荧光原位杂交在微生物学中的应用及进展
荧光原位杂交技术的临床应用_概述及说明
荧光原位杂交技术的临床应用概述及说明1. 引言1.1 概述荧光原位杂交技术是一种重要的分子生物学方法，可以通过使用荧光探针与待测DNA序列特异性结合，实现对目标DNA的检测和定位。
该技术的广泛应用使其成为基因诊断、细胞生物学以及遗传学研究的关键工具。
本文将对荧光原位杂交技术进行全面概述，并讨论其在临床诊断和生命科学研究中的重要应用。
1.2 文章结构本文将按照以下结构进行介绍和讨论：首先，我们将简要介绍荧光原位杂交技术的基本原理和相关概念；接着，我们将详细阐述该技术在临床诊断中的应用，包括癌症相关染色体异常的检测与定位、遗传疾病的分子诊断与遗传咨询以及微生物检测和感染性疾病的诊断；然后，我们将探讨该技术在生命科学研究领域中的重要应用，包括基因组和染色体结构分析、基因表达调控机制研究以及细胞核内事件及细胞过程动态观察与实时监测；最后，我们将对荧光原位杂交技术进行总结和评价，并展望其未来发展趋势。
1.3 目的本文的目的是全面概述荧光原位杂交技术的临床应用，并介绍该技术在生命科学研究中的重要性。
通过阐述其基本原理和应用案例，旨在增进读者对该技术的了解，并为相关领域的研究人员提供指导和启示。
同时，我们还将对该技术的优势和局限性进行评价，以便读者更好地理解并运用荧光原位杂交技术。
2. 荧光原位杂交技术概述2.1 原位杂交技术简介荧光原位杂交技术是一种用于分析染色体、基因组和RNA等核酸序列的强有力的方法。
它基于亲和性结合原理，利用荧光标记的探针与待测样品中的靶序列进行特异性杂交，通过可见光或荧光显微镜观察探针与样品是否杂交成功，从而实现对目标序列的定位和检测。
2.2 荧光原位杂交技术的基本原理荧光原位杂交技术主要包括以下几个步骤：首先，利用DNA合成或PCR扩增方法得到所需的荧光标记探针；然后，通过氨基化反应将这些探针连接到具有亲和性活性分子（如尾牙肌动蛋白）上，形成完整的荧光标记探针；接下来，在待测样品上进行脱氧核苷酸（dNTP）逆转录DNA合成反应，并在此过程中引入树酰胺（digoxigenin）－标记或生物素－标记dUTP等标记探针；然后，对样品进行固定处理，并与探针进行杂交，使探针与样品中的互补序列结合；最后，利用可见光或荧光显微镜观察并分析杂交信号，实现对目标序列的检测和定位。
荧光原位杂交在肠道微生物学中的应用
荧光原位杂交在肠道微生物学中的应用
荧光原位杂交（FISH）在肠道微生物学中的应用
一、荧光原位杂交概念
荧光原位杂交（FISH），是一种克服转录-聚合酶链反应（PCR）技术的空白，检测和定位特定部位的具体特异性的 DNA 片段的一种受控的基因扩增技术。
它具有快速、准确、实时的特点，使得它可以被用来研究微生物遗传信息以及追踪微生物感染源。
二、荧光原位杂交在肠道微生物学中得用
FISH技术通常用于识别某些特定微生物物种和检测微生物数量，从而更好地了解肠道微生物群落结构、活性和功能。
1、研究肠道微生物群落结构
FISH技术可用于在原位条件下识别和定性细菌和其他微生物，为肠道微生物群落结构的定性和定量研究提供可靠的数据。
例如通过测定不同种类的肠道细菌的相对丰度情况，FISH技术能够分析肠道细菌群落中多种微生物的形态、组成和统计结构。
2、检测微生物感染源
FISH技术能有效检测和排除肠道疾病的病原体，使获得更清晰的诊断结果，从而在确定治疗对策中发挥重要作用。
此外，它也可用于检测微生物的抗药性，以及检测重要病原微生物的致病基因表达情况。
3、用于分析肠道微生物活性
FISH技术还能用于分析肠道微生物的活性，如酶活性和代谢产物的相对��度，和肠道微生物群落复合碳源代谢（Cometabolism）潜力等。
这些信息有助于研究肠道微生物的作用以及促进人类营养和健康。
三、总结
FISH 技术在肠道微生物学中具有重要的应用，可用于研究肠道微生物群落结构和活性，检测微生物感染源以及抗药性，分析肠道微生物的代谢和功能，以及提高其营养和健康的效果。
它将可能为临床诊断提供及时有效的方法。
荧光原位杂交 用途
荧光原位杂交用途荧光原位杂交啊，就像是科学侦探手里超酷的放大镜。
你想啊，细胞里那些小小的基因就像一群调皮的小怪兽，躲在细胞这个大迷宫里。
而荧光原位杂交呢，就像能精准定位小怪兽位置的神奇魔法。
它可以用来检测基因的突变，就好比在一堆长得差不多的小怪兽里，找出那个突然多长了一只角或者少了一条尾巴的特殊家伙。
它还像是基因世界的GPS。
基因们在染色体这个大地图上分布得乱七八糟，有时候就像堵车时乱成一团的汽车。
荧光原位杂交呢，就能精确地告诉你每个基因在染色体上的具体坐标，就像GPS告诉你每个拥堵点的准确位置，让科学家们可以轻松地找到他们想要研究的基因路段。
在疾病研究方面，荧光原位杂交就像是一个超级医生的透视眼。
癌细胞里面的基因乱得像被龙卷风席卷过的房间，而荧光原位杂交可以透过癌细胞这个混乱的表象，看到基因到底哪里出了问题。
就像透视眼能看到墙后面藏着的小老鼠一样，它能发现那些隐藏在基因深处的致病突变，然后科学家们就可以像超级英雄一样，针对这些问题制定消灭癌细胞的计划。
对于遗传疾病的诊断，荧光原位杂交就像是家族基因树上的啄木鸟。
如果家族基因树里有一些坏的“虫子”，也就是有缺陷的基因，它能迅速地把这些虫子找出来。
比如说某些遗传疾病是因为基因上多了一块或者少了一块，荧光原位杂交就像啄木鸟啄树干一样，精准地把有问题的地方啄出来，然后告诉医生，这家人的基因树上有麻烦啦。
在物种进化的研究中，荧光原位杂交像是时光穿梭机的导航仪。
不同物种的基因就像散落在不同时空里的宝藏，荧光原位杂交能帮助科学家找到这些宝藏在基因层面的相似和不同之处。
就好像导航仪能引导时光穿梭机准确地到达不同的时代去寻找宝藏的线索，让我们明白物种是怎么从一个小不点慢慢进化成现在千奇百怪的模样的。
它还像是基因版的“连连看”。
染色体上的基因片段有时候就像一堆杂乱无章的拼图块，荧光原位杂交能根据它们的特征，像玩连连看一样把相似的基因片段或者相关的基因区域给连接起来。
微生物荧光原位杂交实验技术
微生物荧光原位杂交实验技术背景微生物荧光原位杂交实验技术是在原位杂交技术的基础上发展而来的。
原位杂交技术最早应用于染色体分析，后来逐渐应用于微生物检测领域。
随着荧光标记技术的不断发展，人们开始利用荧光标记探针进行原位杂交，从而提高了检测的灵敏度和特异性。
原理微生物荧光原位杂交实验技术的原理是利用特定的荧光标记探针与细胞中的微生物进行杂交，从而将微生物定性和定量地检测出来。
该技术的基本原理是碱基互补配对原则，即探针的序列与待测微生物的序列互补，从而形成稳定的杂交双链。
利用荧光检测仪器检测荧光信号，从而实现对微生物的定量和定位分析。
实验方法样品的制备：将待测样品进行处理，使微生物细胞分离并保持活性。
探针的制备：将特定的DNA或RNA片段进行标记，形成荧光探针。
杂交反应：将样品和探针在一定条件下进行杂交反应，形成杂交双链。
洗涤和干燥：去除未结合的探针和杂质，保持杂交信号的特异性。
荧光检测：利用荧光检测仪器检测样品的荧光信号，并对数据进行处理和分析。
实验结果通过微生物荧光原位杂交实验技术，我们可以得到样品的定性和定量数据。
实验的成功率较高，特异性较强，能够清晰地检测出目标微生物的存在和数量。
该技术的灵敏度较高，可以检测出低拷贝数的微生物基因，为研究提供了有力的工具。
实验讨论微生物荧光原位杂交实验技术具有许多优势，如高特异性、高灵敏度和能够保持细胞结构的完整性等。
然而，该技术也存在一些不足之处，如探针制备过程较为繁琐、杂交反应条件要求较高以及荧光检测仪器价格昂贵等。
荧光探针的稳定性也可能影响实验结果的可靠性。
因此，在应用该技术时需要注意这些因素，并选择合适的探针和实验条件，以保证实验结果的准确性和可靠性。
结论微生物荧光原位杂交实验技术在研究领域具有广泛的应用前景。
除了在微生物检测方面的应用，该技术还可以应用于其他领域，如基因表达分析、细胞凋亡研究等。
虽然该技术存在一些不足之处，但随着技术的不断发展和优化，相信未来会有更多的应用前景等待着我们去探索和发现。
荧光原位杂交技术的应用
荧光原位杂交技术的应用嘿，朋友！想象一下这样一个场景，在一个明亮而充满科技感的实验室里，一群身着白色实验服的科学家们正忙碌地操作着各种仪器，他们的眼神专注而坚定，而在这其中，有一种神奇的技术正在大放异彩，那就是荧光原位杂交技术。
这荧光原位杂交技术啊，就像是一位超级侦探，能够在微观世界里探寻那些隐藏的秘密。
你是不是很好奇，它到底能做些什么呢？先来说说在医学领域吧。
假如有一个病人，身体出现了一些奇怪的症状，医生怀疑是某种特定的基因出了问题。
