荧光原位杂交在微生物学中的应用及进展

第22卷哈尔滨师范大学自然科学学报

Vol .22,No .52006

第5期

NAT URAL SC I E NCES JOURNAL OF HARB I N NOR MAL UN I V ERSI TY

荧光原位杂交在微生物学中的应用及进展

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王继华 杨茹冰 李　晶

(哈尔滨师范大学)

【摘要】　荧光原位杂交技术广泛用于分析复杂环境的微生物群落构成,可以在自然生境中监测和鉴定微生物,并能对未被培养的微生物进行检测.r RNA 为靶序列

寡核苷酸或P NA 探针的荧光原位杂交能提供微生物的形态学、数量、空间分布等信息,现已成为环境科学研究领域中的热点技术.本文对荧光原位杂交技术的发展和在环境微生物学中的应用进行了综述,探讨了该技术应用和发展前景.

关键词:荧光原位杂交;16S r RNA;寡核苷酸探针;P NA;环境微生物;微生物生态学

收稿日期:2006-04-11

3黑龙江省教育厅科技研究资助项目,(10541090),哈尔滨师范大学大学生科技创新基金资助项目,(2005-04)

0　引言

目前,在环境综合治理如废水、废气和固体废弃物的净化和处理中广泛应用生物学方法,因此只有充分了解微生物生态学和群落演替规律等,才能提高环境科学研究中的生物学效能,推动和深化环境整治工作,合理利用环境资源.传统菌种分离培养的鉴定方法不仅耗时费力,而且不能精确的反映混合菌群的组成和多样性,对于一些培养条件要求较苛刻或未被培养的细菌往往不能达

到预期效果[1]

.

近几年,随着分子生物学技术如分子杂交、PCR 、核酸测序等的发展,微生物学研究领域发生

了深刻的变革,灵敏的检测和精确的细菌鉴定成为可能.借助分子生物学方法进行特异微生物的快速检测和鉴定已成为现代微生物诊断和生态学研究的重要手段.荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridizati on,F I SH )结合了分子生物学的精确性和显微镜的可视性信息,可以在自然或人工的微生境中监测和鉴定不同的微生

物个体,同时对微生物群落进行评价.F I SH 被广

泛应用于揭示微生物的原位生理学特性和功能,现已成为微生物分子生态学研究的重要技术手段.

1　F I SH 的发展和技术原理

1969年,Pardue 等

[2]

和John [3]

两个研究小组

发明了原位杂交技术(in situ hybridizati on,F I SH ),放射性标记的DNA 或28s RNA 被杂交到

细胞制备物上,通过放射自显影技术(m icr oaut oradi ography,MAR )检测杂交位点,这一技术可以在保持细胞形态完整性的条件下,使核酸序列在细胞内被检测.

其原理是:F I SH 技术检测核酸序列通过荧光标记的探针在细胞内与特异的互补核酸序列杂交,通过激发杂交探针的荧光来检测信号.荧光染料受一定波长(激发波长)的光激发后会发射荧光(发射波长),所以用滤光镜选择合适的激发波长的光,即可显示某一特定的荧光染料.常用的荧光染料的DAP I (在UV 光激发下发出蓝色荧光),

F I TC和荧光素(蓝光下发出绿色荧光)以及罗丹明和德克萨斯红(绿光激发下产生红色荧光),由于F I SH的信号空间分辨率高,不同的DNA探针可以用不同的半抗原标记,再用不同的荧光染料进行同时检测(复色F I A H,Multicol or F I SH,Mc-F I SH)[7].

荧光素标记的核苷酸类似物可以被用于直接和间接的原位杂交实验.最初用直接法标记杂交后检测步骤简化,背景清晰.然而其通常弊病是比间接法敏感性低.但后来当被用作半抗原时.荧光素标记的核苷酸可以用一个藕联有酶的荧光素抗体来检验,或用一个由标记有第二抗体F I T C的非藕联抗体来检验,这样的实验敏感性相当于间接法.

