土壤中分解尿素的细菌的分离与计数-课件
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土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(共20张PPT)
耐高温菌种提取耐高温酶。
启示： 根据它对生存条件的要求，到相应的环境中去寻找
（二）实验室中目的菌株筛选
原理 ： 人为提供有利于目的菌株生长的条件（包
括营养、温度、PH等），同时抑制或阻止
回答： 其他微生物生长。
1、在该配方中，为微生物生长提供碳 源和氮源的是什么物质？葡 只有萄能糖够、以尿尿素素
作为氮源的微生
C半固体培养基
D天然培养基
放在显微镜下进行计数。根据在显微镜下观察到的 微生物数目来计算出单位体积内的微生物总数。
优点：设备简单、能观察微生物的形态特征。 缺点：不能区分死菌和活菌；
难以计数微小的细菌。 一般用于纯培养悬浮液中各种单细胞菌体的计数。
2．间接计数法： 最常用稀释平板计数法。
原理： 1个活菌→1个菌落
统计原则 ①选 30~300 个菌落的平板统计 ②每个稀释度取3个平板取其平均值
关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质 地等等，都是区分细菌的重要手段。
4、鉴定： 筛选后必鉴定 鉴别培养基：不影响微生 物的生存
酚红培养基： 鉴定分解尿素的细菌。 原理：脲酶催化尿素分解 成氨→培养基碱性增强→ 酚 红变红→脲酶阳性
五、实验过程注意
1）取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前 都要灭菌。
2）应在火焰旁称取土壤 10 g。将称好的土样倒入 盛有90mL无菌水的锥形瓶中，塞好棉塞。
3）在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰 旁进行。
4）实验时要对培养皿作好标记。 注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。 5）为了提高效率，在操作时更加有条不紊，应当
事先规划时间。
六、结果分析与评价
注意：菌落计数偏差
1、统计的菌落数比活菌的实际数目 低 。这是因为当 两个或多个细胞在一起时，每平克板样上品中观的察菌到株的数只是 一个
土壤中分解尿素的细菌的分离和计数_课件
实验组
尿素唯一氮源 牛肉膏蛋白胨
对照组
生长多种微生物
选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微
生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
㈡.统计菌落数目：
1、显微镜直接计数： 血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品 中微生物的数量。
2. 稀释涂布平板法 （活菌计数法） （1）原理：
培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌：30～37℃培养1～2d 放线菌：25～28℃培养5～7d 霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。 在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。 选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止 因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
微生物的培养与观察
三.结果分析与评价
测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的 细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？
/v_show/id_XMjY3NDM3 MTg0.html
/v_show/id_XMTc3Mjg3OTU2.html
NaH2PO4 MgSO4`7H2O 葡萄糖 尿素
1.4g
2.1g 0.2g 10.0g 1.0g
琼脂
15.0g
①从物理性质看属于哪类？从功能上属于哪类培养基？
固体培养基
选择培养基 氮源：尿素
②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？ 碳源：葡萄糖、尿素
4、怎样证明此培养基具有选择性呢？
培养基类型
结果
只生长分解尿素细菌
◆分离不同的微生物采用不同的稀释度
测定土壤中细菌的数量，一般选用 104 105 106 测定放线菌的数量，一般选用103 104 105 测定真菌的数量，一般选用102 103 104
为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数ppt课件
培养基的种类情况
培养基
稀释倍数
103
104
105
106
平板1
242
210
202
102
选
择
平板2
250
240
86
98
培
养
平板3
310
250
198
120
基
平均数
162
106
牛肉膏蛋白胨 平板4
培养基
（对照）
菌落计数方法
例 不同浓度的平均菌落数
次 101
102
103
1 1365 164
20
2 2760 296
例：46（103）和296 （102）均在30～300之间，
则：46×103÷296×102≈1.6，
应取二者的平均值。
46×103÷296×102
(
0.1(ml)
) ÷2=3.775×105
3. 若所有稀释度的平均菌落数均大于300个，则应按稀释 度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表中例4)。
培养基配方三
1.4g 0.2g
Na2HPO4 葡萄糖
1.0g
琼脂
2.1g 10.0g 15.0g
（一）筛选菌株——尿素细菌的分离
1.原理：根据某种微生物的特殊营养要求或其对物理、化 学因素（营养、温度、pH等）的抗性而设计的。
2.功能：使混合菌群中的目的菌株变为优势菌，从而提高 该菌的筛选效果。
3.方法：利用选择培养基来实现。
105
106
107
101
10g土壤
9ml
无菌水
9ml 无菌水
104
105
106
课件2：2.2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
4．当培养基的某种营养成分为特定化学成分时， 也具有分离效果。例如，石油是惟一碳源时，可以 抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石 油的微生物生存，达到分离出能消除石油污染的微 生物的目的。 5．改变微生物的培养条件，也可以达到分离微生 物的目的，如将培养基放在高温环境中培养只能得 到耐高温的微生物。
专题2 微生物的培养与应用 课题2 土壤中分解尿素的细菌
的分离与计数
基础梳理
一、研究思路 1．自然界中目的菌株的筛选 (1)依据：根据它对__生__存__环__境___的要求，到相应的环境 中去寻找。 (2)实例：PCR技术过程中用到的耐高温的Taq DNA聚 合酶，就是从热泉中筛选出来的Taq细菌中分离到的。