这时候，荧光原位杂交技术就派上用场啦！它能够精准地检测出那些异常的基因，就像在茫茫人海中一下子就找到了那个“罪魁祸首”。
你说神奇不神奇？比如说癌症的诊断。
癌症细胞常常会有一些基因的改变，而传统的检测方法可能就像在黑暗中摸索，不太容易找准方向。
但荧光原位杂交技术就不一样啦，它能把那些有问题的基因标记得清清楚楚，明明白白。
这就好比是给医生点亮了一盏明灯，让他们能够更准确地制定治疗方案，提高治疗的效果。
再想想农业领域，荧光原位杂交技术也是个大功臣呢！科学家们想要培育出更优良的农作物品种，就得先了解农作物基因的情况。
这技术就像是一个精细的筛选器，能够帮助科学家们快速找到那些具有优良性状的基因，然后通过各种手段进行培育和改良。
这不就像是为农业生产安装了一个强大的引擎，推动着农业不断向前发展吗？还有在生物学研究中，它更是不可或缺的好帮手。
研究人员想要了解生物的进化历程，探索基因的变化规律，荧光原位杂交技术就能提供关键的线索。
它就像是一本打开的基因密码书，让研究人员能够读懂其中的奥秘。
你可能会问，这技术这么厉害，操作起来是不是特别复杂？其实啊，就像学习骑自行车一样，刚开始觉得难，但一旦掌握了窍门，也就变得容易起来。
当然啦，这需要科学家们经过长时间的学习和实践，才能熟练运用。
说了这么多，你是不是对荧光原位杂交技术有了更深刻的认识呢？它在医学、农业、生物学等众多领域都发挥着重要的作用，就像一颗璀璨的明星，照亮了我们探索未知的道路。
荧光原位杂交技术及其在微生物生态学中的应用_呼庆
第24卷第5期2004年5月生 态 学 报AC TA ECOLOGICA SIN ICAV o l.24,N o.5M ay ,2004荧光原位杂交技术及其在微生物生态学中的应用呼 庆,齐鸿雁*,张洪勋(中国科学院生态环境研究中心环境生物技术研究室,北京 100085)基金项目:国家“十五”科技攻关重点资助项目(2001BA903B)收稿日期:2003-10-21;修订日期:2004-01-10作者简介:呼庆(1977～),男,内蒙古呼和浩特市人,博士生,主要从事环境微生物分子生态学研究.*通讯作者Author fo r co rrespond ence 。
E-mail :qih y @Foundation item :th e National “Ten th F iv e-year Plan ”Key Techn ologies R &D Prog rame(No.2001BA903B)Received date :2003-10-21;Accepted date :2004-01-10Biography :HU Qing,Ph.D.candidate,mainly engaged in molecular ecology of environmental microorganism.摘要:综述了荧光原位杂交技术(fluor escence in situ h ybridization FIS H)在微生物生态学领域的各种应用,同时就其发展过程、原理及种类做了介绍。
关键词:荧光原位杂交;微生物生态;16Sr RN A;探针Fluorescence in situ hybridization (FISH )and its applications in microbial ecologyHU Qing ,QI Hong -Yan *,ZHAN G Hong -Xun (Environmental Biotechnolog y Lab .,Res earch Center for Ec o -envir onmentalSciences ,Ch ines e Acad emy of Sciences ,B eijin g 100085,Ch ina ).Acta Ecolog ica Sinica ,2004,24(5):1048～1054.Abstract :During r ecent y ears,molecular tech niques such as PC R and denaturing g radient g el electro pho r esis (D GG E)o r DN A sequencing hav e rev olutio nized all fields of micr obio lo gy ,a nd sensitiv e detectio n and ex act identifica tio n o f bacteria a re po ssible.Fluo rescence in situ hy bridization (F ISH)using 16Sr RN A pro bes do es no t rely o n PCR amplificatio n,a nd as such prov ides a useful complementa ry tech nique to DG GE for the ana ly sis of o rg anisms.Because of FI SH allo wing nucleic acid sequences to be exa mined inside cells witho ut a ltering the cell 's mo rpho lo g y o r the integ rity o f its v arious compar tments and pr oviding info r matio n abo ut number,spatial distributio n and cellular env ironment,it has beco me a po w erful too l fo r phylog enetic,eco lo gic,diag no stic and enviro nmenta l studies in micr obio lo gy.Fluo rescence in situ hy bridization ca n detect nucleic acid sequences by a fluor escently labeled pr obe that hybridizes specifically to its complementa ry ta rge t sequence within the intact cell .Its g ener al procedure in FISH a na ly sis ofmicr oo rg anisms is as follow s :(1)fix ation of the specimen ;(2)pr epa ration of th e sam ple ,possibly including specificpret reatment steps ;(3)hy bridization w ith the respectiv e pro bes fo r detecting the respectiv e tar ge t sequences ;(4)w ashing steps to r emov e unbound pr obes ;(5)mounting ,v isualization and documentatio n of r esults .Because F ISH g iv es a detailed picture of the micro envir oments without any selectiv e purificatio n o r amplificatio n steps ,ther e is a la rg e sco pe o f FISH applica tio ns .It ha s bee n ex tensiv ely used in the field of envir onmental micr oo rg anisms div e rsity such a s the inv estiga tio n o f micro bia l communities o f aqua tic ha bitats and soil ha bitats.M o st o bliga te mic ro bia l symbio nts a re as-y et uncultur ed.U sing the 16Sr RN A approa ch ,they can be identified and ph ylog ene tica lly ing different FI SH stra teg ies,bacte rial endo