此后F I SH被改进后用于研究染色体进化和肿瘤等细胞学研究.1988年,Gi ovannoni等[4]首次将F I SH引入细菌学的研究,使用放射性标记r RNA寡核苷酸探针检测微生物.随着荧光标记的发展,放射性标记被非同位素染料代替.1989年,De Long[5]首次使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞,与放射性探针相比,荧光探针更安全,具有较好的分辨力,不需要额外的检测步骤[19].此外,可用不同激发和散射波长的荧光染料标记探针,在一步反应中同时检测几个靶序列.在DNA纤维(extended DNA fiber)上进行F I SH,已将分辨率水平提高到与常规分子生物学技术Southern B l ot分析相当的水平.近几年,由于F I SH 技术的灵敏性和快捷性使其成为微生物系统发育学、微生物生态学、微生物诊断学和环境微生物学研究的有力工具[6].

该技术主要包括以下几个步骤:①样品的固定;②样品的制备和预处理;③预杂交;④探针和样品变性;⑤用不同的探针杂交以检测不同的靶序列;⑥漂洗去除未结合的探针;⑦检测杂交信号,进行结果分析.

2　r RNA为靶序列的F ISH检测在微生物学研究中F I SH检测最常使用的靶序列是16S r RNA,这是由于16S r RNA具有遗传稳定性,它的结构域具有保守区和可变区[7].对于每个分类水平,根据r RNA目标区域可设计寡核苷酸探针,进行种属特异性鉴定.16S r RNA基因比较测序在进行微生物鉴定时是最简便和准确的,尤其是对混合菌群和未被培养的微生物进行诊断时更为重要[20].在每个处于复制和代谢活跃的细胞中高拷贝的16S r RNA通常为监测单个细菌细胞提供了足够的靶序列,甚至是在F I SH中用单个标记的寡核苷酸.其他的靶序列如23S r RNA[8]、18S r RNA[9,10]和mRNA[11]也被成功的用于F I SH检测.近年来,广泛应用寡核苷酸探针或P NA探针的F I SH技术对特异微生物进行了鉴定和定量分析[12].

3　F I SH诊断环境微生物多样性对于环境微生物的研究主要是依赖于纯培养[11],由于环境微生物中只有一部分能被培养,因此,进行微生物多样性分析时其结果往往是局限的.研究不同的环境微生物时发现显微镜下可见的微生物99%以上通过常规方法不能被培养[26],可见对不同环境样品研究时微生物的总数远远超过被培养的数量[12].微生物生态系统的比较r RNA测序分析比分类研究应用的更广泛,原因是核酸序列可以提供遗传距离、分子杂交探针等信息,可进一步用于鉴定、监测自然生态系统中的微生物[27].PCR(Poly merase chain reacti on)是快速检测微生物生态系统组成的方法,用通用引物(universal p ri m er)扩增环境样品中全部微生物的r DNA,克隆后测序[16].但是这一技术要求进行核酸的提取和扩增等步骤,在试验中也会出现偏差.F I SH技术则不需要进行核酸的提取和扩增,可以再现微环境中完整细胞的景象信息,具有更好的精确性,因此在环境微生物多样性等研究领域被广泛采用[17].

近几年,应用F I SH技术研究自然环境微生物群落的报道较多,如海水沉积物的群落、海水、河水和高山湖雪水的浮游菌体、土壤和根系表面的寄居群落.F I SH技术不仅能提供某一时刻的微生物景象信息,还能监测生境中的微生物群落和种群动态,如海水沉积物连续流培养的微生物群落、原生动物摄食的增加对浮游生物组成的影响、季节变化对高山湖水微生物群落的影响等[18].此外,应用F I SH技术检测和鉴定未被培养的种属或新种属,如巨大硫酸盐细菌(Thio m a rgarita nam ibiensis)[21]、全噬菌属(Holophaga)[22]和酸杆菌属(A cidobacterium)[23]、未被培的芽孢杆菌属细菌(B acillus)[24]和水杆菌属细菌(A quabacteri m)[25]等.F I SH技术对于探明自然菌群的生态学和组成,以及群落对自然和人为因素动态变化的应答研究均是最有力的技术手段.

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