生物样本样品前处理资料
生物等效性实验生物样品处理注意事项(严)知识讲解
生物等效性实验生物样品处理注意事项(严)生物等效性实验生物样品处理注意事项一、样品采集后的的处理和贮存鉴于生物样本的特点，为了避免样品中被测药物发生分解或产生其他化学变化，取样后最好立即进行分析测定，但实际工作中几乎无法做到，常需将收集到的样品冷藏、冰冻，临用前再融化并放至室温后使用。
在样本冷冻贮藏前，需及时进行处理。
1.1血液样本处理注意事项1.1.1. 在肌肉注射或静脉输含有葡萄糖或电解质(含钾、钠、氯离子)的液体时，建议3小时以后采集静脉血样本进行这些项目的检验，以防止上述检验项目因输液引起的假性升高。
1.1.2保定非麻醉状态的动物时应尽量避免用力挤压动物头颈和胸腹，以免引起血液淤滞，局部组织缺氧，造成血液某些成分的改变，特别是测定乳酸，血液含氧量等指标时。
1.1.3血液中红细胞内外成分有很大差异，溶血可造成红细胞内的物质向细胞外转移，如K+、Mg2＋和某些酶类(LD、AST、ALT、ACP)；另外，溶血还可干扰某些化学项目(TBil、DBil、TC等)的测定，严重影响结果的准确性，血样本应防止溶血。
引起溶血的原因有：注射器采血时抽吸力太大；血液与抗凝剂比例失调；混匀样本时过度振荡；注射器或采血容器带水或容器污染；全血放置时间长或突然受冷或受热；注射器中的血沫注入采血容器；真空采血时如未采满至相应刻度，残存负压造成红细胞破裂；不拔针头直接注入采血容器；样本离心时离心力过大等。
为避免溶血，取血时应注意：①、抽拉注射器时应尽量避免注射器内产生大量真空；②、添加抗凝剂后的容器在除必要干燥流程后应及时密封；③、混匀样本时避免用力过度，切勿产生泡沫；④、避免重复使用注射器、针头、采血管、毛细玻璃管等一次性用品，手术刀片和剪刀等器材取材时尽量洗去残留血液；⑤、采血时的室温应控制在22℃至25℃，采取的血液容器在需要放入冰盒时，切勿紧贴冰袋，冰水；⑥、当注射器内因吸入空气产生血沫时，注意弃掉血沫，在将血液注入采血容器时勿将血沫一并注入；⑦、使用真空采血管需抽取负压时切勿过量；⑧、将血液注入采血容器时要除去针头，轻柔推入；⑨、离心带有血细胞的血样时，按照规格设定离心参数；1.1.4. 正确选择采集管。
生物样本分析
1、生物样本种类，特点，及前处理方法1）血液。
分为血浆/血清或全血。
测定血浆或血清中的药物浓度能较好的反映体内药物浓度变化。
若专门测定平均分布于血细胞内外的药物浓度，则用全血。
血浆采集应加入抗凝剂。
离心，取上清液，血清静置，移走血饼，离心，取上清液。
处理方法有沉淀蛋白法、液液萃取法、固相萃取法。
2）尿样，用于药物剂量回收研究、药物尿清除率、生物利用度研究。
易收集，但易受生理情况影响。
方法：酸解或酶解可使药物从缀合物中游离出来。
3）唾液：易收集，采集后应立即出去泡沫部分的体积，放置后易分层，离心，取上清液。
4）组织：为药物的吸收、分布、代谢、排泄等体内过程提供重要信息。
组织处理方法：匀浆化法，蛋白沉淀法，酸碱水解，酶水解5）头发：取样方便，无伤害，检样的掺伪可能性低，可测微量元素。
头发采集后需洗涤，处理方法有提取法，有机破坏法。
6）其他：乳汁，精液。
2、生物样品前处理方法及特点1）有机破坏法：包括湿法破坏、干法破坏和氧瓶燃烧法，适合人发样品的破坏破坏能力强，反应激烈。
2）直接沉淀法：将一定量生物样品加蛋白沉淀剂，涡旋，离心，取上清液进样。
当样品中待测物浓度较高，所用方法的特异性和灵敏度达到检测要求时可以考虑用直接沉淀法。