3．重复组的结果是否一致如果学生选取的是同一种 土样，统计的结果应该__接__近_。
四、操作提示 1．无菌操作 (1)取土样的用具在使用前都需要_灭__菌__。 (2)应在火焰旁称取土壤，并在火焰附近将土样倒入烧 瓶中，塞好棉塞。 (3)在__稀__释___土壤溶液的过程中，每一步都要在__火__焰_ 旁操作。
2.本实验使用的 平板 和试管比较多，为了避 免混淆，最好在使用前就标记好。
3．规划时间 对于耗时较长的生物实验，要事先规划时间，以便提 高工作效率，在操作时更加有条不紊。
五、课题延伸 细菌合成的_脲__酶__将尿素分解成氨，使培养基的碱 性增强。在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红 指示剂培养细菌，若指示剂变_红__，可确定该种细 菌能够分解尿素。
例2 某同学在稀释倍数为106的培养基上测得
平板上的菌落数的平均值为234，那么每毫升样
品中菌落数是(涂布平板时所用稀释液的体积为
0.1 mL)( )
A．2.34×108
课题土壤中分解尿素的细菌的分离与计数ppt课件
〔1〕土样不同 〔2〕培育基被杂菌污染 〔3〕混入了其他的含氮物质
如何确定缘由究竟是什么？
二.实验的详细操作
㈠土壤取样
从肥沃、潮湿的土壤中取样。先铲去表层土3cm左
右，再取样，将样品装入事先预备好的信封中。
◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在运用前
灭菌
都要 。
㈡制备培育基 制以备尿素为独一氮源 的选择培育基。
⑵常用方法：稀释涂布平板法。
每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落 数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，
M代表稀释倍数。
本卷须知 ①为了保证结果准确，普通选择菌落数在30—3的00平板
上进展计数。
②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三 个以上的培育皿中，经涂布培育，计算出菌落平均数。
①从物理性质看此培育基属于哪类？ 固体培育基
㈡统计菌落数目：
1、显微镜直接计数：
利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中 微生物的数量。
缺陷：
不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需求相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以察看。
2.间接计数法〔活菌计数法〕 ⑴原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培育基上 所构成的一个菌落是由一个单细胞繁衍而成的，即一 个菌落代表原先的一个单细胞。
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分别与计数
一、课题背景
1、尿素的利用：
尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接 被之农 后作 才物 干吸被氨收植。物土利壤 用中 。的细菌将尿素分解成
2、细菌利用尿素的缘由：
脲酶
土3、壤反中响的式细：菌分解尿参素与是酚由红于指它示们剂能？合成 。
如何确定缘由究竟是什么？
二.实验的详细操作
㈠土壤取样
从肥沃、潮湿的土壤中取样。先铲去表层土3cm左
右，再取样，将样品装入事先预备好的信封中。
◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在运用前
灭菌
都要 。
㈡制备培育基 制以备尿素为独一氮源 的选择培育基。
⑵常用方法：稀释涂布平板法。
每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落 数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，
M代表稀释倍数。
本卷须知 ①为了保证结果准确，普通选择菌落数在30—3的00平板
上进展计数。
②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三 个以上的培育皿中，经涂布培育，计算出菌落平均数。
①从物理性质看此培育基属于哪类？ 固体培育基
㈡统计菌落数目：
1、显微镜直接计数：
利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中 微生物的数量。
缺陷：
不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需求相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以察看。
2.间接计数法〔活菌计数法〕 ⑴原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培育基上 所构成的一个菌落是由一个单细胞繁衍而成的，即一 个菌落代表原先的一个单细胞。
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分别与计数
一、课题背景
1、尿素的利用：
尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接 被之农 后作 才物 干吸被氨收植。物土利壤 用中 。的细菌将尿素分解成
2、细菌利用尿素的缘由：
脲酶
土3、壤反中响的式细：菌分解尿参素与是酚由红于指它示们剂能？合成 。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数人教版选修PPT课件
课题 2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
关于菌种的筛选和计数 1．菌株的筛选 (1)自然界中目的菌株的筛选 ①根据它对___生__存__环__境___的要求到相应的环境中去寻找。 ②从土壤中分离出目的菌株。 (2)实验室目的菌株的筛选 原理：人为提供有利于___目__的___菌株生长的条件(包括营 养、温度、pH 值等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。
测定真菌：选用稀释 102、103、104倍
细菌：30～37 ℃；1～2 d 培养与观察 放线菌：25～28 ℃；5～7 d
真菌：25～28 ℃；3～4 d
计数
每克样品中的菌株数＝(C/V)×M， C——某一稀释液浓度下平板上生长的平均菌落数；
V——涂布平板所用稀释液体积(ml)；M——稀释倍数
5
