物必须在短时间（1-3天）内进行测定或分析，而且质粒的人工构想和拷贝数可能会导致特异性调控元件失活或具有特异功能。
其优点是快捷、简单，易于对结果进行分析，因此成为启动子功能分析的首选方法。
稳定转染，外源DNA整合到宿主细胞的染色体上。
由于外源基因被整合到细胞的染色体中，使得调控区能更精确的模拟正常功能，对随后的转录分析没有时间限制。
缺点是需要进行药物筛选和细胞扩增，因此操作难度大，需要的周期较长。
转染的常见方法有：（一）物理介导法：电击法、显微注射法、基因枪法（二）化学介导法：DEAE-葡聚糖法、磷酸钙法、脂质体法（三）病毒介导法：腺病毒法、逆转录病毒法现在对于很多普通细胞系，常用的是瞬时转染方法中的脂质体法。
下面介绍下细胞转染的具体步骤：1.转染前准备：转染前一天，取生长状况良好的细胞，经胰酶消化成单个细胞后，计数。
根据实验需要，铺合适细胞量在板中，使第二天转染时的细胞密度达到80-90%。
2、细胞转染（1）在做转染实验前一般给细胞更换新鲜的完全培养基，并置于培养箱中继续培养。
最好是加入加血清但不含抗生素的培养基。
（2）准备几个无菌的1.5ml EP管，并做好标记。
一支EP管上标记DNA（即质粒的名字），一支EP管上标记lipofectamine2000。
（3）分别在两支EP管加入50微升的opti-MEM。
（4）在标记质粒的EP管里加入质粒，另一支EP管里加入脂质体。
（5）分别轻轻混匀，室温静置5min。
（6）再将含有质粒的opti-MEM培养基加入到含有脂质体的opti-MEM的培养基中。
细胞转染的最全知识介绍，收藏这一篇就够了······
细胞转染的最全知识介绍，收藏这一篇就够了······定义：细胞转染是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术。
应用：在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中。
简介：转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。
随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。
一、转染的途径大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类：1.物理介导：电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例。
2.化学介导：方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术。
3.生物介导：方法有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。
理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。
病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。
但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。
其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。
需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。
影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。
二、常规转染技术：1.瞬时转染（transient transfection）：外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其他调控元件的分析。
一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24~72h小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统和荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。
2.稳定转染（Stable transfected）：外源DNA既可以整合到宿主细胞中，也可能作为一种游离体（episome）存在。
细胞转染PPT课件
稳定转染子的选择
• 成功完成稳定转染需要高效DNA输送和筛选获得DNA的细胞的 方法。