symbio nts w er e detected in many micro or ganisms.Po pulation analysis by F ISH has prov en par ticula rly useful fo r descriptio n o f the no rma l flo ra o r that o f mixed micro bia l infectio ns.This has been sho wn fo r medicine resea rch such as ora l cavity ,g astro -intestina l flo ra,respira tor y t ract infectio ns.It sh ould be pointed o ut that FISH is no t f ree o f bia ses a s with o ther mo lecula r methods.T he mo st st riking pr oblem is auto fluo rescence of micro org anisms themselv es.In additio n,accur acy and reliability of FIS H is highly dependent o n the specificity of the o lig o nucleo tide pro be.that FI SH as a pow er ful to ol will make mo r e co ntributionscommunities.Key words:fluo rescence in situ hy bridization;micro bial eco lo gy;16Sr RN A;pro be文章编号:1000-0933(2004)05-1048-07 中图分类号:Q93-3,Q938 文献标识码:A微生物是地球生物圈的重要组成部分。
荧光原位杂交在肠道微生物学中的应用
荧光原位杂交在肠道微生物学中的应用吴旭;吴中明【摘要】FISH技术作为一种非侵入性检测方法,在对微生物进行检测时无需分离培养,也无需提取DNA或RNA,而是以微生物基因组的核酸序列为基础,利用荧光标记的寡核苷酸探针进行原位杂交来鉴定微生物的一种技术,是分子生物学中最常使用的技术之一,为微生物研究提供了新的检测手段,不但可鉴定微生物,还可提供微生物的空间分布信息.本综述讨论FISH在肠道微生物学中的检测意义.【期刊名称】《国际消化病杂志》【年(卷),期】2012(032)002【总页数】4页(P74-76,103)【关键词】荧光原位杂交;肠道微生物学;应用【作者】吴旭;吴中明【作者单位】563002,遵义市第一人民医院消化内科;遵义医学院基础医学院微生物学【正文语种】中文FISH技术是上世纪八十年代在放射性原位杂交基础上发展起来的非放射性原位杂交技术。
基本原理是根据目标微生物16SrRNA基因序列的相对保守区域设计寡聚核苷酸探针，利用荧光素进行标记，与靶细菌杂交，通过检测目标序列来确定微生物的种类、数量及空间分布。
具有敏感、快速、安全，同时能显示多种颜色便于区别等优点。
1988年，Giovannoni等[1]首次将FISH技术引入细菌学的研究。
1989年，Delong等[2]首次使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞。
经过不断的丰富和完善，现FISH技术结合共聚焦显微镜、流式细胞学已成为近年医学、生态学、遗传学、环境微生物学检测中一种重要的、应用广泛的研究工具[3]。
1 FISH对肠道正常菌群的研究正常菌群在人体分布很广，其中肠道是微生物在人体最大的定居和活动场所。
对健康人大便标本的研究显示正常菌群在人体分布很广，其中肠道是微生物在人体最大的定居和活动场所。
对健康人大便标本的研究已知肠道内栖息着大约1014个细菌，是人体细胞总数的10～20倍，其中90.0%～99.9%是厌氧菌。
研究显示人肠道微生物多样性的框架系统有1000多种 [4]，75%来自人结肠的16SrRNA序列定义的细菌种系是不能够用现有方法培养出来的[5]，这使人们对肠道微生物菌群的结构与特性有了全新的认识和更完整的评价，对研究肠道内菌群的功能以及它们与机体的相互关系非常重要。
原位荧光技术在生物研究中的应用
原位荧光技术在生物研究中的应用随着生物学研究进一步深入，我们对于生物体内各个环节的认识也越来越深入。
而在这些研究中，分子标记技术起到了举足轻重的作用。
原位荧光技术就是其中一个重要的技术手段，正因为这项技术的强大，它已成为生物学研究中不可少的手段之一。
原位荧光技术的基本原理是，将专门设计的荧光探针注入到观察样本中，通过激发电子的方式，使得分子产生荧光信号，然后借助荧光显微镜等设备，进一步观测和分析。
这种技术的优点在于，可以对体内分子进行高灵敏度和高分辨率的成像，对于生命体系的研究带来了非常大的便利。
那么，它究竟在哪些生物研究领域中应用最广呢？一、原位荧光技术在蛋白质研究中的应用对于对蛋白质酶进行研究，原位荧光技术在其中发挥着非常重要的作用。
由于荧光探针的高敏感度和低毒性，可以帮助科研人员通过激发荧光的方式，更好的记录蛋白酶在各个化学环节下的活性变化。
通过这样的方法，科研人员得以追踪蛋白质的空间位置和时间状态，从而更好的理解酶在生物内部的活动和功能。
同时，这项技术还可以对激发能量的位置进行精确定位，从而更好的了解蛋白质活性的来源及其分布情况。
二、原位荧光技术在细胞分析中的应用原位荧光技术在药物研究和临床治疗中，也发挥着重要的作用。
由于这项技术可以精准的记录细胞的状态变化，因此我们可以通过荧光探针的作用，在细胞内部监测药物的分布情况和药物的作用效果，从而进一步分析其疗效。
同时，还可以通过这项技术分析细胞内的解剖结构和生理学变化，更好的探究细胞和分子如何相互作用和影响其他细胞。
这项技术的应用对于癌症、心血管和神经精简等领域的研究尤为重要。
三、原位荧光技术在植物研究中的应用对于植物生长研究，原位荧光技术也可以发挥非常重要的作用。
由于植物界非常复杂，不利于人类通过传统的方法探究其生长和发育机制，因。
在这样的情况下，研究人员可以通过荧光探针的作用，更好的理解植物在内部各个层面的变化，如生长时的形态、光合作用、植物中的代谢物等等。
荧光原位杂交技术(FISH)及其在环境微生物学中的应用
收 稿 日期 ：２ ０ — ０ ０ ； 回 日期 ： ０ ０ １ — ８ ００１—９ 悔 ２０ —２０
未 污 染的 河 口 水 体 湾
活性 污泥 沉积 物 土壤
按 ＣＦ 测 定的百 分 比 Ｕ
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基金项 目：国家走出青年科学基叠， （９ ２ ０ ７ 豇日 ３ ９ ５ ０ ）和
０ Ｉ Ｈ ｉ ｈ ｎ ｉｏ ｍｅ ｔ １ ｉｒ ｂ ｏＯ Ｔ ｒ ｔｏ ｕ ｅ ｆＦ Ｓ ｎ ｔ ｅ ｅ ｖ ｒ ｎ ｎ ａ ｅ ｏ ｉｌ ｇｆ＆ ｅ ｉ ｒ ｄ ｃ ｄ ｍ ｎ
Ｋｅ ｒ ｓ ｆ ｏｅｃｎ ｔ ｙ ｒ ｉ ｔ ｎ（ＩＨ）ｄｔｃ；ｎｉ ｎ ｎａ ｍｉ ｏ ｉｏｙ ｙｗｏ ｄ ： ｕｒｓｅｔｎｓｕｈｈｉ ｚ ｉ ＦＳ ； ｅｅｔｅｖｒ ｍｅｔｌ ｃ ｂｏ ｇ ｌ ｉ ｉ ｄａｏ ｏ ｒ ｌ 微生物 对整 个 生态系统具 有重要 的影 响 微 生 物链 中的初 级生产者 ，同时在 自然界 的元 素转 化 中 微生物 也是 一个 不可缺 少 的成 员 ，因此 ，了解和 检 测微 生物 的种类 和作 用具有十分 重要 的意 义 检测 微生物 的常规 方法是培 养法，不同类 群的微生物 需 要 特殊 的培养基 这 种方法不 但费 时费力 ，而且 绝 大多数 细菌不 能或很难 培养 。据 统计通 常环境 中可
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研 究与 应 用 ．
荧光原位杂交技术在环境微生物生态学解析中的应用研究_孙寓姣
荧光原位杂交技术在环境微生物生态学解析中的应用研究孙寓姣1,2 王 勇1 黄 霞1(1.清华大学环境科学与工程系,环境模拟与污染控制国家重点联合实验室,北京100084;2.哈尔滨工业大学环境生物技术研究中心,哈尔滨150090)摘 要 近年来,诸多国家在环境微生物领域先后开展了分子生物学研究方法的建立和生物学评价工作。
一些不依靠纯培养的微生物群落的分析方法已得到广泛应用和发展。