注意沉淀剂体积、沉淀剂的选择及对药物稳定性的影响（氧化、酸不稳定）。
可使接合型药物释放出来，缺点容易乳化。
3）液液萃取法：取一定量生物样品加有机提取溶剂，涡旋，离心，取有机层，氮气吹干，流动相溶样进样。
多数药物亲脂，在适当有机溶剂中溶解度大于水相，而血样或尿样中含有的大多数内源性杂质是强极性水溶性物质，液液萃取可除去大部分杂质，从大量样品中提取药物经浓集后用于分离。
注意水相pH值，提取溶剂以及有机相和水相的体积，优点在于选择性，这依赖于有机溶剂的选择。
药物能与多数内源性物质分离，缺点在于乳化现象的产生：有机溶剂易挥散、有毒性、对环保不利及不能自动化。
4）固相萃取法：将不同填料作为固定相装入微型小柱，当含有药物的生物样品溶液通过时，由于受到吸附或分配或离子交换或其它亲和力作用时，药物或杂质被保留在固定相上，用适当溶剂洗出杂质，再用适当溶剂洗脱药物。
生物等效性试验中样本保存及前处理应注意的几个问题
生物等效性试验的样本来源多为血样或尿样，所含的药物浓度较低，内源性干扰成分多，目标药物多与蛋白结合或呈缀合状态，在整个试验过程中，样本测定周期长，测试工作量大，因此其分析方法学的要求与一般的药物分析方法相比具有其自身的特点，我们在建立方法学时，应注重以下几个方面：一、样品采集后的的处理和贮存鉴于生物样本的特点，为了避免样品中被测药物发生分解或产生其他化学变化，取样后最好立即进行分析测定，但实际工作中几乎无法做到，常需将收集到的样品冷藏、冰冻，临用前再融化并放至室温后使用。
在样本冷冻贮藏前，需及时进行处理。
血浆和血清都需要在采血后及时分离（24小时内），若不及时分离，血凝后再冰冻保存，则因冰冻时引起细胞溶解，阻碍血浆或血清的分出，同时因溶血而影响药物浓度变化。
尿液主要是水、尿素及盐类，是很好的细菌生长液，因此应在取样后立即测定。
不能立即测定时，应于4℃冷藏，如在室温保存，则应在采样后的尿液中加入少量防腐剂甲苯（1%）或氯仿（饱和）。
生物样品中的一些不稳定的药物（如普鲁卡因、丙酸、红霉素、阿糖胞苷），易受血浆酯酶水解的影响，当采好样品之后应立即加入酯酶抑制剂氟化钠、三氯醋酸等，防制药物分解。
易氧化的药物（如儿茶酚类、阿扑吗啡等）一般直接在-15℃仅能保存4周；若样品中加入维生素C或其他抗氧剂，则可稳定10周。
生物样品在采样、贮存与分析过程中都应注意可能造成样品的损失或污染，以免将污染物作为药物新的代谢物。
二、生物样本贮存期间的稳定性考察由于生物等效性试验样本从采样到检测的周期通常需要几周至几个月，在其贮存期间目标药物的稳定性需经考察验证。
含药样本稳定性是指样品中的药物从采样至测定时性质和含量的稳定程度，它是贮存条件、药物的化学性质、空白生物样品和容器系统的函数，在特定的容器和生物样品中待测物的稳定性不能外推至其他系统。
生物样本稳定性的评价应考察：1、短期室温稳定性：要求高、低浓度样本在4~24 h内稳定。
基于液质联用技术的生物样本前处理方法开发及应用
基于液质联用技术的生物样本前处理方法开发及应用
本文介绍了一种基于液质联用技术的生物样本前处理方法。
该方法利用了液相色谱和质谱联用技术的优势，能够同时检测多个生物标志物，并对生物样本进行高效的前处理。
具体来说，该方法主要包括以下步骤：1）样本的前处理，包括加样、洗脱、浓缩等；2）液相色谱分离，采用C18反相柱进行样品分离；3）质谱检测，使用多反应监测(MRM)技术进行检测。
实验证明，该方法能够有效地检测人体血液中的多种生物标志物，包括蛋白质、代谢物等，并在肿瘤标志物的检测中取得了良好的效果。