• 筛选稳定表达转染DNA的细胞的最可靠方法之一是在用于转 染的DNA重组体或共转染至细胞的独立载体中加入选择标记 物，然后经过短暂的恢复期后，在细胞中应用适当的选择压 力。当共转染载体上表达选择标记物时，携带目的基因的载 体与携带选择标记物的载体的摩尔比应在5:1至10:1范围内， 以确保包含选择标记物的细胞也含有目的基因。
2019/8/2
尽管转染效率因细胞类型的不同而异，在104个转染 细胞中只有大约一个细胞可以稳定整合DNA (不论使用 的是线性还是环状DNA)。
没有一种方法可以适用于所有细胞和所有实验。必须 根据您的细胞类型和实验要求选择理想的方法，必须具 有高转染效率、低血细胞毒性、对正常生理学的影响最 小，且使用简单、可重复。
3、物理方法：将核酸直接导入细胞质或细胞核内。 显微注射、激光介导的转染
阳离子脂质体介导的输送
• 特殊设计的阳离子脂质体(如LipofectamineR转染试剂)可促进 DNA和siRNA进入细胞。基本结构包括带正电荷的头基和一个或 两个碳氢链。
• 采用阳离子脂质体试剂时，带负电荷的DNA与带正电荷的脂质 体自发结合，形成DNA-阳离子脂质体试剂复合物。一般认为， 转染复合物通过内吞作用进入细胞。
• 低毒性：病毒载体应尽量不对其感染的细胞的生理学造 成影响。
• 稳定性：一些病毒具有遗传不稳定性，会迅速重排基因 组。这会对使用病毒载体的操作的可预测性和可重复性产 生不利影响。
• 选择性：病毒载体应包含选择标记物，如特定的抗生素抗 性，从而可以分离出摄取了病毒载体的细胞。
SUCCESS
THANK YOU
细胞转染的方法和基本原理
细胞转染的方法和基本原理细胞转染是生物学研究中常用的实验技术，用于将外源DNA、RNA或蛋白质引入到靶细胞中。
本文将介绍细胞转染的方法和基本原理。
一、细胞转染的方法1. 化学法转染：化学法转染是最常用的细胞转染方法之一。
通过利用化学物质如聚乙烯亚胺（PEI）或脂质体等，将外源DNA或RNA 包裹成复合物，与细胞膜结合后进入细胞。
这种方法操作简单、成本低廉，适用于多种细胞类型。
但转染效率较低，对细胞有一定毒性。
2. 病毒载体转染：病毒载体转染是一种高效的细胞转染方法。
病毒载体可以将外源基因嵌入病毒基因组中，然后通过感染细胞的方式将基因导入细胞内。
常用的病毒载体有腺病毒、逆转录病毒等。
这种方法转染效率高，适用于多种细胞类型，但需要特殊设备和技术，同时也有一定的生物安全风险。
3. 电穿孔法转染：电穿孔法利用高压脉冲作用于细胞膜，破坏细胞膜结构，从而使外源DNA或RNA进入细胞。
这种方法操作简单，转染效率较高，但对细胞有一定的毒性，并且只适用于某些特定的细胞类型。
4. 基因枪法转染：基因枪法是一种生理穿孔法，通过利用高压气体或火药驱动基因枪，将外源DNA或RNA以微粒形式直接射入细胞。
这种方法适用于多种细胞类型，转染效率较高，但需要特殊设备和技术，并且对细胞有一定的毒性。
二、细胞转染的基本原理细胞转染的基本原理是通过一定的方法将外源DNA、RNA或蛋白质引入靶细胞，使其在细胞内表达或功能发挥。
转染后的细胞可以用于研究基因功能、蛋白质表达及相互作用等。
细胞转染的基本原理可以分为三个步骤：吸附、内化和表达。
1. 吸附：在化学法转染中，外源DNA或RNA会与载体相结合形成复合物，通过静电作用与细胞膜结合。
在病毒载体转染中，病毒载体会与细胞膜表面的受体结合。
吸附是转染的第一步，直接影响转染效率。
2. 内化：吸附后，外源DNA、RNA或蛋白质需要进入细胞内部。
在化学法转染中，复合物通过细胞膜的内吞作用或直接渗透进入细胞质。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
• G418是一种氨基糖苷类抗生素，其结构与 新霉素，庆大霉素，卡那霉素相似，通过 影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成，对 原核和真核细胞等都有毒性，包括细菌， 酵母，植物和哺乳动物细胞，也包括原生 动物和蠕虫。细菌Tn5转座子序列（neo抗 性基因）携带的氨基糖苷类磷酸转移酶可 以将G418转变成无毒性状。
为获得稳定表达外 源基因的单细胞克 隆 整合
目的
快速分析
未整合 目的DNA与宿主 染色体 随细胞分裂而稀释 随宿主细胞本身基 表达持续时间 至丢失48－72小时 因组一样复制，转 录，翻译，并被稳 定遗传 抗生素抗性 抗生素抗性
筛选办法
三、转染的方法
• 基因转染的基本方法可以分为： • （1）重组子的构建 • （2）基因转染真核细胞的方法
（2）腺病毒
四 转染后筛选