荧光原位杂交(FISH )技术,具有细胞在测定过程中不被破坏、形状不改变、特异性强、能够真实反映在自然环境下微生物的情况及分布等特点,在环境微生物群落探测分析中已逐渐被广泛应用。
该技术利用带有荧光标记的特异性寡核苷酸探针,与细胞内相应的靶核糖体结合,能将微生物探测、鉴定到属和种的水平。
运用于硝化细菌、除磷细菌和丝状微生物等废水处理中常见的特征性微生物种群和群落生态学研究中,颇为高效。
该技术的应用避免了传统培养方法进行鉴定和计数的局限性,在环境微生物生态学解析中具有较高应用价值。
关键词 分子生物学 荧光原位杂交 寡核苷酸探针 环境微生物 微生物生态学Application of fluorescence in situ hybridization inanalysis of environmental microbial ecologySun Yujiao 1,2 Wang Yong 1 Huang Xia 1(1.Environmental S imul ation and Poll u tion Control S tate Key Joint Laboratory ,Department ofEnvironmen tal Science and Engineering ,Tsinghua Univers ity ,Beijing 100084;2.Environmental Biotechnol ogy Research Office ,Harbin Industry University ,Harbin 150090)A bstract Recently ,molecular biology methods are established and biology evaluation are carried out inenvironmental microbiology field in many countries .Some methods to analy se microbiological community w ithout traditional culture -based methods are used ex tensively .Fluorescence in situ hybridization (FISH )technology can exactly reflect the natural colo nial morphology of culturable and unculturable org anisms .In FISH method ,especial probes are used to hybridize w ith targeted rRNA in cells ,and the exact identification of bacteria can be attained to genus and species level .Nitrifying bacterium probes ,phosphate -removing bac -terium probes ,and filamentous bacterium probes are often used in microbiology morphology ,count ,spatial distribution studies .FISH technology avoids the localization of bacterial traditional culture -based methods ,and has a g reat potential in environmental microbial ecology analy sis .Key words molecular biology ;fluorescent in situ hybridization (FISH );oligonucleotide probes ;envi -ronmental microorganism ;microbial ecology 资助项目:国家“863”高技术研究发展计划项目(2002AA601220)收稿日期:2003-08-22;修订日期:2003-10-09作者简介:孙寓姣(1975～),女,博士研究生,主要从事环境微生态学研究。
荧光原位杂交技术在微生物群落结构研究中的应用
术 在 应 用 中存 在 的 问题 ， 对 其 应 用 前 景 进 行 了展 望 。 并 关键 词 荧 光 原 位 杂 交 １ Ｓｒ Ｎ ６ Ｒ Ａ 寡 核 苷 酸 探 针 微 生 物 群 落 结 构
维普资讯
净
水
技 术
Ｖｏ． ５ ． ０６ １２ Ｎｏ １ ０ ２
ＷＡ ＲＰ ＴＥ ＵＲＩ Ｉ ＴＩ Ｃ Ｆ ＣＡ ＯＮ ＴＥ ＨＮＯＬ ＯＧＹ
荧光原位杂交技术在微 生物群落结构研究 中的应用
李华芝 李 秀艳 徐 亚 同
（ 东师 范大 学资 源 与环境 学 院环境 科 学 与技 术 系 上 海 ，０ ０ ２ 华 ２０６ ）
分 析 以及多 种 细胞遗 传 学研 究方 面得 到应用 。１ ８ ９８
ａ ｎ ｔ ｎ ｏ ａ ｔ ｐ ｅ ｅ ｔａ ｄ ｆ ｔ ｒ ｐ ｌ ａ ｉｎ ， ｎ ｅ ｓ ｅ ｔ ｅ ｅ ｅ ｅ ｐ ｃｅ ｂ ｕ ｈ ｓｔ ｃ ｎ ｌｇ ． ｍｉ ａｉ ｆｐ ｓ ， ｒ ｓ ｎ ｎ ｕ ｕ ｅ ａ ｐ ｉ ｔ ｓ ａ ｄ ｐ ｒｐ ｃ ｉ ｓ ｗ ｒ ｘ ｅ ｔ ｄ ａ ｏ ｔ ｉ ｈ ｏｏ ｙ ｏ ｃ ｏ ｖ ｔ ｅ Ｋｅ ｗｏ ｄ Ｆ Ｓ ｙ ｒｓ Ｉ Ｈ １ Ｓ ｒ ＮＡ ｏｉ ｏ ｕ ｌ ｏ ｉｅ ｐ ｏ ｅ ｍｉｒ ｂ ａ ｏ Ｒ ６ ｌ ｎ ｃｅ ｔ ｒ ｂ ｇ ｄ ｃ ｏ ｉ ｃ ｍｍｕ ｉ ｔｕ ｔ ｒ ｌ ｎ ｔ ｓｒ ｃ ｕ ｅ ｙ
对 于一些 培养条 件要 求较苛 刻 或未被 培养 的细 菌往
境 中监 测和 鉴定 不 同 的微生 物个 体 ．同时对微 生物 群 落进 行评 价 。 目前 ，ＩＨ 技 术广泛 应 用 于微生 物 ＦＳ
荧光原位杂交技术(fish)的基本原理和应用_理论说明
荧光原位杂交技术(fish)的基本原理和应用理论说明1. 引言1.1 概述荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ Hybridization，简称FISH）是一种广泛应用于生物学研究的重要技术。
它通过在细胞或组织水平上定位和检测特定DNA或RNA序列的分布情况，可以提供关于基因组结构、功能和表达的有价值信息。
该技术最早于20世纪80年代被开发出来，并且经过不断改进与扩展，如今已成为分子生物学研究中不可或缺的工具之一。
1.2 文章结构本文将首先介绍荧光原位杂交技术的基本原理，包括DNA探针的选择与设计、杂交反应条件的优化以及检测与可视化方法。
然后，我们将深入探讨荧光原位杂交技术在生物医学研究领域、植物遗传研究领域和动物进化研究领域的应用实例。
接下来，我们将评述荧光原位杂交技术的优势与局限性，包括其高灵敏度、高分辨率等优势以及对样本处理要求高、无法确定基因功能等局限性。
最后，我们将给出结论并展望荧光原位杂交技术的未来发展方向。
1.3 目的本文的目的是系统地介绍荧光原位杂交技术的基本原理和应用领域，以帮助读者深入了解这一重要技术。
通过阅读本文，读者将能够全面了解荧光原位杂交技术在生物学研究中的作用和意义，并对该技术的优势与局限性有所了解。
此外，本文也将探讨该技术未来可能的发展方向，为读者提供展望与思考。
2. 荧光原位杂交技术基本原理:2.1 DNA探针的选择与设计:荧光原位杂交技术（FISH）是一种利用DNA或RNA分子作为探针，通过特异性互补配对识别和定位目标序列的方法。
在进行FISH实验时，首先需要选择合适的DNA探针。
DNA探针通常由由人工合成的寡聚核苷酸（oligonucleotide）或从天然来源提取得到的全长DNA片段构建而成。
选择DNA探针时，需要考虑以下因素：首先是目标序列的特异性，即该序列在待检测样品中是否具有较高的丰度，并且只存在于感兴趣的目标区域中。
其次是探针长度和两个主要互补区域之间核苷酸序列的碱基组成比例。
荧光原位杂交临床应用
荧光原位杂交临床应用荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种在细胞或组织的水平上探测特定DNA序列的技术。
它通过将荧光标记的探针与目标DNA序列特异性结合，然后通过显微镜观察荧光信号的分布情况来研究细胞或组织中的基因组结构和功能。
荧光原位杂交技术在临床应用中具有广泛的应用价值，可以用于遗传疾病的诊断、肿瘤的分子分型和预后评估等方面。
