甲基化特异性PCR技术的分析及改良_杨少辉

近年来甲基化在恶性肿瘤发生发展中的作用已是肿瘤研究的热点。国外建立了甲基化特异性ＰＣＲ（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃＰＣＲ，ＭＳＰ）方法，成为目前研究ＤＮＡ甲基化的标准方法和基础。ＭＳＰ方法包含亚硫酸氢钠的修饰过程，存在碱基的转换，因而比普通ＰＣＲ复杂，影响因素多，操作难度大。在人类多种肿瘤中存在死亡相关蛋白激酶（ｄｅａｔｈ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ，ＤＡＰＫ）基因高甲基化。我们应用ＭＳＰ法检测了胃癌患者胃黏膜组织中ＤＡＰＫ基因的甲基化状况，分析并改良了该实验技术。

１资料与方法

１．１资料

胃癌手术切除之胃黏膜组织共１３０例，其中石蜡包埋组织５４例，为我科１９９８年１２月至２０００年５月间手术切除组织存档标本；新鲜组织７６例，为我科２００５年２月至２００５年８月间手术切除的组织。患者术前均未经辅助放、化疗。正常对照标本取自无消化系统疾病及任意肿瘤的正常人外周血，ＥＤＴＡ抗凝。１．２试剂

ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ购自美国Ｆｌｕｋａ公司，亚硫酸氢钠购自美国Ｓｉｇｍａ公司，ＷｉｚａｒｄＤＮＡＣｌｅａｎ－ＵｐＳｙｓｔｅｍ购自美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司，Ｔａｑ酶购自大连宝生生物公司。甲基化酶ＳｓｓⅠ为美国ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ公司产品，引物委托大连宝生物公司合成。

１．３方法

实验于２００５年９月至２００５年１１月进行。采用标准的酚－氯仿－异戊醇方法提取组织ＤＮＡ，取４μｇＤＮＡ，去离子水稀释至９０μｌ。加３ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ１０μｌ，４２℃水浴加热３０ｍｉｎ，其间配制２０ｍｍｏｌ／Ｌｈｙｄｒｏ－ｑｕｉｎｏｎｅ和４．８ｍｏｌ／Ｌ亚硫酸氢钠（ｐＨ５．０）。将标本插入冰中，静置２～３ｍｉｎ，加ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ２６μｌ和亚硫酸氢钠６４０μｌ，颠倒混匀，覆盖矿物油，５５℃避光水浴孵育１６ｈ。取出，用ＷｉｚａｒｄＤＮＡＣｌｅａｎ－ＵｐＳｙｓｔｅｒｍ纯化，按说明书操作。收集８０μｌ洗脱液加入３ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ１１μｌ，３７℃孵育１５ｍｉｎ，加入７０μｌ８ｍｏｌ／Ｌ乙酸胺中和，加０．５μｇ糖原和３倍体积预冷无水乙醇，颠倒混匀，－２０℃过夜沉淀。４℃离心，离心半径为８２ｍｍ，１３２００ｒ／ｍｉｎ（美国ｓｉｇｍａ公司，）离心２０ｍｉｎ沉淀ＤＮＡ，加７５％冷乙醇２００ｍｌ漂洗，１０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃上清，自然风干，用５０μｌＴＥ溶解ＤＮＡ。冰上配制ＰＣＲ反应体系（２０μｌ），其中含修饰后的ＤＮＡ模本２μｌ。采用热启动法，９５℃预变性５ｍｉｎ之后进行４０个循环的反应，反应条件及引物序列参照文献［１］。取５μｌＰＣＲ产物在２．５％琼脂糖凝胶上电泳，ＧｅｎｅＦｉｎｄｅｒ染料染色。每批标本均同时扩增甲基化酶ＳｓｓⅠ修饰和未修饰的正常人外周血ＤＮＡ作为甲基化阳性和非甲基化阳性对照，以去离子水替代

甲基化特异性ＰＣＲ技术的分析及改良

杨少辉戴冬秋

【摘要】目的分析并改良甲基化特异性ＰＣＲ（ＭＳＰ）技术。方法采用改良ＭＳＰ法检测胃癌患

者胃黏膜组织中ＤＡＰＫ基因的甲基化情况。结果１００％的新鲜组织和２４．１％的石蜡包埋组织至少可以

得到甲基化和非甲基化产物中的一种产物。结论该法操作简便、灵敏度高、特异性强，适用于对新鲜组

织的检测，但在石蜡包埋组织的研究中较为困难。

【主题词】甲基化特异性ＰＣＲ技术

【中图分类号】Ｒ７３５．２【文献标识码】Ａ【文章编号】１００６－９８０１（２００６）０９－０５９４－０２

Ａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎＹＡＮＧＳｈａｏ－ｈｕｉ，ＤＡＩ

Ｄｏｎｇ－ｑｉｕ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｎｃｏｓｕｒｇｅｒｙ，ＴｈｅＦｉｒｓｔＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌ，ＣｈｉｎａＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ

１１０００１，Ｃｈｉｎａ

【Ａｂｓｔｒａｃｔ】ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏａｎａｌｙｚｅａｎｄｉｍｐｒｏｖｅＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ．

ＭｅｔｈｏｄｓＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｓｔａｔｅｏｆＤＡＰＫｉｎｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｔｈｉｓｉｍｐｒｏｖｅｄＭＳＰ．Ｒｅｓｕｌｔｓ１００％

ｏｆｆｒｏｚｅｎｔｉｓｓｕｅｓａｎｄ２４．１％ｏｆｐａｒａｆｆｉｎ－ｅｍｂｅｄｄｅｄｔｉｓｓｕｅｓｃｏｕｌｄｇｅｔｅｉｔｈｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｅｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｒｕｎｍｅｔｈｙ－

ｌａｔｅｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＩｍｐｒｏｖｅｄＭＳＰｉｓａｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｗａｙｔｏｓｃｒｅｅｎＤＮＡ

ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｆｏｒｆｒｏｚｅｎｔｉｓｓｕｅｓ，ｂｕｔｆｏｒｐａｒａｆｆｉｎ－ｅｍｂｅｄｄｅｄｔｉｓｓｕｅｓ，ｉｔｍａｙｂｅｕｎｓｕｉｔａｂｌｅ．

【Ｓｕｂｊｅｃｔｗｏｒｄｓ】Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ

基金项目：国家自然科学基金资助项目（３０２７１４７７，３０５７２１６２）；

教育部留学回国人员科研启动基金资助项目（２００２２４７）；教育部“高

等学校博士学科点专项科研基金”资助项目（２００５０１５９００１）

作者单位：１１０００１沈阳，中国医科大学附属第一医院肿瘤外科

通讯作者：戴冬秋，Ｅｍａｉｌ：ｄａｉｄｑ６３＠１６３．ｃｏｍ

・临床研究・

ＤＮＡ模本的反应体系作为阴性对照。

２结果

用甲基化特异性和非甲基化特异性引物扩增甲基化酶ＳｓｓⅠ修饰和未修饰的正常人外周血ＤＮＡ时，分别只有Ｍ引物和Ｕ引物得到预期大小的扩增片段，阴性对照未得到任何产物，提示实验技术及所用引物和试剂正确，实验结果可信（图１）。石蜡标本的实验成功率为２４．１％（１３／５４），其中甲基化标本８例。新鲜标本的实验成功率为１００．０％（７６／７６），甲基化率为６７．１％（５１／７６）。所有标本中，２７例同时得到甲基化和非甲基化产物，３２例只有甲基化产物，３０例只有非甲基化产物。

３讨论

ＭＳＰ方法由Ｈｅｒｍａｎ等［２］于１９９６年首创，该方法利用了ＰＣＲ灵敏、快速、简便的特点，已经成为当前检测ＤＮＡ甲基化的最常用方法之一。但该方法是基于亚硫氢酸钠修饰的ＤＮＡ，而该修饰过程对ＤＮＡ的破坏较大，操作繁琐，加之修饰后的ＤＮＡ质量较差，处于单链状态，不易保存和进行ＰＣＲ扩增，有待进一步改进。

我们通过采用ＭＳＰ法检测胃癌患者胃黏膜组织中ＤＡＰＫ基因甲基化的情况，分析并改良了ＭＳＰ方法，主要包括以下几个方面：

（１）亚硫酸氢钠修饰。亚硫酸氢钠修饰需要在ＤＮＡ变性的基础上进行，而一旦Ｃ开始脱氨基，碱基不再配对，ＤＮＡ变性温度下降。在修饰反应的高盐浓度条件下，ＤＮＡ易退火形成不完全配对的双链。我们将ＤＮＡ溶液从水浴中取出后立即插入冰中静置２～３ｍｉｎ，使ＤＮＡ溶液温度迅速下降，然后在冰上加新鲜配制的亚硫酸氢钠和ｈｙ－ｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ，可以有效的防止ＤＮＡ复性。

（２）纯化。纯化试剂盒是整个ＭＳＰ实验中最昂贵的试剂。该产品１ｍｌ树脂的ＤＮＡ结合能力为２０μｇ，而常规ＭＳＰ实验中树脂的利用率不及１／１０，我们为了更充分利用资源，一般取４～５μｇＤＮＡ进行亚硫酸氢钠修饰，这