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 1．关于选择培养基 (1)概念：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长， 同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养 基。 (2)举例：以纤维素作唯一碳源的选择性培养基，可以分离 到分解纤维素的微生物；缺氮培养基可以分离到固氮微生物等。
答案：A
12
分离能分解尿素的细菌
【例 2】选择土壤中分解尿素的微生物，所用氮源为( )
A．硝酸
B．氨
C．尿素
D．蛋白胨
【名师点拨】：只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，缺
乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育
繁殖，从而受到抑制，所以，以尿素为唯一氮源的培养基能够
选择出分解尿素的微生物。
1
2．统计菌落数目的方法 (1)____直__接______计数法 ①过程：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在_显__微__镜___ 下计算一定容积里样品中微生物的数量。 ②缺点：不能区分死菌和活菌。 (2)间接计数法(活菌计数法) 根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个 ___单__细__胞_____繁殖而成，按比例稀释样品后，将稀释液接种培 养，统计___菌__落___的数目。
关于菌种的筛选和计数 1．菌株的筛选 (1)自然界中目的菌株的筛选 ①根据它对___生__存__环__境___的要求到相应的环境中去寻找。 ②从土壤中分离出目的菌株。 (2)实验室目的菌株的筛选 原理：人为提供有利于___目__的___菌株生长的条件(包括营 养、温度、pH 值等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。
测定真菌：选用稀释 102、103、104倍
细菌：30～37 ℃；1～2 d 培养与观察 放线菌：25～28 ℃；5～7 d
真菌：25～28 ℃；3～4 d
计数
每克样品中的菌株数＝(C/V)×M， C——某一稀释液浓度下平板上生长的平均菌落数；
V——涂布平板所用稀释液体积(ml)；M——稀释倍数
5
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 1．关于选择培养基 (1)概念：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长， 同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养 基。 (2)举例：以纤维素作唯一碳源的选择性培养基，可以分离 到分解纤维素的微生物；缺氮培养基可以分离到固氮微生物等。
答案：A
12
分离能分解尿素的细菌
【例 2】选择土壤中分解尿素的微生物，所用氮源为( )
A．硝酸
B．氨
C．尿素
D．蛋白胨
【名师点拨】：只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，缺
乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育
繁殖，从而受到抑制，所以，以尿素为唯一氮源的培养基能够
选择出分解尿素的微生物。
1
2．统计菌落数目的方法 (1)____直__接______计数法 ①过程：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在_显__微__镜___ 下计算一定容积里样品中微生物的数量。 ②缺点：不能区分死菌和活菌。 (2)间接计数法(活菌计数法) 根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个 ___单__细__胞_____繁殖而成，按比例稀释样品后，将稀释液接种培 养，统计___菌__落___的数目。
专题土壤中分解尿素的细菌的分离与计数ppt
收集不同类型和不同施肥方式的土壤样品，使用稀释平板法分离分解尿素的细菌。
02
土壤中分解尿素的细菌简介
土壤细菌的种类繁多，包括多种好氧性、厌氧性及兼性厌氧性的细菌。
土壤细菌在自然界的氮循环和物质转化中起到重要作用，如分解尿素等含氮有机物。
土壤细菌的种类与功能
分解尿素的细菌属于好氧性异养菌，能够利用尿素作为唯一氮源。
采集
将采集的土壤样品进行充分混合，避免样品中存在的差异对实验结果产生影响。
处理
培养基制备
制备尿素培养基，根据实验需求加入适量的酚红指示剂，以便更好地检测分解尿素的细菌。
接种
将处理过的土壤样品接种到尿素培养基上，接种量根据实验要求而定。
培养基的制备和接种
将接种后的培养基放入恒温箱中培养，每隔24小时将培养基转接到新鲜的培养基上，直到获得纯培养物。
未来研究方向
未来的研究应该进一步拓展分解尿素细菌的应用领域，例如在生物修复、污水处理等领域的应用，为环境保护和人类健康做出更大的贡献。
我们应该加强与国际同行之间的合作与交流，引进先进的技术和方法，推动我国在该领域的研究和发展。同时，也应该积极举办和参加国际会议和学术交流活动，提高我国在该领域的国际知名度和影响力。
分光光度计间接计数法
同位素标记法
利用同位素标记物掺入细菌细胞中，用仪器检测同位素标记物的放射性，以推算细菌数量。
要点一
要点二
流式细胞计数法
将样品细胞染色后，利用流式细
05
土壤中分解尿素的细菌的应用前景
促进农作物生长
土壤中分解尿素的细菌能够将尿素分解为氨和二氧化碳，为农作物提供营养，促进其生长。
这类细菌具有尿素酶，能够将尿素分解成氨，以供细胞利用。
土壤中分解尿素的细菌分离和计数ppt课件
A 土壤取样，应选取肥沃、湿润的土壤 B 先铲去表层土3-8cm左右，再取样 C 取样用的小铁铲和信封在使用前不用灭菌 D 应在火焰旁称取土壤
2、下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离”实验步骤排列
正确的是 ①土壤取样
C
②称取10g土壤加入盛有90ml无菌水的锥形瓶中
③吸取0.1ml进行平板涂布
④依次稀释至101、102、103、104、105、106、107 稀释度
不正确的是（D）
A 用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨，高温、高压灭菌后道平板 B 取104、105、106 倍土壤稀释液和无菌水各0.1ml涂布不同平板 C 将实验组和对照组平板倒置，37℃恒温培养24h-48h D 确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的平板进行计数。
15
利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过程中， 从对应稀释倍数为106的培养基中，A、B两同学分别 得到以下两种统计结果。
稀释倍数： 测细菌数： 一般用104、105、106稀释液
测放线菌： 一般用103、104、105稀释液 测真菌数： 一般用102、103、104稀释液
思考：为什么分离不同的微生物要用不同的稀释度？
土壤中各类微生物的数量不同
如果是第一次做这个实验，稀释倍数的范围
可以放宽103-107.