荧光原位杂交技术的临床应用主要体现在以下几个方面：1. 遗传疾病的诊断：荧光原位杂交技术可以用于检测染色体异常，帮助医生进行遗传疾病的诊断和预后评估。
例如，通过针对染色体上特定基因的FISH分析，可以鉴定出染色体异常引起的唐氏综合征、爱德华氏综合征等遗传疾病。
2. 肿瘤的分子分型：荧光原位杂交技术可以通过检测肿瘤细胞中染色体的异常改变，帮助医生对肿瘤进行分子分型，指导治疗方案的选择。
例如，FISH技术可以用于检测HER2基因在乳腺癌中的扩增情况，从而判断乳腺癌患者对靶向治疗药物的敏感性。
3. 肿瘤的预后评估：荧光原位杂交技术可以通过检测肿瘤细胞中染色体的异常改变，预测肿瘤的预后情况。
例如，FISH技术可以用于检测白血病细胞中BCR-ABL融合基因的存在，从而判断患者对靶向治疗药物的疗效和预后。
4. 检测微小缺失和重复：荧光原位杂交技术可以通过检测染色体上微小缺失或重复的情况，帮助医生进行染色体疾病的诊断和预后评估。
例如，FISH技术可以用于检测儿童发育迟缓症患者的染色体微缺失情况，从而帮助医生进行个体化治疗。
荧光原位杂交技术作为一种高灵敏度、高特异性的分子生物学技术，在临床应用中具有广泛的应用前景。
它可以帮助医生进行遗传疾病的诊断、肿瘤的分子分型和预后评估等方面，为患者的个体化治疗提供重要的依据。
随着技术的不断进步和发展，相信荧光原位杂交技术在临床应用中的作用会越来越重要，为人类健康事业做出更大的贡献。
荧光原位杂交技术及其应用
荧光原位杂交技术及其应用生物学研究中，了解基因表达情况是至关重要的。
荧光原位杂交技术（FISH）是一种常用的细胞学技术，能够直接观察到特定DNA序列的位置和数量，从而研究基因组结构、功能和进化。
本文将介绍FISH技术的原理、方法和应用，并探讨该技术在生物学领域中的前景。
一、FISH技术原理FISH技术是一种基于亲和原理的细胞学技术，它利用荧光标记探针与特定DNA序列的互补配对，使其在细胞核中特异性结合。
探针可以是DNA分子或RNA分子，它们被标记上荧光染料，通过显微镜观察荧光信号来确定探针的结合位置和数量。
FISH技术的主要步骤包括：样品制备、探针标记、探针杂交、洗涤和显微镜观察。
样品制备包括细胞培养、细胞固定和染色。
探针标记可以通过直接或间接标记方法实现。
直接标记方法是将荧光染料直接连接到DNA或RNA分子上，而间接标记方法是通过荧光标记的抗体来识别已标记的DNA或RNA分子。
探针杂交是将标记的探针与细胞核DNA或RNA进行互补配对，通常需要在高温下进行。
洗涤步骤可以去除未结合的探针，从而提高探针的特异性。
显微镜观察则是通过荧光显微镜观察荧光信号，确定探针的结合位置和数量。
二、FISH技术应用FISH技术在生物学研究中有广泛的应用，以下是几个常见的应用领域：1. 基因组结构研究FISH技术可以用于研究基因组的结构和变异。
例如，可以使用不同的探针标记染色体的不同区域，从而确定染色体的结构和数量。
此外，FISH技术还可以用于检测基因组的缺失、重复和重排等变异。
2. 基因表达研究FISH技术可以用于研究基因表达。
例如，可以使用探针标记mRNA 分子，从而确定mRNA在细胞中的分布和数量。
此外，FISH技术还可以用于研究基因转录和剪接等过程。
3. 染色体分析FISH技术可以用于染色体分析。
例如，可以使用探针标记人类性染色体的不同区域，从而确定性染色体的性别和结构。
此外，FISH 技术还可以用于研究染色体异常，如染色体重排、易位和缺失等。
荧光原位杂交技术及其应用
本原理及该技术在生物学和医学中的 应用。
关键词 荧光原位杂交 应用
荧光原位杂交（ｕｅｅ ｅ ｉ ｂ ｉｔ ， 区 几 ｌ ｒｃ ｃ ｎ 娜ｄａ ｎ ｆｏｓｎ ａ ｓ ｙ ｚｉ ｔ ｕ ｏ 域 段不同 核酸片 段组成， 克隆 菌体和 可由 到噬 质
Ｆ Ｈ 技术是２世纪８ 年代末在已有放射性原位杂 Ｉ） Ｓ ０ ０ 交技术 基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传 学技术， 具有快速、 灵敏度高以 安全、 及探针可长杂交时与邻近区 域发生重叠及 制片过程中被破坏的可能性较小， 常用于中期染色体 重组和间期核结构分析。第三类是位点特异性探针， 这类探针由 一个或几个克隆序列组成， 可由。Ｎ Ｄ Ａ克 隆 或克隆到大片 段插人载体的 核酸片 段制取。主 要用
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荧光原位杂交技术在生物学研究中的应用
荧光原位杂交技术在生物学研究中的应用在生物学研究中，荧光原位杂交技术是一种常见的分子生物学方法。
通过荧光标记探针，该技术可以在细胞、组织、器官、甚至整个生物体上可视化特定的DNA、RNA序列。
这使得生物学家可以研究细胞内基因表达和基因组组织，这对研究生物学和人类健康问题非常重要。
一、荧光原位杂交技术的概述荧光原位杂交技术利用生物分子之间的互补性进行研究。
DNA和RNA是生命体系中最为重要的分子之一，它们内在的互补性使它们能够识别彼此。
在荧光原位杂交技术中，荧光标记的核酸探针与需要研究的特定序列互补杂交。
这使得荧光探针可以准确地在细胞或组织中可视化。
这种荧光信号可以通过显微镜观察。
二、荧光原位杂交技术的种类荧光原位杂交技术有两种主要的类型:核酸杂交和免疫荧光染色。
1. 核酸杂交核酸杂交是在无细胞和细胞水平上进行的。
在细胞水平上，荧光原位杂交技术通常用于识别和定位细胞中的mRNA分子。
通过将可靠的延伸探针标记附着到mRNA序列上来实现它。
可靠的延伸探针是通过逆转录、克隆和序列分析来获得的，它们是荧光标记的短DNA序列或RNA分子。
在无细胞级别上，荧光原位杂交技术可用于检测细胞和组织中特定的DNA序列。
这是通过采用荧光标记的探针来实现的，这些探针可以杂交到要检测的DNA序列上并显示出荧光标记的颜色。
2. 免疫荧光染色免疫荧光染色是另一种荧光原位杂交技术。
这种方法利用荧光标记抗体来识别和定位特定的蛋白质分子。
准确的荧光探针可以准确地将抗体与依靠特定抗原结构的细胞或组织相结合，显示出特定的荧光标记。
这种方法能够用于检测特定受体、细胞结构或定点蛋白质位置。
三、荧光原位杂交技术的应用本节将介绍荧光原位杂交在生物学研究中的一些应用。
1. 基因表达和调控荧光原位杂交技术是了解该基因在细胞中表达的位置、发展和分化状态所必需的，无论是在发育过程中还是在成人身体中。
例如，基因1在胚胎发育中的表达模式可以通过荧光原位杂交技术来确定，并验证其在造血干细胞、软骨和骨中的表达模式。
荧光原位杂交技术及其在环境微生物学中的应用
于不同荧光分子 的光谱重叠 ．一般只能同时使用 ３种不 同颜
色。为扩大 ＦＳ ＩＨ容量 ， 年来 发展了组合标记 、 近 比例标记 、 多
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自 １８ ９ ８年 Ｇｏａ ｎ ｎ 首 先 利 用 放 射 性 标 记 ｒ Ｎ 寡 核 苷 ｉ ｎｏｉ ｖ ＲＡ 酸 探 针 显 微 探 测 细 菌 以来 ，随 着 安 全 性 较 强 的 荧 光 技 术 的发 展 ．９ ９年 Ｄ Ｌ ｎ 次 应 用 荧 光 标 记 寡 核 苷 酸 探 针 探 测 独 立 １８ ｅ ｏｇ首 的 微 生 物 细 胞 ． 项 技 术 即荧 光 原 位 杂 交 技 术 （ｕ ｒｓｅｔ ｎ 此 ｌ ｅ ｆ ｏ ｃｎ ｉ— ｓｕｈ ｂｉｉ ｔｎ ＦＳ ）通 过 在 环 境 样 品 上 直 接 原 位 杂 交 ， ｉ ｙｒ ｚ ｉ ， ＩＨ ， ｔ ｄ ａｏ 既 可 测 定 不 可 培 养 微 生 物 的 形 态 特 征 及 丰度 ，叉 可原 位 分 析 其 空 间 及 数 量 分 布 ， 于 ｎＳ 具 有 测 定 过 程 不 破 坏 细 胞 及 其 形 由 Ｈ 状 、 异 性 强 、 辨 率 高 、 全 、 速 等 优 点 ， 在 环 境 微 生 物 特 分 安 快 正 领 域 中逐 渐 被 广 泛 应 用 。
荧光原位杂交技术及其在环境微生物生态学中的应用研究
检测方法。但是常规的培养基培养方法通常费时 些方法无法提供微生物形态学 、 空间分布和生物 费力 ， 尤其对于选择性高 、 营养需求复杂或 目 前为 体的细胞环境等信息 ， 并且 Ｐ Ｒ对环境样品分析 Ｃ 止无法培养的微生物种类［ ］无法实现快速的培 存在一 定 的偏 差。荧 光原位 杂交 （ ｌ ｒｓｅｃ １， Ｆｕ ｅｃ ｅ ｏ ｎ 养 和有效 的检 测 。基 于此 ， 年来 国 内外诸 多 学 Ｉ ｉ ｂｉｉ ｔ ｎ ＦＳ 技术 结合 分 子 生 物 近 ｎＳｔ Ｈｙｒ ｚ ｉ ， ＩＨ） ｕ ｄ ａｏ 者先后开展了分子生物学方法的建立及生物学评 学的精确性和显微镜的可视性 ， 可进行微生物的 价工作， 从而更快 、 更精确地揭示微生物的种类和 空间分 布情 况分析 和特征 性微 生物 的鉴定 与定 量 多样性。目前常用 的分子生物学 方法包括基于 分析 。 ９ ９ ， ｅ ｏｇ １ ８ 年 Ｄ Ｌ ｎ 首次将荧光 标记 寡核苷