该方法具有高效、准确、灵敏等优点，可为生物医学研究提供重要的技术支持。
- 1 -。
临床试验生物样本的处理与保存规范
临床试验生物样本的处理与保存规范朱园园王思扬任健郝娟王红霞支婷婷张瑞琴DOI ：10.11655/zgywylc2019.16.079基金项目：山西医科大学第二医院青年基金（201702⁃3）作者单位：030001太原，山西医科大学第二医院药学部临床试验是新药人体试验的起始阶段，即评价人体对于新药的耐受性和安全性［1］。
2003年国家食品药品监督管理总局（CFDA ）颁布了《药物临床试验质量管理规范》（GCP ），其中规定研究者应获得所在医疗机构或主管单位的同意，保证有充分的时间在方案规定的期限内负责和完成临床试验，从而保证临床试验高质量进行，得出真实、科学、可信的试验结果。
临床试验的规范程度直接关系到药物研发的成败［2⁃3］，在试验的整个过程中生物样本处理与保存环节中尤为重要，对试验的结果的准确性起着关键的作用，也是保证检测数据真实可靠和溯源的重要依据。
本研究结合本研究室近年开展的多个试验项目，探讨生物样本处理与保存的重要性，从而建立科学的标本处理与保存的流程，旨在提高临床试验生物样本的安全以及试验结果的准确可靠。
1临床实验标本处理前准备1.1管理制度：在《药物Ⅰ期临床试验管理指导原则（试行）》中规定按照临床试验方案和标准操作规程（SOP ）采集、处理和保存临床试验生物样本。
样本容器的标识应有足够的信息量，易于识别和具有唯一性。
生物样本转运和保存应符合试验方案和相关SOP 的要求，保证其完整性和活性不受影响，并做好记录。
在试验过程中，应保证生物样本的标识性和可溯源性，建立样本标识、移交和保存等相关记录和样本的储存档案。
严格的管理制度和完善的SOP 是药物临床试验顺利实施的保证。
管理的规章制度可以规定实验室人员“应该做什么”，而“如何规范操作”是通过SOP 具体阐述的，所以SOP 必须具备可操作性，才能将规范化落到实处。
1.2实验室研究人员培训［4］：实验室研究人员责任心要强，要有扎实的技术理论基础，且具有丰富实验操作经验，同时需经过GCP 培训，要有严谨的科学研究态度，在每一项临床试验前，要认真学习临床试验方案、生物样本处理和保存的SOP ，并遵循“赫尔辛基宣言”，保证临床试验的质量。
生物样本样品前处理
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常用液液提取溶剂
溶剂名称 二氯甲烷 乙酸乙酯 氯代正丁烷
乙醚 戊烷 环己烷 正己烷 甲苯 异丙醇* 四氢呋喃* 乙腈* 正丁醇* 水*
分子量 84.9 88.1 92.6 74.1 72.2 84.2 86.2 92.2 60.1 72.1 41.1 74.1 18.0
注：“*”表示与水互溶
沸点（℃） 40
5、固相萃取法：可实现自动化，基质效应降低，同时完成样品的富
集与净化；但成本较高
3
液液提取法
利用目标化合物在生物基质和与水不互溶的有机溶剂中溶解度或分配 系数的不同，使化合物从生物基质中转移至有机相中。
➢两相的分离需借助两相的密度差来实现
➢原理：相似相溶
➢分配系数：kA=yA/xA yA和xA分别表示在萃取相和萃余相中的质量比率
常见表面活性剂：Triton-X-100，吐温等
Tips
1、表面活性剂需确立一个浓度范围而不是单一浓度。 2、样本已经采集，考虑将待测物从容器中解离出来。
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讨论和问题
Thank you!