20
1 、关于土壤取样的叙述，错误的是（ C ）
是
。
(3)示意图A和B中,
表示的是用稀释涂布平
板法接种培养后得到的结果。
(4)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部
分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现:振
荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因
是：振荡培养能提高培养液中
的含量，同时可
2、下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离”实验步骤排列
正确的是 ①土壤取样
C
②称取10g土壤加入盛有90ml无菌水的锥形瓶中
③吸取0.1ml进行平板涂布
④依次稀释至101、102、103、104、105、106、107 稀释度
不正确的是（D）
A 用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨，高温、高压灭菌后道平板 B 取104、105、106 倍土壤稀释液和无菌水各0.1ml涂布不同平板 C 将实验组和对照组平板倒置，37℃恒温培养24h-48h D 确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的平板进行计数。
15
利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过程中， 从对应稀释倍数为106的培养基中，A、B两同学分别 得到以下两种统计结果。
稀释倍数： 测细菌数： 一般用104、105、106稀释液
测放线菌： 一般用103、104、105稀释液 测真菌数： 一般用102、103、104稀释液
思考：为什么分离不同的微生物要用不同的稀释度？
土壤中各类微生物的数量不同
如果是第一次做这个实验，稀释倍数的范围
可以放宽103-107.
20
1 、关于土壤取样的叙述，错误的是（ C ）
是
。
(3)示意图A和B中,
表示的是用稀释涂布平
板法接种培养后得到的结果。
(4)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部
分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现:振
荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因
是：振荡培养能提高培养液中
的含量，同时可
2.2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(共63张PPT)
跟踪练习 1. 分析下列培养基配方，回答有关问题。 MgSO4 KH2PO · 青霉素 琼脂 蒸馏水 FeSO4 NaNO3 成分 葡萄糖 4 7H2O 0.1万 1g 0.01 g 3g 0.5 g 15 g 1L 含量 30 g 单位 (1)根据物理性质，该培养基属于________ 固体 培养基；根据用途划 选择 培养基。根据培养基成分，所培养微生物的同化 分，则属于________ 作用的类型是________ 异养 。 (2)不论何种培养基，在各种成分溶化后，分装前，要进行的是 ________________ 。 调节pH
2．结果分析与评价 (1)在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成 了氨。氨会使培养基的碱性增强，pH 升高。因此，我们可以通过检测 培养基 pH 的变化来判断该化学反应是否发生。 (2)在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细 菌后，如果该细菌能够分解尿素，则 p严格厌氧型：短时 间的有氧也会造成 生长停滞或死亡， 如某些甲烷杆菌兼 性厌氧型：无氧时 进行无氧呼吸，有 氧时进行有氧呼 吸，如酵母菌一般 厌氧型：有、无氧 都进行无氧呼吸， 如某些链球菌
典例精析 (多选)依据不同的划分标准，培养基的类型不同，作用也不 同。下表中划分培养基的依据和培养基的类型及作用，正确的匹配是 ( ) 为了筛选土壤中能够降解某除草剂的细菌(目的菌)。有人做了如下图 实验：
3．对分解尿素细菌的鉴定 (1)原理 脲酶 CO2＋2NH3 CO(NH2)2＋H2O――→ 可通过检测pH的变化来判断该化学反应是否发生。 (2)方法 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细 菌，若指示剂变红，则pH升高，说明该种细菌能分解尿素。
许多细菌如变形杆菌、沙门氏菌和葡萄球菌，可将尿中的尿素分 解成氨，其代谢类型大都属于异养厌氧型； 大肠杆菌可将大便中的尿素分解成氨，其代谢类型属于异养、兼 性厌氧型。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 PPT课件
25mL全营养LB固体培养基： 0.25g蛋白胨，0.12g酵母提取物，0.25g氯化钠和0.25g琼脂糖， 水25mL，灭菌。
方法步骤
❖ 土壤取样：从富含有机物、潮湿、PH≈7的土壤中取样。铲 去表层土，在距地表约3～8cm的土壤层取样。
❖ 制备培养基：准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基。牛肉 膏蛋白胨培养基作为对照，用来判断选择培养基是否起到了 选择作用。
❖ 为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释 度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能 分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相 同吗？
附答案
❖ 统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能 统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值， 然后按课本旁栏的公式进行计算。
❖ 这是因为土壤中各类微生物的数量(单位：株 /kg)是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本 中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万，放 线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因此， 为获得不同类型的微生物，就需要按不同的 稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提 供选择培养的条件。
