骨髓细胞学检查一

铁染色（Iron stain）
细胞外铁的划分标准: (-)：无颗粒。 (+)：有少数铁颗粒或偶见铁小珠(颗粒体积大于嗜酸性粒细胞的颗粒者 称为铁小珠)。 (++)：有较多的铁颗粒或小珠。 (+++)：有很多的铁颗粒、小珠和少数小块状。 (++++)：有极多铁颗粒、小珠，并有很多的小块，密集成堆。 铁粒幼细胞划分： Ⅰ型：幼红细胞内含1～2个小铁颗粒。 Ⅱ型：幼红细胞内含3～5个小铁颗粒。 Ⅲ型：幼红细胞内含6～10个小铁颗粒，或1-4个大铁颗粒。 Ⅳ型：幼红细胞内含10个以上小铁颗粒，或5个以上大铁颗粒。 环形铁粒幼细胞：环形铁粒幼细胞环形铁粒幼细胞的标准为含铁粒在 6 个 以上,其中 2/3 以上的铁粒围核成完全或不完全性环形 ( 围核 1/2 以上的区域有铁粒环绕 ) 。
（二）显示
普鲁士蓝法：细胞内、外铁与酸性亚铁氰化钾作用， 形成蓝色亚铁氰化铁沉淀。 雪夫反应：过碘酸氧化细胞内糖类中乙二醇基形成乙 醛基，醛基与雪夫试剂作用，使无色品红形成红色沉 淀。 四唑盐法 金属沉着法 其他尚有物理学方法，如脂溶性染料染色（显示脂质 ）、荧光显示、放射自显影以及体外活体染色亦常用 于临床血液细胞学诊断。
铁染色（Iron stain）
5.临床意义： 1）鉴别缺铁性贫血和非缺铁性贫血：IDA时骨髓细胞外铁 显著减少或消失，铁粒幼红细胞明显减少，所见铁粒 细小色浅，且以Ⅰ型为主，Ⅱ型极少见，Ⅲ型以上不 见。经铁剂治疗后细胞外铁及内铁可迅速增多，此检 查是诊断IDA及指导铁剂治疗的一种辅助方法；非IDA， 如HA、MA、AA等病人的细胞外铁通常增高，内铁亦增 高，以Ⅰ型、Ⅱ型为主，可以见到Ⅲ型，罕见Ⅳ型。 因此，有助于鉴别IDA与非IDA。 2）用于诊断铁粒幼细胞性贫血：能找到数量不等的环形 铁粒幼细胞，多见粗颗粒的Ⅲ型与Ⅳ型铁粒幼细胞。 3）用于诊断伴环形铁粒幼细胞增多的MDS：骨髓中环形铁 粒幼细胞＞15%。
结构，故在染色时应尽量保持细胞的生前结构、化学 成分和酶活性，反应产物应是有色沉淀物，具有一定
的稳定性。

血细胞化学染色可显示糖原、脂类、酶、蛋白质，包 括某些氨基酸、蛋白质SH基、结合的糖蛋白、粘蛋白 、核酸（包括RNA，DNA）、及无机盐等。

血细胞化学染色首先是要固定骨髓片或血片，然后才
是各种定性、定量的特殊染色。
过氧化物酶染色（POX)
5. 临床意义 POX染色是鉴别急性粒细胞白血病(acute myeloblastic leukemia, AML) 、急性单核细胞白血 病(acute monocytic leukemia, AMOL) 、 急性淋巴 细胞白血病(acute lymphocytic leukemia, ALL) 的 重要细胞化学染色方法。AML时白血病细胞可呈阳性 反应, 阳性颗粒一般较多， 较粗大，常呈局限性分 布；ALL时白血病细胞呈阴性反应；AMOL时白血病细 胞呈阴性或弱阳性反应，阳性时颗粒稀少、细小， 呈弥散分布。