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0.08 0.36 1.66 1.63 3.92 1.50 1.84
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固相提取法
◇HLB(Hydrophilic-Lipophilic Balance Copolymer)材料的优点
△水可浸润 △反相保留 △PH1-14范围内稳定 △没有裸露硅羟基
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固相提取法
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固相提取法
8
固相提取法
改变化合物PH，酸性 保留，碱性洗脱
77.1 77
34.5 36.1 80.7
69 110.6 82.4
66 81.6 117 100
密度（g/mL) 1.33 0.90 0.89 0.71 0.63 0.78 0.66 0.87 0.79 0.89 0.78 1.00 1.00
样本前处理的主要目的
样本前处理的主要目的样本前处理是科学研究中非常重要的一步。
它是指对采集的样本进行预处理，包括样本的采集、保存、加工等多个阶段，以保证后续实验或分析的可靠性和准确性。
那么，样本前处理的主要目的是什么呢？1. 减少误差误差是科学研究中必须要考虑的因素。
样本前处理可以减少不同因素引起的误差，最终提高实验准确度。
例如，在搜集样本的过程中，如果没有一定的规范和标准操作流程，就容易产生各种误差。
比如，采样过程中引入空气、水、尘土等杂质，样本就会被污染从而影响后续实验或分析的结果。
而进行适当的先处理操作，诸如过滤、研磨等，可以有效减少各种误差。
2. 提高实验/分析数据可靠性样品是科学研究的基础。
在实验或者数据分析过程中，样品的可靠性非常关键，而样品的选择、取得和保存都需要非常严格的标准操作。
在样本前处理过程中，可以对样品进行去除杂质、减少可能影响分析的干扰因素等基础工作。
严格执行标准操作流程可以保证样品的高纯度，有效地提高数据的可靠性。
3. 提高实验/分析的灵敏度在样本前处理过程中，常常需要对样品进行预处理，例如对生物样本进行光学去除、化学处理等操作。
这些操作可以有效地去除杂质或者增强分析灵敏性。
例如，对样品进行蛋白质提取预处理，可以有效提高蛋白质分析的灵敏度。
因此，在实验数据的分析环节中，样本前处理阶段对实验灵敏性的提高是非常重要的。
4. 提高实验/分析的再现性科学研究的可重复性和再现性是其核心价值所在。
好的科学实验和研究项目，必须具有较高的可重复性和再现性。
而样本前处理对于实验和数据的再现性有着至关重要的作用。
在样本前处理的过程中，需要进行标准化的操作流程和标准品制备。
这些措施不仅可以保证不同实验者在操作上能够遵循同样的标准流程，而且也可以确保结果的可再现性。
综上所述，样本前处理主要目的是减少误差、提高实验/分析数据的可靠性和灵敏性，以及提高实验/分析结果的再现性。
科学研究过程中的样本前处理环节必须得到充分重视和严格贯彻执行。
通用课件病原微生物样本的采集保存与运输定稿
细菌性食品中毒的主要检验样本
主要检验样本
粪便 、食品、血液 粪便 、食品 食品、呕吐物 食品、呕吐物
粪便 、食品
食品、呕吐物 粪便、食品 食品、呕吐物 食品、粪便 、呕吐物
病原微生物样本
采 集
保 存
运 输
基本原则 采集条件 采集要求 采样时间 样本种类 样本数量 采集方法
样品种类