Ｆｌ ｏ ｅ ｃ ｎｃ ｎ ｓ ｔ ｙ ｒｄｉ ａ ｉ ｎ Ｔｅ ｈ ｌ ｇ ｎ ｕ ｒ ｓ ｅ ｅ ｉ ｉｕ Ｈ ｂ ｉ ｚ ｔｏ ｃ ｎｏ ｏ ｙ ａ ｄ Ｉ ｓＡｐ ｉ ａ ｉ ｎ ｉ ｖ ｒ ｎ ｅ ａ ｉ ｒ ｂ ａ ｏ ｏ ｙ ｔ ｐｌｃ ｔｏ ｎ Ｅｎ ｉ ｏ ｍ ｎｔ ｌＭ ｃ ｏ ｉ ｌＥｃ ｌ ｇ
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微 生物 学杂 志 ２０ 年 １ ０７ 月第 ２ 卷第 １ Ｊ Ｕ Ｎ ＬＯ ７ 期 Ｏ Ｒ Ａ ＦＭＩＲ ＢＯ Ｏ ＹＪｒ ２０ ｏ ２ ｏ１ Ｃ Ｏ ＩＬ Ｇ Ｌ ０ ７ １ ７ ． ａ Ｖ． Ｎ
荧 光原 位 杂 交 技 术 及 其在 环 境 微 生物 生态 学 中 的应 用研 究
宋琳玲 ，曾光 明 ， 陈耀 宁，蒋 茹， 国和 黄
原位杂交技术的原理及应用
原位杂交技术的原理及应用1. 原位杂交技术的概述原位杂交技术是一种用于研究基因组结构和功能的重要工具。
它基于两个主要原理：互补配对和探针标记。
通过互补配对，可以使DNA探针与目标DNA的特定序列发生结合。
探针通常被标记为荧光染料或放射性同位素，以便检测和定位。
2. 原位杂交技术的工作原理原位杂交技术的工作原理可以分为以下几个步骤：2.1 产生探针首先，需要产生特定序列的DNA探针。
这可以通过PCR扩增、限制性内切酶消化和合成等方法来实现。
探针的选择应根据研究需求和目标DNA的序列来确定。
2.2 标记探针为了使探针可视化和定位，需要对其进行标记。
常用的标记方法包括荧光标记和放射性同位素标记。
荧光标记通过使用特定的荧光染料，使探针在显微镜下可见。
放射性同位素标记则通过使用放射性同位素来标记探针，然后通过放射性计数器来检测和定位。
2.3 杂交反应将探针与目标DNA进行杂交，使它们发生互补配对。
杂交条件的选择取决于目标DNA的性质和探针的序列。
通常，在一定温度和盐浓度下，探针与目标DNA可以形成稳定的双链结构。
2.4 洗涤和检测完成杂交后，需要将非特异性的探针从样品中洗涤掉，以减少干扰和背景信号。
然后，使用显微镜观察或放射性计数器检测探针的信号。
荧光标记的探针可以通过荧光显微镜观察到特定位置的信号强度和分布情况，而放射性同位素标记的探针可以通过放射性计数器测量到辐射信号的强度。
3. 原位杂交技术的应用原位杂交技术在生物学研究中有广泛的应用，主要包括以下几个方面：3.1 基因定位和染色体映射原位杂交技术可以用于确定基因在染色体上的位置并进行染色体映射。
通过将特定序列的探针与目标DNA进行杂交，可以确定基因在染色体上的位置和分布。
这对于基因组研究、疾病基因的定位以及基因组结构和功能的理解都具有重要意义。
3.2 突变检测和基因表达分析原位杂交技术可以用于检测基因突变并分析基因的表达模式。
通过使用特定的突变探针或转录探针，可以检测到特定基因的突变或表达模式。
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第22卷哈尔滨师范大学自然科学学报Vol .22,No .52006第5期NAT URAL SC I E NCES JOURNAL OF HARB I N NOR MAL UN I V ERSI TY荧光原位杂交在微生物学中的应用及进展3王继华 杨茹冰 李 晶(哈尔滨师范大学)【摘要】 荧光原位杂交技术广泛用于分析复杂环境的微生物群落构成,可以在自然生境中监测和鉴定微生物,并能对未被培养的微生物进行检测.r RNA 为靶序列寡核苷酸或P NA 探针的荧光原位杂交能提供微生物的形态学、数量、空间分布等信息,现已成为环境科学研究领域中的热点技术.本文对荧光原位杂交技术的发展和在环境微生物学中的应用进行了综述,探讨了该技术应用和发展前景.关键词:荧光原位杂交;16S r RNA;寡核苷酸探针;P NA;环境微生物;微生物生态学收稿日期:2006-04-113黑龙江省教育厅科技研究资助项目,(10541090),哈尔滨师范大学大学生科技创新基金资助项目,(2005-04)0 引言目前,在环境综合治理如废水、废气和固体废弃物的净化和处理中广泛应用生物学方法,因此只有充分了解微生物生态学和群落演替规律等,才能提高环境科学研究中的生物学效能,推动和深化环境整治工作,合理利用环境资源.传统菌种分离培养的鉴定方法不仅耗时费力,而且不能精确的反映混合菌群的组成和多样性,对于一些培养条件要求较苛刻或未被培养的细菌往往不能达到预期效果[1].近几年,随着分子生物学技术如分子杂交、PCR 、核酸测序等的发展,微生物学研究领域发生了深刻的变革,灵敏的检测和精确的细菌鉴定成为可能.借助分子生物学方法进行特异微生物的快速检测和鉴定已成为现代微生物诊断和生态学研究的重要手段.荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridizati on,F I SH )结合了分子生物学的精确性和显微镜的可视性信息,可以在自然或人工的微生境中监测和鉴定不同的微生物个体,同时对微生物群落进行评价.F I SH 被广泛应用于揭示微生物的原位生理学特性和功能,现已成为微生物分子生态学研究的重要技术手段.1 F I SH 的发展和技术原理1969年,Pardue 等[2]和John [3]两个研究小组发明了原位杂交技术(in situ hybridizati on,F I SH ),放射性标记的DNA 或28s RNA 被杂交到细胞制备物上,通过放射自显影技术(m icr oaut oradi ography,MAR )检测杂交位点,这一技术可以在保持细胞形态完整性的条件下,使核酸序列在细胞内被检测.其原理是:F I SH 技术检测核酸序列通过荧光标记的探针在细胞内与特异的互补核酸序列杂交,通过激发杂交探针的荧光来检测信号.荧光染料受一定波长(激发波长)的光激发后会发射荧光(发射波长),所以用滤光镜选择合适的激发波长的光,即可显示某一特定的荧光染料.常用的荧光染料的DAP I (在UV 光激发下发出蓝色荧光),F I TC和荧光素(蓝光下发出绿色荧光)以及罗丹明和德克萨斯红(绿光激发下产生红色荧光),由于F I SH的信号空间分辨率高,不同的DNA探针可以用不同的半抗原标记,再用不同的荧光染料进行同时检测(复色F I A H,Multicol or F I SH,Mc-F I SH)[7].荧光素标记的核苷酸类似物可以被用于直接和间接的原位杂交实验.最初用直接法标记杂交后检测步骤简化,背景清晰.然而其通常弊病是比间接法敏感性低.但后来当被用作半抗原时.荧光素标记的核苷酸可以用一个藕联有酶的荧光素抗体来检验,或用一个由标记有第二抗体F I T C的非藕联抗体来检验,这样的实验敏感性相当于间接法.此后F I SH被改进后用于研究染色体进化和肿瘤等细胞学研究.1988年,Gi ovannoni等[4]首次将F I SH引入细菌学的研究,使用放射性标记r RNA寡核苷酸探针检测微生物.随着荧光标记的发展,放射性标记被非同位素染料代替.1989年,De Long[5]首次使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞,与放射性探针相比,荧光探针更安全,具有较好的分辨力,不需要额外的检测步骤[19].此外,可用不同激发和散射波长的荧光染料标记探针,在一步反应中同时检测几个靶序列.在DNA纤维(extended DNA fiber)上进行F I SH,已将分辨率水平提高到与常规分子生物学技术Southern B l ot分析相当的水平.近几年,由于F I SH 技术的灵敏性和快捷性使其成为微生物系统发育学、微生物生态学、微生物诊断学和环境微生物学研究的有力工具[6].该技术主要包括以下几个步骤:①样品的固定;②样品的制备和预处理;③预杂交;④探针和样品变性;⑤用不同的探针杂交以检测不同的靶序列;⑥漂洗去除未结合的探针;⑦检测杂交信号,进行结果分析.2 r RNA为靶序列的F ISH检测在微生物学研究中F I SH检测最常使用的靶序列是16S r RNA,这是由于16S r RNA具有遗传稳定性,它的结构域具有保守区和可变区[7].