流式细胞仪测定单个细胞内的化学成分含量。
以细胞受色反应的强弱比色，常用于RNA、DNA定量测定和
各阶段幼红细胞胞浆中血红蛋自定位、定量等。
1985年国际血液学标准化委员会 （ICSH）推荐了五种方法，即：

过氧化物酶法、碱性磷酸酶法、酸性磷 酸酶法、氯乙酸AS-D蔡酚酯酶法、非特 异性酯酶法。
磷酸酶染色（NAP）

白血病FAB分型：过氧化物酶染色，氯乙酸ASD萘酚酯酶染色，过碘酸-雪夫反应， α-丁酸萘酚酯 酶染色 +氟化钠抑制试验
铁染色（Iron stain）
1.目的 掌握骨髓铁染色(bone marrow iron stain) 的原理、方 法、注意事项及临床意义。
2. 原理 骨髓小粒中的含铁血黄素称细胞外铁，其所含的三价铁 经稀盐酸处理后而游离，并能与酸性亚铁氰化钾溶液发生 普鲁士蓝反应，生成蓝色亚铁氰化铁沉淀，定位于含铁的 部位。细胞内铁也可用此法显示，根据反应的强弱可了解 骨髓中铁的含量。 4 Fe3+ ＋ 3 K4［Fe（CN）6］→ Fe4〔Fe（CN）6〕3＋12 K+ （含铁物质） （亚铁氰化钾） （亚铁氰化铁）
过氧化物酶染色（POX)
3. 方法步骤 1) 取0.1％TMB乙醇溶液1ml，加亚硝基铁氰化钠饱和溶液10μl，溶 液呈淡棕黄色。染色液应在临用前配制。 2) 在新鲜干燥的涂片上，加0.1％TMB-亚硝基铁氰化钠饱和溶液的 混合试剂0.5ml，放置1min后，再加稀过氧化氢溶液0.7ml，吹匀， 染色6min。 3) 直接用流水冲洗，待干，再用瑞氏染液复染15～20min。 4) 流水冲洗后，待干，用油镜镜检。 5) 结果判断 在细胞质中出现蓝色或蓝黑色颗粒为阳性反应。 阴 性：无颗粒。 弱阳性：颗粒小，分布稀疏。 阳 性：颗粒略粗，分布较密集。 强阳性：颗粒粗大，密布于整个胞质中。




（三）细胞化学定量

粗略估量，以染色反应的强弱，受色的深浅，人为地区别为阴 性和各种程度的阳性。

百分法，只能反映细胞阳性率，不能反映受色强弱。 积分法，是常用的半定量法，将前述的等级估量与百分率相结 合（计算方法见碱性磷酸酶染色），它既反映了细胞阳性率的 高低，又反映了细胞受色的强弱。
铁染色（Iron stain）
3.方法步骤 1) 干燥涂片用甲醇固定10min，待干。 2) 玻片上滴满酸性亚铁氰化钾，37℃染色30min。 3) 用蒸馏水冲洗后用核固红染液复染10～15min。 4) 流水冲洗，待干，镜检。 5) 结果判断 (1) 幼红细胞核呈鲜红色，胞质呈淡黄红色，铁粒呈蓝绿色。 (2) 细胞外铁 用低倍镜观察涂片，特别是涂片尾部和髓粒附 近，注意翠蓝色颗粒的存在，可分五级标准。 (3) 细胞内铁 用油镜计数100个中、晚幼红细胞，记录胞质中 含有蓝色铁颗粒的细胞(铁粒幼细胞)的百分率。根据细胞内 铁颗粒的数目、大小、染色深浅和颗粒分布的情况，将铁粒 幼细胞分为四型。
碱性磷酸酶染色（NAP）
4. 注意事项： 1）磷酸萘酚盐和重氮试剂品种繁多，应根据基质选择相适 应的重氮盐，坚牢蓝等重氮盐的质量好坏是本法成败的 关键。 2）基质孵育液必须临用前新鲜配制，先应将血膜固定干燥 后，才开始配制基质液。 3）若无2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇，可用巴比妥缓冲液 (pH9.2)或0.2mol/L Tris缓冲液(pH9.2)代替。
碱性磷酸酶染色（NAP）
5. 临床意义： 临床上主要用于鉴别： 1）慢性粒细胞白血病与类白血病反应： 慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia, CML)(无继发性感染者)时，NAP积分一般明显下降，积分 常＜13分，甚至为零分；类白血病反应(leukemoid reaction)时则显著增高，积分常＞200分。 2）阵发性睡眠性血红蛋白尿症与再生障碍性贫血： 阵发性睡眠性血红蛋白尿症(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, PNH)常降低；再生障碍性贫血常增高， 病情好转时，NAP积分则可逐渐下降。 3）急性白血病的细胞类型： ALL增高，AML下降。
（一）固定