饮用水 液体食品 固体食品 呕吐物 洗胃液 腹泻物 血液 脑脊液 皮损分泌物
• 采样管外贴上标签，注明患者的姓名、样本种类、采样时间采样人等基本 信息。
• 当患者出现神经系统症状时采集，检测IgM只需一份脑脊液。而检测IgG 则需收集两次，分别于发病初期和恢复期采集。
病原微生物样本
采 集
保 存
运 输
基本原则 采集条件 采集要求 采样时间 样本种类 样本数量 采集方法
• 血液样本
食物中毒细菌
沙门菌 副溶血性弧菌 金黄色葡萄球菌
蜡样芽胞杆菌
常见食品
肉类、蛋品 水产品、醃制品 肉类、乳品、淀粉制品
米饭、肉、乳、淀粉制品
致泻性大肠杆菌
凉拌菜、肉制品
椰毒假单胞菌 产气荚膜梭菌
肉毒梭菌
变形杆菌
玉米面、银耳
肉制品
堆放牛羊肉、罐头、 香肠、鱼、豆制品
动物性食品 特别是熟肉和内脏制品、冷盘
病原微生物样本
采 集
保 存
运 输
基本原则 采集条件 采集要求 采样时间 样本种类 样本数量 采集方法
• 咽拭子
采集病人发病3日内的咽拭子样本，用于病原检测（病原分离、核酸检测的阳性 率较高）。用压舌板将舌向下向外压，用专用拭子在咽后壁或悬雍垂后侧适当 用力涂抹数次，应避免触及口腔及舌部，迅速将棉签放入装有3-4mL保存液 （Hank氏液或生理盐水）的15mL外螺旋盖采样管中，在靠近顶端处折断棉签， 注明患者的姓名、样本的种类、采样时间、采样人等基本信息。 （5岁以下婴童采样时先将拭子用保存液蘸湿，在试管壁挤干后在进行采样）
生物样本处理和存储的技术与质量控制
生物样本处理和存储的技术与质量控制近年来，生物样本处理和存储的技术与质量控制越来越成为生物医学研究的重要问题。
生物样本是指从人体或动物体中取得的生物样品，如血液、尿液、组织、细胞等，广泛应用于医学、生物学、生态学等领域的基础研究和临床诊断、治疗等方面。
因此，如何正确地处理和存储生物样本，以保证其质量和可靠性，对于生物医学研究的准确性和可重复性具有重要的意义。
一、生物样本处理技术生物样本处理是指从采样到保存样本的整个过程。
在生物样本采集过程中，操作不当会导致样本污染、变性或失活，影响后续检测结果。
因此，需要制定一系列科学、规范的样本采集、处理、运输、储存和分析操作流程，确保生物样本的质量和可靠性。
首先，应注意选择适当的采样时期和方法。
不同的生物样本采集时期和方法会对检测结果产生影响。
比如，血液样本应在晨起后空腹采集，避免饮食、运动等因素的影响。
在采集组织样本时，应注意切取位置、大小和深度等因素，以避免切取不到目标细胞或切取过多而导致组织坏死等问题。
其次，应注意样本预处理的规范化。
比如，在血清或血浆样本处理前，需要先将血液采集到采血管中，离心分离血细胞和血浆或血清。
在细胞样本处理前，需要对细胞进行足够洗涤，避免外界因素和残留细胞滋生污染。
最后，应注意样本质量检测。
一方面，需要明确样本储存条件，比如温度、湿度、冷冻状态等。
另一方面，常规的样本质量检测如样本完整性、污染、浓度、纯度、稳定性等，并且应选择可靠的检测方法，比如质谱、电泳、色谱等。
二、生物样本储存技术生物样本的储存涉及样本预处理、冷冻和保存条件等多个方面，其中最为重要的是样本冷冻储存。
冷冻贮存是目前最常用的生物样本储存方式之一，可防止生物大分子的降解和细胞因素的退化，确保在长时间内的可重复和可比性。
因此，生物样本储存是保证科研项目可行性和可重复性的关键之一。
生物样本储存需要注意的方面包括：1.储存温度：温度是影响生物样本质量的重要因素。
存贮温度过高，样本会退化、降解或失活。
生物样本样品前处理
包括抗凝、分离血清或血浆等步骤，为血液学实验提 供合格的样本。
THANKS
感谢观看