对于每个分类水平,根据r RNA目标区域可设计寡核苷酸探针,进行种属特异性鉴定.16S r RNA基因比较测序在进行微生物鉴定时是最简便和准确的,尤其是对混合菌群和未被培养的微生物进行诊断时更为重要[20].在每个处于复制和代谢活跃的细胞中高拷贝的16S r RNA通常为监测单个细菌细胞提供了足够的靶序列,甚至是在F I SH中用单个标记的寡核苷酸.其他的靶序列如23S r RNA[8]、18S r RNA[9,10]和mRNA[11]也被成功的用于F I SH检测.近年来,广泛应用寡核苷酸探针或P NA探针的F I SH技术对特异微生物进行了鉴定和定量分析[12].3 F I SH诊断环境微生物多样性对于环境微生物的研究主要是依赖于纯培养[11],由于环境微生物中只有一部分能被培养,因此,进行微生物多样性分析时其结果往往是局限的.研究不同的环境微生物时发现显微镜下可见的微生物99%以上通过常规方法不能被培养[26],可见对不同环境样品研究时微生物的总数远远超过被培养的数量[12].微生物生态系统的比较r RNA测序分析比分类研究应用的更广泛,原因是核酸序列可以提供遗传距离、分子杂交探针等信息,可进一步用于鉴定、监测自然生态系统中的微生物[27].PCR(Poly merase chain reacti on)是快速检测微生物生态系统组成的方法,用通用引物(universal p ri m er)扩增环境样品中全部微生物的r DNA,克隆后测序[16].但是这一技术要求进行核酸的提取和扩增等步骤,在试验中也会出现偏差.F I SH技术则不需要进行核酸的提取和扩增,可以再现微环境中完整细胞的景象信息,具有更好的精确性,因此在环境微生物多样性等研究领域被广泛采用[17].近几年,应用F I SH技术研究自然环境微生物群落的报道较多,如海水沉积物的群落、海水、河水和高山湖雪水的浮游菌体、土壤和根系表面的寄居群落.F I SH技术不仅能提供某一时刻的微生物景象信息,还能监测生境中的微生物群落和种群动态,如海水沉积物连续流培养的微生物群落、原生动物摄食的增加对浮游生物组成的影响、季节变化对高山湖水微生物群落的影响等[18].此外,应用F I SH技术检测和鉴定未被培养的种属或新种属,如巨大硫酸盐细菌(Thio m a rgarita nam ibiensis)[21]、全噬菌属(Holophaga)[22]和酸杆菌属(A cidobacterium)[23]、未被培的芽孢杆菌属细菌(B acillus)[24]和水杆菌属细菌(A quabacteri m)[25]等.F I SH技术对于探明自然菌群的生态学和组成,以及群落对自然和人为因素动态变化的应答研究均是最有力的技术手段.58第5期 荧光原位杂交在微生物学中的应用及进展4 F I SH在污水处理微生物生态学中的应用早在1914年,A rdern[13]和Lockett[14]在曼彻斯特就发明了活性污泥法净化废水,然而在废水处理过程中微生物群落的作用和生态学特性一直没有得到深入的研究.研究活性污泥等复杂微生物群落时,分子生物学分析显示混合菌群具有较高的多样性,但是只有非常少的微生物被分离和鉴定[15].可见,只有了解微生物个体、群落多样性以及絮体形成等特性,才能提高对处理系统的控制能力.在废水处理中对活性污泥功能菌群进行检测和记数,并掌握其原位生理学信息是一项重要的内容.常规的方法是检测特异底物转化率来研究活性污泥中重要功能菌群的活性,如氧消耗率、硝化、反硝化、磷吸收和释放、Fe3+的还原等.F I SH 技术能提供处理过程中微生物的数量、空间分布和原位生理学等信息.放射自显影和F I SH(MAR -F I SH)结合用于研究活性污泥中丝状细菌对有机底物的吸收,这种方法也被用于研究水体微生物,检测细菌生活力、数目和对特异有机底物的消耗.16S r RNA为靶序列的F I SH检测技术是快速可靠的分子生物学工具,可以不依赖培养方法监测环境样品中的种群并对其进行系统分类.这种方法被用于检测活性污泥微生物群落结构和数目,同时对特异菌群进行空间定位和原位生理学的研究,如动胶菌属(Zoogloea)、不动杆菌属(A cinetobacter)、丝状细菌和氨氧化细菌.4.1 F I SH监测废水处理中的微生物群落r RNA测序和F I SH结合的群落分析广泛用于监测生物反应器或废水处理厂的微生物多样性.应用共聚焦激光扫描显微镜(confocal laser scanning m icr oscope,CLS M)的F I SH技术可以对生物膜和活性污泥絮体的特异种群进行空间分布研究.Dom ingues等应用CLS M-F I SH研究了不同反应器的厌氧生物膜中的乙酸氧化细菌、脱硫微菌属、产甲烷细菌、硫酸盐还原细菌的分布. Amann和Snaidr根据PCR扩增的r RNA序列设计寡核苷酸探针,用F I SH技术诊断活性污泥中的微生物群落结构.亚硝酸氧化细菌和氨氧化细菌参与微生物氮素循环中的关键步骤,Schra mm 和Juretschko等在硝化流化床反应器和活性污泥中研究了这两种细菌数量和空间分布.Silyn-Roberts等应用F I SH技术对废水处理湿地生物膜进行了研究,结果表明亚硝化单胞菌属是主要的氨氧化细菌.Bond等应用F I SH技术对活性污泥生物除磷的菌群进行了鉴定.Taga wa等应用F I SH 技术揭示了UAS B反应器中颗粒污泥的微生物生态学结构,试验结果显示古细菌是颗粒污泥中的优势种群,产甲烷细菌的种群密度与乙酸的利用是正相关的.Syutsubo等研究了UAS B反应器中高温颗粒污泥的厌氧微生物群落,随着底物的变化的种群动态变化的规律.Sekiguchi等研究了UAS B反应器中高温和中温颗粒污泥的厌氧微生物群落,揭示了微生物的多样性和空间分布,对其原位生理学和功能进行了探讨.Sorensen等和Rocheleau等在厌氧消化和厌氧污泥颗粒中应用F I SH技术对古细菌如产甲烷菌等进行了分子诊断.Schupp ler等发现生活污水处理厂的丝状泡沫物中存在放线菌菌群,同时研究了引起污泥膨胀的菌群.4.2 F I SH用于微生物的原位生理学和功能性研究N ielsen等对工业废水处理厂活性污泥的细菌表面疏水性进行了原位检测,应用F I SH技术结合细胞表面微球体(m icr os phere adhesi on t o cells,MAC)分析,研究了丝状细菌的胞外聚合物(extracellular poly meric substances,EPS).Schra mm 等将F I SH和微传感器结合,同时分析微生物群落和代谢活性,揭示了厌氧微生物在有氧环境中的缺氧微生态位.近年来,绿色荧光蛋白(green fluorescent p r otein,GFP)分子被应用到微生物生态学的研究中,将不同的基因插入微生物的质粒或染色体DNA,表达的绿色荧光蛋白分子能在单细胞水平可视化和监测启动子活性或基因的表达.Eberl等应用结合报告基因分析的F I SH技术研究了活性污泥的微生物生态学.Moller等研究了生物膜的微生物空间分布、启动子诱导及其表达的时序进程,同时对菌群间的相互影响进行了分析. Christensen等用F I SH技术鉴定了生物膜中的恶臭假单胞菌,并将gfp基因标签的质粒导入该菌获得了景象信息.5 F I SH技术的应用前景应用在线监测活性污泥絮体或生物膜中特异的化合物,如氧、硫化氢、硝酸盐、亚硝酸盐或pH 等是目前采用的主要分析方法.常规的在线分析68哈尔滨师范大学自然科学学报 2006年结合F I SH技术既能监测生物膜的生长和群落组成动态及其代谢活性,又可以揭示影响因子与生物相动态变化的映射规律.微放射自显影和F I SH 技术结合常用于研究混合菌群代谢活性,将混合菌群或活性污泥接种到放射性标记的底物,通过放射性标记底物吸收情况获得景象信息,从而限制和监测活性污泥中某些细菌种群[28].细菌的原位杂交与功能研究结合是F I SH技术进一步发展的方向,如进行基因表达和代谢水平的研究[29].F I SH技术可用于确定细胞和组织中特异性转录物定位及其表达的相对水平,它是用一标记生物素或地高辛的非同位素探针,和所制备样本中的RNA进行杂交.地高辛内标记的反义多聚核苷酸探针,在反转录过程中杂交到细菌细胞中,这一技术将是研究复杂环境中原位基因表达最有利的手段.结合报告基因分析的F I SH 技术对于复杂微生物群落的结构-功能分析也是十分有利的.P NA(Pep tide Nucleic Acid,即核酸肽)探针具有稳定、不易降解和较高的杂交亲和力等特性,检测细菌细胞的r RNA具有较高的灵敏性,即使是细菌死亡后的一段时间也可能被检测到.