土壤中分解尿素的细菌的分离 与计数
实验重点:
❖ 筛选菌株 ❖ 统计菌落数目
目录
❖ 实验原理 ❖ 目的要求 ❖ 材料用具 ❖ 试剂配制 ❖ 方法步骤 ❖ 结果分析与讨论 ❖ 思考题 ❖ 附答案
一、
原理
分 离
使用专一培养 基（含有尿素） 可从土壤中分 离出分解尿素 的细菌。
统计菌落数目
稀释涂布法常 用来统计样品 中活菌的数目。
设置对照 以LB全营养 培养基做为以 尿素为唯一氮 源的选择性培 养基的对照， 来证明专一培 养基的选择作 用。
筛选菌株
❖ 实验室中微生物的筛选应用的原理
➢ 人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、 温度、PH值等)，同时抑制或阻止其他微生物生 长。
方法步骤
❖ 土壤取样：从富含有机物、潮湿、PH≈7的土壤中取样。铲 去表层土，在距地表约3～8cm的土壤层取样。
❖ 制备培养基：准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基。牛肉 膏蛋白胨培养基作为对照，用来判断选择培养基是否起到了 选择作用。
❖ 为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释 度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能 分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相 同吗？
附答案
❖ 统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能 统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值， 然后按课本旁栏的公式进行计算。
❖ 这是因为土壤中各类微生物的数量(单位：株 /kg)是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本 中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万，放 线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因此， 为获得不同类型的微生物，就需要按不同的 稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提 供选择培养的条件。
土壤中分解尿素的细菌的分离 与计数
实验重点:
❖ 筛选菌株 ❖ 统计菌落数目
目录
❖ 实验原理 ❖ 目的要求 ❖ 材料用具 ❖ 试剂配制 ❖ 方法步骤 ❖ 结果分析与讨论 ❖ 思考题 ❖ 附答案
一、
原理
分 离
使用专一培养 基（含有尿素） 可从土壤中分 离出分解尿素 的细菌。
统计菌落数目
稀释涂布法常 用来统计样品 中活菌的数目。
设置对照 以LB全营养 培养基做为以 尿素为唯一氮 源的选择性培 养基的对照， 来证明专一培 养基的选择作 用。
筛选菌株
❖ 实验室中微生物的筛选应用的原理
➢ 人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、 温度、PH值等)，同时抑制或阻止其他微生物生 长。
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提示:碳源主要是葡萄糖,氮源是尿素。琼脂的作用是作为凝固剂。 (2)该培养基对微生物是否具有选择作用?如果具有,是如何进行选 择的? 提示:该培养基对微生物有选择作用。该培养基的氮源比较特殊, 是尿素,只允许能以尿素作为氮源的微生物生长。 (3)该培养基属于何种类型? 提示:该培养基属于固体培养基,又属于选择培养基。
迁移与应用 1 用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数,在对应稀释倍 数为 106 的培养基中,得到以下几种统计结果,正确的是( )。 A.涂布了一个平板,统计的菌落数是 230 B.涂布了两个平板,统计的菌落数是 215 和 260,取平均值 238 C.涂布了三个平板,统计的菌落数分别是 21、212 和 256,取平均值
3.决定样品稀释度的因素是什么?一般而言,测定细菌、放线菌和真 菌数量所选择的稀释度分别是多少?
提示:决定样品稀释度的主要因素是样品中要测定的微生物的数 量,数量越多稀释度应越大。由于细菌菌体小、繁殖快、数量多,所以稀 释度一般较大,为 104~106;放线菌为 103~105;真菌菌体大、繁殖慢、数量 少,稀释度一般较小,为 102~104。
预习交流 1
——为筛选菌株而配制的培养基有何特点? 筛选菌株所用的培养基具有能满足需筛选微生物正常生长所需的 营养物质或条件,而不利于非筛选微生物的生长。 此类培养基可通过哪些方法来实现其选择作用? 提示:(1)在培养基中加入某种化学物质。例如,加入青霉素可以分离 出酵母菌和霉菌;加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。这里的 加入是在培养成分的基础上加入。
(3)如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌株数? 提示:统计某一稀释度下平板上的菌落数,最好统计 3 个平板,计算 出平板菌落数的平均值,然后按公式:每克样品中的菌株数=(C/V)×M 进 行计算,其中,C 代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数,V 代表涂 布平板时所用的稀释液的体积(mL),M 代表稀释倍数。
取样涂布(在上述培养基的 9 个平板底面,每三个一组 分别用记号笔写上 104、105、106 倍的三种稀 释液,然后用三支 1 mL 无菌吸管分别由 104、 105、106 倍的三管土壤稀释液中吸取 0.1 mL 对号放入已写好稀释度的平板中,用无菌涂布 器在培养基表面轻轻地涂布均匀)
培养观察(将培养基平板倒置于 30~37 ℃温室中培养 1~2 天,每隔 24 小时统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果,算出 同一稀释度的三个平板上的菌落平均数)
课堂合作探究
问题导学
一、研究思路
活动与探究 1 1.寻找目的菌株的思路是什么? 提示:根据目的菌株对生存环境的要求,到相应的环境中去寻找。
2.阅读教材第 22 页第一段旁栏中的相关内容,并思考回答下列问 题。
(1)在培养基的配方中,为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是 什么物质?琼脂的作用是什么?