固定有物理法与化学法，
前者为干燥和火焰固定， 后者最常用的是甲醛、乙醇、丙酮和醋酸等。
（二）显示

偶氮偶联法：这类方法多利用人工合成的酶底物，在
酶作用下，产生分解产物，再与重氮盐结合引起偶氮 偶联，使其形成不溶性的偶氮色素，以此证明酶的存
在。

联苯胺法：粒细胞和单核细胞中的过氧化物酶作用于 过氧化氢，释放新生态氧，使无色的联苯胺形成蓝色 沉淀。
这些方法学在白血病的鉴别诊断上很重 要，须对其染色方法和临床意义加以充 分地理解。下面介绍几种常用的细胞化 学染色方法。

过氧化物酶染色（POX)
1. 目的: 了解过氧化物酶染色的原理、方法、注意事项和临床意义。
2. 原理: （四甲基联苯胺法） 粒细胞和部分单核细胞的溶酶体颗粒中含有过氧化物酶 (peroxidase, POX)，POX能将底物四甲基联苯胺 (tetramethylbenzidine,TMB)氢离子传递给H2O2，使之氧化为 四甲基联苯胺蓝。四甲基联苯胺蓝又可与亚硝基铁氰化钠结合， 再进一步氧化形成稳定的蓝色颗粒，定位于细胞质酶所在部位。 若无亚硝基铁氰化钠，四甲基联苯胺蓝则自我脱氢氧化成棕色 的四甲基苯醌二胺沉着于酶所在部位。
白血病细胞化学染色概述

细胞化学染色，是一种以形态为基础，结合运用化学
或生物化学技术对血细胞内各种化学成分作定位、定 性及半定量分析的方法。

用于研究血细胞生理、病理和化学结构； 临床上为某些血液病的诊断、鉴别诊断、疗效观察、 预后监测和发病机制的探讨，提供重要依据。

白血病细胞化学染色概述
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血细胞化学染色的基本要求是在原位显示细胞成分和
环形铁粒幼红细胞
铁染色（Iron stain）
4.注意事项： 1）玻片需经去铁处理 将新玻片用清洁液浸泡24h， 取出后反复水洗浸入95%酒精中24h，晾干，再浸 泡在5%盐酸中24h，用双蒸水反复浸洗玻片，取出 烤干后备用。 2）骨髓取材要满意，外铁一定要有骨髓碎块或颗粒， 取材不佳时，往往影响结果。 3）酸性亚铁氰化钾溶液须新鲜配制。
第三节 骨髓细胞学检查 一、常用血细胞化学染色
昆明医科大学第二附属医院 徐益恒
血细胞化学染色
是以细胞形态学为基础， 运用生物化学或化学技术 对血细胞内化学成分、代谢产物等进行定性/定位 /半定量检查的方法 用于某些血液的诊断、疗效观察及预后判断。
本节课主要任务