样就能用于更多基因的研究。（３）ＰＣＲ反应。由于ＤＮＡ双链中总是存在非甲基化的Ｃ，使得修饰后的ＤＮＡ双链不再完全配对，容易形成二级结构，ＰＣＲ扩增时不易解链。因而我们认为采用热启动法ＰＣＲ扩增是非常重要的。使用需热活化的Ｔａｑ酶或在９５℃恒温条件下（９５℃变性５ｍｉｎ后将ＰＣＲ仪设为暂停）加入普通Ｔａｑ酶都能达到热启动的目的。

（４）ＭＳＰ的质量控制。与普通ＰＣＲ不同，ＭＳＰ的阳性对照包括甲基化的甲基化阳性对照和非甲基化的非甲基化阳性对照两种，阴性对照为未加模本ＤＮＡ的空白对照。本组实验采用了甲基化酶ＳｓｓⅠ修饰和未修饰的正常人外周血ＤＮＡ作为甲基化阳性和非甲基化阳性对照，以去离子水替代ＤＮＡ模本的反应体系作为阴性对照。一些文献中将非甲基化阳性对照当作实验的阴性对照，我们认为这是不恰当的，因为同一份标本中的同一ＤＮＡ片段序列完全可以同时存在甲基化和非甲基化两种状态，例如在我们的研究中４５．８％（２７／５９）的甲基化阳性标本同时存在甲基化和非甲基化的ＤＡＰＫ基因。理想的结果是甲基化和非甲基化阳性对照都阳性，阴性对照阴性，三者任意一条不符合都标志着实验的失败。

（５）修饰后ＤＮＡ的保存。正如前述，修饰后的ＤＮＡ双链不再完全配对，失去其原有的二级结构，而易于降解，再加上由于我们实验室冰箱的门频繁开关，普通冰箱内温度达不到其应有的温度，所以我们认为将暂时不用（约５ｄ以上）的修饰后ＤＮＡ放入－７０℃冰箱中保存是很明智的做法。（６）ＭＳＰ标本。Ｃｏｏｍｂｓ等［３］的研究发现，从石蜡包埋组织中提取ＤＮＡ做普通ＰＣＲ的最高成功率为６１．３％，可能是ＤＮＡ在组织固定和脱蜡提取过程中降解严重所致。本组石蜡标本的实验成功率只有２４．１％，远低于新鲜组织（１００％），因而我们认为用石蜡标本作ＭＳＰ实验时一定要慎重。

ＭＳＰ技术检测基因甲基化状态敏感度高，并且可以避免限制性酶切不全所带来的假阳性结果，能同时检测多个ＣｐＧ位点的甲基化情况，是研究基因甲基化的较为实用的技术。

参考文献

１ＷａｋｉＴ，ＴａｍｕｒａＧ，ＳａｔｏＭ，ｅｔａｌ．Ｐｒｏｍｏｔｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｓｔａｔｕｓｏｆ

ＤＡＰ－ｋｉｎａｓｅａｎｄＲＵＮＸ３ｇｅｎｅｓｉｎｎｅｏｐｌａｓｔｉｃａｎｄｎｏｎ－ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ

ｇａｓｔｒｉｃｅｐｉｔｈｅｌｉａ［Ｊ］．ＣａｎｃｅｒＳｃｉ，２００３，９４（４）：３６０－３６４．

２ＨｅｒｍａｎＪＧ，ＧｒａｆｆＪＲ，ＭｙｏｈａｎｅｎＳ，ｅｔａｌ．Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ２ｓｐｅｃｉｆｉｃＰＣＲ：

ＡｎｏｖｅｌＰＣＲａｓｓａｙｆｏｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｓｔａｔｕｓｏｆＣｐＧｉｓｌａｎｄｓ［Ｊ］．ＰｒｏｃＮａｔｌ

ＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，１９９６，９３（１８）：９８２１－９８２６．

３ＣｏｏｍｂｓＮＪ，ＧｏｕｇｈＡＣ，ＰｒｉｍｒｏｓｅＪＮ．ＯｐｔｉｍｉｓａｔｉｏｎｏｆＤＮＡａｎｄ

ＲＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｆｒｏｍａｒｃｈｉｖａｌｆｏｒｍａｌｉｎ－ｆｉｘｅｄｔｉｓｓｕｅｓ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ

ＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９９，２７（１６）：ｅ１２．

作者简介：杨少辉，男，硕士研究生。

（收稿日期：２００６－０３－１７；修回日期：２００６－０６－１２）

（本文编辑：白润萍校对：

李旭清）