对于光敏感的样品，在处理和 保存过程中应避免直接光照， 采用避光容器或包装材料。
添加稳定剂
根据样品的性质，可以添加适量 的稳定剂，如抗氧化剂、防腐剂 等，以保持样品的稳定性。
减少处理时间
尽量缩短样品前处理的时间，减 少样品暴露在不利环境中的机会
，从而降低样品变质的风险。
05
样品前处理中的质量控制
质量控制标准制定
稳定性和可重复性。
前处理流程简介
样本收集与保存
根据研究目的和实验设计，选择合适的生物样本（如血液、尿液、组织等），并进行适当的保存和处理，以避免样本 变质或目标分析物的损失。
样本预处理
对收集到的生物样本进行初步处理，如离心、过滤、稀释等，以去除杂质和干扰因素，为后续的分析步骤提供纯净的 样本。
目标分析物的提取与富集
03
代谢物衍生化
利用色谱、质谱等技术对代谢物 进行分离和纯化，去除干扰物质。
对于某些难以检测或不稳定的代 谢物，可以通过衍生化反应提高 其检测灵敏度和稳定性。
其他生物样本前处理技术
组织样本前处理
包括组织固定、脱水、包埋、切片等步骤，为后续组 织学观察和实验提供基础。
细胞样本前处理
包括细胞培养、传代、冻存等步骤，为细胞实验提供 充足的细胞来源。
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样品分离与纯化
分离技术介绍
01
02
03Leabharlann 色谱分离技术利用不同物质在固定相和 流动相之间的分配系数差 异，实现样品的分离，如 液相色谱、气相色谱等。
电泳分离技术
利用物质在电场作用下的 迁移速度差异，实现样品 的分离，如凝胶电泳、毛 细管电泳等。
扫描电镜高真空模式微生物样本的前处理
扫描电镜高真空模式微生物样本的前处理一、取材将菌株接种中液体培养基中，培养至一定时间后，离心收集菌体，弃上清，留沉淀。
二、固定戊二醛固定向沉淀中加2.5 %（v/v）戊二醛（将25%的戊二醛母液用pH值6.8的磷酸缓冲液（PBS，配置方法见文后）稀释十倍）1ml，4℃固定12 h，用pH值6.8磷酸缓冲液洗涤3次，离心收集回收菌体，弃上清。
三、脱水乙醇梯度脱水将沉淀依次在30 %、50 %、70 %、80 %、90 %、95 %、100 %、100 %乙醇中浸泡10 min进行梯度脱水，每个梯度乙醇脱水后离心收集菌体，再进行下一个梯度的脱水处理。
最后再离心收集菌体。
四、媒介剂置换（临界点干燥法此步可省略）乙酸异戊酯置换乙醇乙酸异戊酯置换乙醇两次，每次20 min，每次置换后8000 rpm，离心5 min回收菌体。
五、干燥方法一：空气干燥法（效果不好）将样品从醋酸异戊酯中取出，放置于干燥钵中干燥2~4 h。
方法二：临界点干燥法将样品从乙醇中取出，充入液体二氧化碳，液体二氧化碳置换乙醇，20－60分钟，升温升压达到二氧化碳临界点(31℃, 72.8大气压)，维持4分钟，保持温度和压力并缓慢放出二氧化碳，大约持续30分钟。
方法三：冷冻干燥法将样品从醋酸异戊酯中取出，分别于-20℃、-40℃、-80℃冷冻12 h，于冷冻干燥仪中干燥12 h备用。
六、导电处理离子溅射镀膜法将样本固定到导电胶布上，竖直放置到离子溅射仪的样品台上，按照抽真空1 min，离子溅射30 s对样本进行离子溅射镀膜。
七、电镜观察将样品从离子溅射仪中取出，放入扫描电镜中，高真空模式观察。
各种组织匀浆样本用于ELISA检测的处理方法
各种组织匀浆样本用于ELISA检测的处理方法ELISA(酶联免疫吸附试验)是一种常用的生物学实验方法，用于检测样本中特定分子的存在，如抗体、抗原、蛋白质等。