机体铁储备状况：骨髓铁染色
感染性及白血病鉴别诊断：中性粒细胞碱性
过氧化物酶染色（POX)
阳性—胞浆中见兰黑色或深棕色沉淀。 阴性—胞浆中未见兰黑色或深棕色沉淀。 （四）结果评判 弱阳性 — 胞浆中见少量弥散细小阳性颗粒。 阳 性 — 胞浆中见较多粗大阳性颗粒。 强阳性 — 胞浆中见大量粗大阳性颗粒。 （五）正常阳性细胞 中性粒细胞 强阳性 嗜酸粒细胞 强阳性 单 核 细胞 弱阳性或阳性（弥散状）
碱性磷酸酶染色（NAP）
3. 方法步骤： 1) 新鲜干燥的涂片用冷10%甲醛甲醇固定液固定30s，流水轻轻冲 洗30～60s，待干。 2) 把涂片浸入基质孵育液中，在室温(冬季放水浴箱)下温育10～ 15min。 3) 流水冲洗1 ～ 2min，加苏木素染色液中复染5～8min，流水冲 洗，待干，镜检。 4) 结果判断 胞质中出现紫黑色或棕红色颗粒为阳性。 判断标准如下： 0分：胞质中无阳性染色颗粒。 1分：胞质中含少量颗粒或呈弥漫浅色。 2分：胞质中含中等量的颗粒或呈弥漫着色。 3分：胞质中含较多颗粒或弥漫较深色。 4分：胞质中充满粗大颗粒或弥漫深色。 5) 计算阳性率和积分值。
AML-M1
M1 - POX(+)
×
过氧化物酶染色（POX)
4. 注意事项： 1）涂片应新鲜制作、厚薄适宜。 2）TMB 配制在85％～88％的乙醇溶液中染色效果较好，勿 用90％～95％乙醇，否则细胞表面蛋白质很快凝固，妨碍试 剂向胞内渗入而使显色反应减弱或消失。 3）过氧化氢溶液需新鲜配制，其浓度与加入量不能随意更 改。涂片中粒细胞看不见阳性颗粒，红细胞呈棕色或绿色， 即表示过氧化氢过浓。若过氧化氢加于血片上不产生气泡， 则示无效。 4）染色液适宜pH值应为5.5，若pH值 <5.0会出现假阳性结 果。 5）试剂应置于低温暗处，防止光线照射失效。 6）染色时加稀过氧化氢溶液之后必须与染色液充分混匀， 否则同一片子上细胞染色情况不一致。
碱性磷酸酶染色（NAP）
阳性 — 胞浆中可见兰色(红色)沉淀物。 阴性 — 胞浆中未见兰色(红色)沉淀物。 （四）结果评判 （—）0分：胞浆无沉淀物（无色） （—）1分：胞浆见浅灰色，无颗粒或有少量细小颗粒但小于胞浆1/4面积。 （—）2分：胞浆见浅棕黑色，有较粗黑色颗粒但小于胞浆1/2面积。 （—）3分：胞浆见粗大黑色颗粒，可达胞浆面积3/4以上。 （—）4分：胞浆见粗大深黑色颗粒，达胞浆全部面积甚至可掩盖于胞核上。 （五）正常阳性细胞 在血细胞中除成熟中性粒细胞阳性外，其他细胞基本呈阴性。 中性粒细胞NAP活力正常范围2% - 56% 正常积分4 - 80分/100个中性粒细胞
碱性磷酸酶染色（NAP）
1. 目的： 掌握卡氏偶氮偶联法测定中性粒细胞碱性磷酸酶染色的 原理、方法、注意事项和临床意义。 2. 原理： 中性粒细胞胞质中的碱性磷酸酶在pH9.6的碱性条件下能 水解磷酸萘酚，生成萘酚，后者与重氮盐偶联形成不溶性的 有色沉淀定位于胞质中的酶活性处。重氮盐有多种，常用的 有坚牢蓝RR、坚牢蓝BB、坚牢紫酱等。