• 筛选所选用的抗生素跟转染所用的质粒上 所带的真核筛选抗性基因有关的 。 • 标有neo（实际上应该是neo resistance） 的载体，指载有降解新霉素的基因，新霉 素作用于原核和真核细胞，对两者都有杀 伤作用。用于转染后，稳定表达外源基因 细胞的阳性筛选。
• 标有amp（实际上应该是amp resistance） 的载体，指载有降解氨苄青霉素的基因（β －内酰胺酶），作用于原核细胞，只对敏 感菌有作用。用于克隆菌的筛选。 • 最常见的载体上带有新霉素抗性基因neo， 所以筛选的时候用G418 Байду номын сангаасG418是目前获 得稳转最常用的试剂之一。
4. DNA重组体的鉴定
外源DNA片断是否插入载体构成重组DNA分子，而
插入片断大小，是否突变及插入位置，顺序及方
向则关系到构建载体是否扩增，我们所需要的基 因或表达，表达相应的产品，所以需要进一步鉴 定DNA重组体 （1） 酶切鉴定是必需的，基于下述:
A. 限制性图谱个体特异性，不同的载体或
DNA分子物理图谱不同，酶切后片段大小不一样， 电泳图谱不一样。
对目的基因分段合成，连接，可以得到所需
的目的基因。
2.哺乳动物细胞表达载体的选择
哺乳动物细胞表达载体有2大类：质粒型载体和病毒 型载体 （1）质粒型载体 哺乳动物细胞质粒型载体大多数是通过细菌质 粒而获得的，主要是在质粒的基础上插入了一些病 毒或其他一些物种及人的基因表达调控序列。
A. 典型的哺乳动物细胞表达载体需要以下顺式作用元
利用高压电脉冲对细胞膜的干扰，使其 形成利于核酸进人的微孔。电穿孔技术可用于 瞬时转染和稳定转染，可方便地用于悬浮细胞， 重现性好，但需要较多的细胞。影响转染效率 的主要因素是脉冲强度和持续时间。必须找到 能够使核酸有效释放而又不杀死细胞的最佳平 衡点。
(2）显微注射法 该法虽然费力，但却是非常有效的将核 酸导人细胞或细胞核的方法。这种方法常用 来制备转基因动物，但不适用于需要大量转 染细胞的研究。
• 当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的 地方后，则能启动neo基因编码的序列转录 为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷 酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而 能在含有G418的选择性培养基中生长。目 前G418的这一特性已在基因转移，敲除， 抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛 应用。
• 转染是否成功的影响因素很多，如需要转 染的细胞类型（对于困难的细胞系尤其如 此），需要被转染的分子（DNA、RNA、 寡核苷酸、蛋白质），转染试剂等。但无 论在何种情况下，转染的成功均取决于转 染效率、低细胞毒性以及重现性这几个要 素。
• 此图所示是脂质体介导转染的示意图，它 显示了外源质粒进入细胞的一般过程。
• 【主要应用】:瞬时转染 稳定转染 • 【特点】：使用方法简单，可携带大片段 DNA，通用于各种类型的裸露DNA或RNA， 能转染各种类型的细胞，没有免疫原性。 虽在体外基因转染中有很高的效率，但在 体内，能被血清清除，并在肺组织内累积， 诱发强烈的抗炎反应，导致高水平的毒性， 很大程度上应用受限制。
• 5 转染方案 • 一般原则：建立一套适当的转染方案；首 先从一种标准方案开始，然后通过改变试 剂/DNA的配比和复合物的剂量进行优化。 • （1）转染复合物的制备 • （2）转染试剂/DNA配比（负载比） • （3）转染复合物的加入 • （4）形成转染复合物所用的稀释剂
• 6 时间进度 • 一般原则提示：要确保最终结果的成功； 建立一个合适的时间进度进行转染实验以 保证您所需要的目的蛋白能得到最佳表达。 • （1）转染的开始 • （2）培养基更换 • （3）时间测定
基因转染
报告内容
• 一 转染的简介 • 二 转染的分类 • 三 转染的方法 • 四 转染后筛选
一 、 转染的简介
1.基因转染:将具生物功能的核酸转移或 运送到细胞内并使核酸在细胞内维持 其生物功能。 2.基因转染技术已广泛应用于基因组功 能研究和基因治疗研究。
二 、转染的分类
瞬时转染 稳定转染
逆转录病毒的优点是，可以使外源基因整合到基 因组中，因而可以被稳定传代和表达。但是，由于逆 转录病毒的插入位点是随机的，因而在基因组内的整 合有可能破坏一些内源基因的结构，尤其是当插人到 一些重要的基因位点时会导致细胞的异常。
B.腺病毒载体
易于培养、纯化，在感染过程中复制与 转录依赖于宿主细胞的聚合酶，可插入较 大的外源基因片段，且腺病毒基因不会发 生整合，是研究真核基因的良好模型。