(2)改变培养基中的营养成分。例如,缺乏氮源时可以分离固氮微生 物;石油作为唯一碳源时,可以分离出能消除石油污染的微生物;缺乏碳 源时可以分离自养微生物。
(3)改变微生物的培养条件。例如,将培养基放在高温环境中培养可 以得到耐高温的微生物。
3.统计菌落数目 (1)测定微生物数量的常用方法有活菌计数法和显微镜直接计数法。 (2)稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目 ①为了保证结果准确,一般设置多于 3 个平板,选择菌落数在 30~300 的平板进行计数,并取平均数。 ②统计的菌落数往往比活菌的实际数目少,因此,统计结果一般用 菌落数而不是用活菌数来表示。 4.设置对照 设置对照的主要目的是比照实验组,排除其他因素的干扰,证明确 实是所测试的条件引起相应的结果。
2.实验注意事项 (1)建立“无菌观念”,整个实验操作过程要严格无菌操作:实验器材、 工作台、实验者、空气都要严格消毒灭菌,包括取土样的小铁铲和盛土 样的信封使用前也要灭菌。 (2)称取、稀释都要在酒精灯火焰附近的无菌环境中进行。 (3)规范操作,实验结束后一定要洗手、消毒,以防被致病微生物感染。
1.“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”的实验步骤 土壤取样(从肥沃、湿润的土壤中,用无菌小铁铲铲去表层土,迅速取土 壤并装入无菌信封密封)
制备培养基(准备选择培养基)
样品的稀释(在火焰旁称取土壤 10 g,放入盛有 90 mL 无菌水的三 角烧瓶中,振荡使土样与水充分混合,将菌分散。制成 10 倍土壤稀释液, 用一支 1 mL 无菌吸管从中吸取 1 mL 土壤悬液注入盛有 9 mL 无菌水 的试管中,吹吸三次,使其充分混匀,制成 102 倍土壤稀释液,以此类推制 成 103、104、105、106 倍土壤稀释液)
预习交流 2
——菌落对应生命系统的哪一层次? 由一个细菌通过细胞增殖而形成的肉眼可见的子细胞群体叫做菌 落。 (1)构成菌落的单个菌体和菌落分别对应生命系统的哪一层次? 提示:1 个菌体对应生命系统的细胞层次和个体层次;1 个菌落对应 生命系统的种群层次。 (2)构成同一个菌落的细菌遗传物质有何特点? 提示:如不考虑基因突变,构成同一个菌落的细菌应具有相同的遗 传物质,因为细菌的增殖方式不是减数分裂,不发生遗传基因的重组。
2.结果分析与评价 (1)在细菌分解尿素的化学反应中,细菌合成的脲酶将尿素分解成 了氨。氨会使培养基的碱性增强,pH 升高。因此,我们可以通过检测培 养基 pH 的变化来判断该化学反应是否发生。 (2)在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂,培养某种细 菌后,如果该细菌能够分解尿素,则 pH 升高,指示剂将变红。
2.为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度? 提示:土壤中各类微生物的数量(单位:个/kg)是不同的,如在干旱土 壤中的上层样本中:好氧及兼性厌氧细菌数约为 2 185 万,放线菌数约为 477 万,霉菌数约为 23.1 万。因此,为获得不同类型的微生物,就需要按 不同的稀释度进行分离,同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。
163 D.涂布了三个平板,统计的菌落数分别是 210、240 和 250,取平均
值 233
解析:在设计实验时,一定要涂布至少 3 个平板,作为重复组,才能增 强实验的说服力与准确性,所以 A、B 两项不正确。C 项虽涂布了 3 个 平板,但是,其中 1 个平板的计数结果与另两个相差太远,说明在操作过 程中可能出现了错误,因此,不能简单地将 3 个平板的计数值用来求平 均值。因此,正确答案为 D。
4.在对菌落计数时,为什么要每间隔 24 h 统计一次菌落数目? 提示:菌种中有些菌体增殖快,有些菌体增殖慢,所以培养时间要充 足,使得每个菌体都能形成肉眼可观察到的菌落。并且选取菌落数目稳 定时的数据作为结果,以防止因培养时间不足而遗漏某些菌落。 5.测定饮水中大肠杆菌数量的方法是什么? 提示:将一定体积的水用细菌过滤器过滤后,将滤膜放在伊红美蓝 培养基上培养,大肠杆菌菌落呈现黑色,通过计数得出水样中大肠杆菌 的数量。
3.样品中微生物数量的统计思路是什么? 提示:当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落来源 于样品稀释液中的一个活菌,通过统计培养基上的菌落数可推知样品 中的活菌数。 4.用活菌计数法统计菌落数时,为什么统计的菌落数比活菌的实际 数目低? 提示:因为对细菌接种时存在两个或多个细胞相连现象,当两个或 多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落。
操 作 方 法
(1)用计数板计数时,先将待测样品制成悬液。(2)取 一定量的悬液放在显微镜下进行计数。(3)根据在显 微镜下观察到的微生物数目来计算出单位体积内 的微生物总数
确性。 (2)为了保证结果准 确,一定要选择恰当 的稀释度。 (3) 选 择 菌 落 数 在
30~300 的平板计数,
并计算平均值
课题 2 土壤中分解尿素的细菌的分离 与计数
课前预习导学
目标导航
学习目标 1.说明选择培养基的用途和配制要
求。 2.进行微生物的选择培养和样品中微生 物数量的测定。
重点难点 重点:对土样的选取和选择培
养基的配制。 难点:对分解尿素的细菌数量的计 数。
预习导引
一、研究思路
1.课题背景 尿素是一种重要的氮肥,但农作物不能(能、不能)直接吸收利用,而 是首先通过土壤中的细菌将尿素在脲酶的催化下分解为氨之后,才能 被植物吸收。 2.筛选菌株 微生物筛选的原理:人为提供有利于目的菌株生长的条件,同时抑 制或阻止其他微生物生长,如可从热泉中将 Taq 细菌筛选出来。
二、实验设计
1.实验设计的内容 实验设计包括对实验方案,所需仪器、材料、用具和药品,具体的实 验步骤以及时间安排等的综合考虑和安排。 2.土壤中的微生物 土壤中的微生物主要分布在距地表 3~8 cm 的近中性土壤中,约 70%~90%为细菌。 3.样品的稀释 因为不同微生物在土壤中含量不同,为保证获得菌落数在 30~300 之间,适于计数的平板;细菌稀释倍数为 104、105、106,放线菌稀释倍数 为 103、104、105,真菌稀释倍数为 102、103、104。
缺 不能区分死菌与活菌,难以计数微小的细菌。不适 只能计活菌数,受稀
点 于对运动细菌的计数;需要相对高的细菌浓度
释度影响很大
二、实验设计
活动与探究 2 1.阅读教材中第 22~23 页“(三)设置对照”内容中的楷体字部分,请 帮助 A 同学设置对照实验,以排除其他同学所质疑的可能影响实验结 果的因素。 提示:另增加两个组别:一个不进行接种,但培养条件和其他组别完 全相同,以排除培养基被杂菌污染的可能;一个接种不能以尿素为氮源 的微生物,培养条件和其他组别完全相同,以排除培养基中混入了其他 含氮物质的可能。
答案:D
统计菌落数目的方法
显微镜直接计数法
间接计数法(活菌计数法)
利用特定细菌计数板或 当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的
原 血细胞计数板,在显微镜 一个菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌。
理 下计算一定容积的样品 通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中
迁移与应用 1 用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数,在对应稀释倍 数为 106 的培养基中,得到以下几种统计结果,正确的是( )。 A.涂布了一个平板,统计的菌落数是 230 B.涂布了两个平板,统计的菌落数是 215 和 260,取平均值 238 C.涂布了三个平板,统计的菌落数分别是 21、212 和 256,取平均值
3.决定样品稀释度的因素是什么?一般而言,测定细菌、放线菌和真 菌数量所选择的稀释度分别是多少?