寡核苷酸探针有时不能完全通过细菌的细胞壁到渗透细胞内,特别是一些耐酸杆菌和革兰氏阳性菌,从而导致F I SH检测的背景信号和假阴性的出现.P NA探针主链骨架是中性的,并且通常比寡核苷酸探针短,能够通过疏水的细胞壁具有较好的渗透性[30].由此可见P NA探针将会进一步推动F I SH技术在环境微生物学中的应用.最近,多彩F I SH (Multicol or F I SH,M-F I SH)技术可以通过多种标记的探针和荧光染料同时检测多个靶序列,对不同的种属进行鉴定和分类.6 展望F I SH技术与其他技术的结合可为环境微生物学研究提供更多的信息.共聚焦激光扫描显微镜和多光子显微镜的应用,可获得较好的景深和清晰的图象,与微传感器相结合也是F I SH技术在环境微生物学中应用的又一技术手段.总之,结合荧光显微镜和流式细胞计的F I SH技术是诊断和评价复杂微生物群落的种群结构及其动态学最有前景的技术手段.参 考 文 献1 吴永强,陈秉俭,朱美珍,宋鸿遇.丙酮酸对浑球红假单胞菌突变株(G OG AT-N if-)固氮酶活性的调节.植物生理学报,1992,18(3):285～292.2 王星,宋鸿遇.浑球红假单胞菌G OG AT缺失株中依赖2-酮戊二酸的固氮酶诱导.植物生理学报,1989,15(3):269～274. 3 MSX对光合细菌G OG AT缺失突变株(nif-)固氮酶的诱导.植物生理学报,1988,14(1):56～61.4 贺逸秋,陈汉才,宋鸿遇.光合细菌Rhodop seudomonas cap sulata 固氮酶合成的光促诱导.植物生理学报,1981,7(2):193～200.5 孙金华,宋鸿遇.光与氨对Rhodop seudomonas cap sulata固氮活性的调节.植物生理学报,1985,11(1):84～92.6 吴永强,宋鸿遇.光合细菌固氮分子生物学研究进展.植物生理学通讯,1991,27(3):161～166.7 王继华,李集临,郭长虹.小麦-黑麦易位系的鉴定.哈尔滨医科大学学报,2002,36(4):138～139.8 朱核光,赵琦琳,史家梁.光合细菌Rhodop seudomonas产氢的影响因子实验研究.应用生态学报,1997,8(2):194～198.9 任南琪,王宝贞.有机废水处理生物制氢技术.中国环境科学, 1994,14(6):411～41410 Trebesius K.H.,Har m sen D.,Rakin A.,Schmelz J., Heese mann J.Devel opment of r RNA-targeted PCR and in situ hybridizati on with fluorescently labeled oligonucleotides f or the detecti on of Yersinia s pecies.J.Clin.M icr obi ol.,1998,36:2557～256411 L ische wski A.,Amann R.,Har m sen D.,Merkert H.,Hacker J.,Morschh user J.Specific detecti on of Candida albicans and Candida tr op icalis by fluorescent in situ hybridizati on with an 18S r RNA-targeted oligonucleotide p r obe.M icr obi ol ogy,1996,142:2731～2740.12 Baschien C,Manz W,Neu TR,et al.Fluorescence in situ hybridizati on of freshwater fungi.I ntenati onal Revie w of hydr obi ol ogy,2001,86(4～5):371～381.13 W anger M.,Schm ide M.,Juretschko S.,Trebesius K.H., Bubert A.,GoebelW.,Schleifer K.H.I n situ detecti on of a virulence fact or mRNA and16S r RNA in L isteria monocyt ogenes.FE MS M icr obi ol.Lett.,1998,160:159～168.14 Stander H.,Kurtz man C.,Hyldig-N ielsen J.J.,SorensenD.,B r oomer A.,O liveira K.,Perry-O′keefe H.,Sage A.,Young B.,Coull J.I dentificati on of B rettanomyces(DekkeraB ruxellensis)fr om wine by fluorescence in situ hybridizati onusing pep tide nucleic acid p r obes.App l.Envir on.M icr obi ol.,2001,67,938～941.15 Amann R.I.,Ludwig W.,Schleifer K.H.Phyl ogenetic identificati on and in situ detecti on of individual m icr obial cells without cultivati on.M icr obi ol.Rev.,1995,59:143～169. 16 Dai m s H.,B ruhl A.,Amann R.I.,Schleifer K.H.,W agner M.The domain-s pecific p r obe EUB338is insufficient f or the detecti on of all bacteria:devel opment and evaluati on of a more comp rehensive p r obe set.Syst.App l.M icr obi ol.,1999,22:434～444.17 Roller C.,W agner M.,Amann R.I.,Ludwig W.,Schleifer K.H.I n situ p r obing of gra m-positive bacteria with high DNA G+C content using23S r RNA-targeted78第5期 荧光原位杂交在微生物学中的应用及进展oligonucleotides.M icr obi ol ogy.,1994,140:2849-2858.18 Anja B.F,.Isabell Fischer,Peter Pr oksch,J rg Hacker,U te Hentschel.Te mporal variati on of the m icr obial community ass ociated with the mediterranean s pone Ap lysina aer ophoba.FE MS M icr ob.Ecol.,2001,38:105～113.19 Neef A.,Amann R.I.,Schlesner H.,Schleifer K.H.Monit oring a wides p read bacterial gr oup:in situ detecti on of p lanct omyceteswith16S r RNA-targeted p r obes.M icr obi ol ogy,1998,144:3257～3266.20 K mpfer P.,Erhart R.,Bei m f ohr C.,B hringer J.,W agner M.,Amann R.I.Characerizati on of bacterial communities fr om activated sludge:Culture-dependent numerical identificati on using gr oup-s pecific and genus-s pecific r RNA-targeted oligonucleotide p r obes.M icr ob.Ecol.,1996,32:101～121.21 O r phan V.J.,House C.H.,H inrichs Kai-Uwe,McKeegan K. 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