B. PCR或RT/PCR方法制备目的基因
a. 获取已知基因
据已发表的基因序列（或基因两侧序列已知）
→ 设计/ 合成一对引物 → PCR（基因组DNA为模板）
/RT-PCR(mRNA 为模板 ) → 从组织或细lyA 尾设计共同引物 → 将所用
重组子的构建
1.目的基因的制备和获取 2. 哺乳动物细胞表达载体的选择
3. DNA片断的重组连接
4. DNA重组体的鉴定
1.目的基因的制备和获取
(1)目的基因
是所要研究或应用的基因，也就是将要 克隆或表达的基因或基因的一个片段 (2)目的基因常用的制备方法
• A.限制酶切除 • a.从原核基因组DNA制备－视原核基因 组物理图谱已知或未知，克隆方法不同。 • b. 从真核基因组DNA制备 • c.从已克隆的DNA片段制备
• • • • •
1 细胞 （1）分裂细胞相比较非分裂细胞 （2）贴壁细胞相比较悬浮细胞 （3）传代次数 （4）细胞数量（融合率）
• 2 交叉污染 • 如果同一个实验室同时培养不同种类的细 胞，那就有可能发生交叉污染，即使遵循 最严格的分离操作规程这种情况也有可能 发生。如有许多细胞系被HeLa细胞所污染。 和其他细胞系之间的交叉污染不总是能通 过镜检发现。如果有少量某种生长快速的 细胞掺入到培养细胞种，几个月过后它们 就会完全取代目标培养物。
（3）基因枪法
该法依靠携带了核酸的高速粒子而将核 酸导人细胞内，这种方法适用于培养的细胞 和在体的细胞。
病毒颗粒是一类十分有效的基因释放系统， 因此，它是将外源基因导人大量细胞最有效的 方法。病毒感染具有高效率、可稳定遗传、适 用于各种不同来源的细胞及操作简单等优点。 但多数病毒有其潜在的危险性，操作者需要有 一定的病毒操作经验和良好的设施。 （1）逆转录病毒
(2). 磷酸钙共沉淀转染法
由于试剂易得、价格便宜而被广泛用于 瞬时转染和稳定染的研究。方法是，先将 DNA 和氯化钙混合，然后加人到 PBS 中慢慢 形成DNA磷酸钙沉淀，后把含有沉淀的混悬 液加到培养的细胞上，通过胞膜的内吞作 用摄人DNA。
• （3）.脂质体介导法（目前应用最广泛） • 【原理】：阳离子脂质体试剂与DNA混合 后，形成一种稳定的脂质双层复合物， DNA被包在脂质体中间，这种脂质双层复 合物可直接加到培养的细胞中，脂质体粘 附到细胞表面并与细胞膜融合，DNA被释 放到胞浆中。
• 利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒 性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度 以及转染的时间长短和培养基中血清的含 量都是影响转染效率的重要问题，通过实 验摸索的合适转染条件对于效率的提高有 巨大的作用。
• 此图为脂质体转染后荧光蛋白的表达
物理方法
包括电穿孔、显微注射及基因枪等方法。
（1）电穿孔法
• 3 载体DNA • 一般原则：对纯化所得的载体进行质量鉴 定。确定维持其正常功能的基因序列是否 适合于您的细胞体系。在测定细胞体系的 参数时，一定要选用一种已知具有功能的 载体做对照。 • （1）载体完整性 • （2）载体制备物
• 4 组织培养试剂 • 一般原则：优化您的细胞生长条件。只使 用新鲜配制的培养基和添加剂，并尽可能 减少所用试剂的变更。 • (1)基础培养基 • (2)胎牛血清 • (3)添加剂
谢谢指导！
mRNA 并逆转录成 cDNA 利用工具酶在 cDNA 末端加尾
→ 采用一对共用引物扩增所有cDNA，插入Bank信息，利用不 同种属同源性设计引物，尝试获取未知基因 片段，这有赖于各种计算机软件的应用。
D.化学合成法制备基因片段－用DNA合成仪，
基因转染真核细胞的方法
转染方 法
化学 转染法
物理 转染法
病毒 感染法
DEAE一 人工 磷酸钙 法 葡聚糖 法 脂质体 法
显微 注射 法
电穿孔 法 基因枪 法 逆转录病毒
腺病毒
(1).DEAE-葡聚糖
是最早应用哺乳动物细胞转染的试剂之 一。 DEAE- 葡聚糖是阳离子多聚体 , 它与带 负电的核酸结合后接近细胞膜而被摄取。 DEAE 一葡聚糖转染已成功地应用于瞬时开 始，但用于稳定转染却不可靠。
B. 同一载体连接不同的DNA片断，不同的载
体连接同一片段(片段上也有位点）酶切图谱是不
同的 。
C. 插入法(单酶单切点)或替代法(双酶双位点) 酶切，一般来说用3种限制酶切： ①可鉴定载体及 ②插入片段的大小,方 向 , 切后并电泳分析 , 以确定是否得到预期 的rDNA。 2）若构建DNA重组体是为了克隆某个基因， 可进行在序列测定。 （3）若构建表达载体，可进行表达产物鉴定。