提示:决定样品稀释度的主要因素是样品中要测定的微生物的数 量,数量越多稀释度应越大。由于细菌菌体小、繁殖快、数量多,所以稀 释度一般较大,为 104~106;放线菌为 103~105;真菌菌体大、繁殖慢、数量 少,稀释度一般较小,为 102~104。
预习交流 1
——为筛选菌株而配制的培养基有何特点? 筛选菌株所用的培养基具有能满足需筛选微生物正常生长所需的 营养物质或条件,而不利于非筛选微生物的生长。 此类培养基可通过哪些方法来实现其选择作用? 提示:(1)在培养基中加入某种化学物质。例如,加入青霉素可以分离 出酵母菌和霉菌;加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。这里的 加入是在培养成分的基础上加入。
(3)如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌株数? 提示:统计某一稀释度下平板上的菌落数,最好统计 3 个平板,计算 出平板菌落数的平均值,然后按公式:每克样品中的菌株数=(C/V)×M 进 行计算,其中,C 代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数,V 代表涂 布平板时所用的稀释液的体积(mL),M 代表稀释倍数。
取样涂布(在上述培养基的 9 个平板底面,每三个一组 分别用记号笔写上 104、105、106 倍的三种稀 释液,然后用三支 1 mL 无菌吸管分别由 104、 105、106 倍的三管土壤稀释液中吸取 0.1 mL 对号放入已写好稀释度的平板中,用无菌涂布 器在培养基表面轻轻地涂布均匀)
培养观察(将培养基平板倒置于 30~37 ℃温室中培养 1~2 天,每隔 24 小时统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果,算出 同一稀释度的三个平板上的菌落平均数)
课堂合作探究
问题导学
一、研究思路
活动与探究 1 1.寻找目的菌株的思路是什么? 提示:根据目的菌株对生存环境的要求,到相应的环境中去寻找。
2.阅读教材第 22 页第一段旁栏中的相关内容,并思考回答下列问 题。
(1)在培养基的配方中,为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是 什么物质?琼脂的作用是什么?
(2)改变培养基中的营养成分。例如,缺乏氮源时可以分离固氮微生 物;石油作为唯一碳源时,可以分离出能消除石油污染的微生物;缺乏碳 源时可以分离自养微生物。
(3)改变微生物的培养条件。例如,将培养基放在高温环境中培养可 以得到耐高温的微生物。
3.统计菌落数目 (1)测定微生物数量的常用方法有活菌计数法和显微镜直接计数法。 (2)稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目 ①为了保证结果准确,一般设置多于 3 个平板,选择菌落数在 30~300 的平板进行计数,并取平均数。 ②统计的菌落数往往比活菌的实际数目少,因此,统计结果一般用 菌落数而不是用活菌数来表示。 4.设置对照 设置对照的主要目的是比照实验组,排除其他因素的干扰,证明确 实是所测试的条件引起相应的结果。
2.实验注意事项 (1)建立“无菌观念”,整个实验操作过程要严格无菌操作:实验器材、 工作台、实验者、空气都要严格消毒灭菌,包括取土样的小铁铲和盛土 样的信封使用前也要灭菌。 (2)称取、稀释都要在酒精灯火焰附近的无菌环境中进行。 (3)规范操作,实验结束后一定要洗手、消毒,以防被致病微生物感染。
1.“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”的实验步骤 土壤取样(从肥沃、湿润的土壤中,用无菌小铁铲铲去表层土,迅速取土 壤并装入无菌信封密封)
制备培养基(准备选择培养基)
样品的稀释(在火焰旁称取土壤 10 g,放入盛有 90 mL 无菌水的三 角烧瓶中,振荡使土样与水充分混合,将菌分散。制成 10 倍土壤稀释液, 用一支 1 mL 无菌吸管从中吸取 1 mL 土壤悬液注入盛有 9 mL 无菌水 的试管中,吹吸三次,使其充分混匀,制成 102 倍土壤稀释液,以此类推制 成 103、104、105、106 倍土壤稀释液)
预习交流 2
——菌落对应生命系统的哪一层次? 由一个细菌通过细胞增殖而形成的肉眼可见的子细胞群体叫做菌 落。 (1)构成菌落的单个菌体和菌落分别对应生命系统的哪一层次? 提示:1 个菌体对应生命系统的细胞层次和个体层次;1 个菌落对应 生命系统的种群层次。 (2)构成同一个菌落的细菌遗传物质有何特点? 提示:如不考虑基因突变,构成同一个菌落的细菌应具有相同的遗 传物质,因为细菌的增殖方式不是减数分裂,不发生遗传基因的重组。
2.结果分析与评价 (1)在细菌分解尿素的化学反应中,细菌合成的脲酶将尿素分解成 了氨。氨会使培养基的碱性增强,pH 升高。因此,我们可以通过检测培 养基 pH 的变化来判断该化学反应是否发生。 (2)在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂,培养某种细 菌后,如果该细菌能够分解尿素,则 pH 升高,指示剂将变红。
2.为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度? 提示:土壤中各类微生物的数量(单位:个/kg)是不同的,如在干旱土 壤中的上层样本中:好氧及兼性厌氧细菌数约为 2 185 万,放线菌数约为 477 万,霉菌数约为 23.1 万。因此,为获得不同类型的微生物,就需要按 不同的稀释度进行分离,同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。
163 D.涂布了三个平板,统计的菌落数分别是 210、240 和 250,取平均
值 233
解析:在设计实验时,一定要涂布至少 3 个平板,作为重复组,才能增 强实验的说服力与准确性,所以 A、B 两项不正确。C 项虽涂布了 3 个 平板,但是,其中 1 个平板的计数结果与另两个相差太远,说明在操作过 程中可能出现了错误,因此,不能简单地将 3 个平板的计数值用来求平 均值。因此,正确答案为 D。
4.在对菌落计数时,为什么要每间隔 24 h 统计一次菌落数目? 提示:菌种中有些菌体增殖快,有些菌体增殖慢,所以培养时间要充 足,使得每个菌体都能形成肉眼可观察到的菌落。并且选取菌落数目稳 定时的数据作为结果,以防止因培养时间不足而遗漏某些菌落。 5.测定饮水中大肠杆菌数量的方法是什么? 提示:将一定体积的水用细菌过滤器过滤后,将滤膜放在伊红美蓝 培养基上培养,大肠杆菌菌落呈现黑色,通过计数得出水样中大肠杆菌 的数量。
3.样品中微生物数量的统计思路是什么? 提示:当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落来源 于样品稀释液中的一个活菌,通过统计培养基上的菌落数可推知样品 中的活菌数。 4.用活菌计数法统计菌落数时,为什么统计的菌落数比活菌的实际 数目低? 提示:因为对细菌接种时存在两个或多个细胞相连现象,当两个或 多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落。
操 作 方 法
(1)用计数板计数时,先将待测样品制成悬液。(2)取 一定量的悬液放在显微镜下进行计数。(3)根据在显 微镜下观察到的微生物数目来计算出单位体积内 的微生物总数
确性。 (2)为了保证结果准 确,一定要选择恰当 的稀释度。 (3) 选 择 菌 落 数 在
30~300 的平板计数,
并计算平均值
课题 2 土壤中分解尿素的细菌的分离 与计数
课前预习导学
目标导航
学习目标 1.说明选择培养基的用途和配制要
求。 2.进行微生物的选择培养和样品中微生 物数量的测定。
重点难点 重点:对土样的选取和选择培
养基的配制。 难点:对分解尿素的细菌数量的计 数。
预习导引
一、研究思路
1.课题背景 尿素是一种重要的氮肥,但农作物不能(能、不能)直接吸收利用,而 是首先通过土壤中的细菌将尿素在脲酶的催化下分解为氨之后,才能 被植物吸收。 2.筛选菌株 微生物筛选的原理:人为提供有利于目的菌株生长的条件,同时抑 制或阻止其他微生物生长,如可从热泉中将 Taq 细菌筛选出来。
二、实验设计
1.实验设计的内容 实验设计包括对实验方案,所需仪器、材料、用具和药品,具体的实 验步骤以及时间安排等的综合考虑和安排。 2.土壤中的微生物 土壤中的微生物主要分布在距地表 3~8 cm 的近中性土壤中,约 70%~90%为细菌。 3.样品的稀释 因为不同微生物在土壤中含量不同,为保证获得菌落数在 30~300 之间,适于计数的平板;细菌稀释倍数为 104、105、106,放线菌稀释倍数 为 103、104、105,真菌稀释倍数为 102、103、104。
缺 不能区分死菌与活菌,难以计数微小的细菌。不适 只能计活菌数,受稀
点 于对运动细菌的计数;需要相对高的细菌浓度
释度影响很大
二、实验设计
活动与探究 2 1.阅读教材中第 22~23 页“(三)设置对照”内容中的楷体字部分,请 帮助 A 同学设置对照实验,以排除其他同学所质疑的可能影响实验结 果的因素。 提示:另增加两个组别:一个不进行接种,但培养条件和其他组别完 全相同,以排除培养基被杂菌污染的可能;一个接种不能以尿素为氮源 的微生物,培养条件和其他组别完全相同,以排除培养基中混入了其他 含氮物质的可能。
答案:D
统计菌落数目的方法
显微镜直接计数法
间接计数法(活菌计数法)
利用特定细菌计数板或 当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的
原 血细胞计数板,在显微镜 一个菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌。
理 下计算一定容积的样品 通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中