对于ELISA检测，颗粒样本的处理是非常重要的步骤之一，因为它可以消除潜在的干扰物，提高检测的准确性和可靠性。
下面将介绍一些常见的组织匀浆样本处理方法。
1.组织匀浆样本制备通常情况下，组织样本需要首先经过匀浆处理，以得到细胞和组织的裂解液。
一般来说，采用以下基本步骤：1.1取出所需组织样本，并在冰上迅速切割成小块。
1.2 将组织块放入冷冻匀浆管中，并加入适量的缓冲液，如磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液+0.1% Triton X-100等。
1.3使用研磨器、匀浆器或超声波仪器对组织块进行处理，直至均匀混合。
1.4将均浆液离心，以去除固体碎片和细胞残渣。
2.组织匀浆样本的稀释制备好的组织匀浆样本通常需要稀释，以使其适合ELISA检测的要求。
通常采用以下步骤：2.1选取适当的稀释液，如PBS缓冲液、BSA溶液等，根据实验需求和标准方案进行选择。
2.2将制备好的组织匀浆样本与稀释液按照一定比例混合，比如1:2、1:5等，以得到适当浓度的样品溶液。
3.组织匀浆样本的前处理在ELISA检测前，对组织匀浆样本进行前处理可以去除一些潜在的干扰物，并提高检测的灵敏度。
以下是一些常见的前处理方法：3.1丙二醛固定化：将组织匀浆样本加入适量的丙二醛溶液中，固定其中的蛋白质，以避免在ELISA检测中失去目标分子。
3.2蛋白酶处理：一些样本可能含有特殊结构的蛋白质，如膜蛋白等。
在进行ELISA检测之前，可以用适当的蛋白酶进行处理，如蛋白酶K、胰酶等。
4.组织匀浆样本的加样与检测经过前期处理和稀释后，组织匀浆样本可以用于ELISA检测。
通常的操作步骤如下：4.1将稀释后的组织匀浆样本加入已涂有特定抗原或抗体的酶标板孔上。
4.2确保每个样品加入相同体积的孔，以保持每个孔的样本负载均衡。
体内药物分析测定前生物样品的预处理及定量分析方法
宴游之乐(醉人)
心情：禽鸟乐——人之乐——乐其乐 与民同乐(醉情)
可取之处
重视朗读，有利于培养学生的文言语感，并通过节奏划分引导学生理解文意，突破了仅按注释疏通文义的桎梏，有利于引导学生自主思考；不单纯关注“直译”原则，同时培养学
之”是总起词语，故应从其后断句。【教学提示】引导学生在反复朗读的过程中划分朗读节奏，在划分节奏的过程中感知文意。对于部分结构复杂的句子，教师可做适当的讲解引导。目标导学三：结合注释，
翻译训练1．学生结合课下注释和工具书自行疏通文义，并画出不解之处。【教学提示】节奏划分与明确文意相辅相成，若能以节奏划分引导学生明确文意最好；若学生理解有限，亦可在解读文意后把握节
到贬谪的除了范仲淹和滕子京之外，还有范仲淹改革的另一位支持者——北宋大文学家、史学家欧阳修。他于庆历五年被贬谪到滁州，也就是今天的安徽省滁州市。也是在此期间，欧阳修在滁州留下了不逊
于《岳阳楼记》的千古名篇——《醉翁亭记》。接下来就让我们一起来学习这篇课文吧！【教学提示】结合前文教学，有利于学生把握本文写作背景，进而加深学生对作品含义的理解。二、教学新课目标导
易
三、体内药物分析测定前生物样品的预处理
样品种类 常用的样品的种类包括血样,唾液和尿液 血样是指全血、血浆或血清,一般情况下血浆分 离快、易得,故最常用 唾液是由腮腺、颌下腺、舌下腺及口腔黏膜内 腺体分泌的 尿药浓度测定主要用于剂量回收、药物代谢和 生物利用度等研究 脏器组织，除非特别需要，在临床治疗药物监 测中很少使用
1．在把握作者复杂感情的基础上朗读文本。2．反复朗读，请同学说说本文读来有哪些特点，为什么会有这些特点。(1)句法上大量运用骈偶句，并夹有散句，既整齐又富有变化，使文章越发显得音调铿锵，
形成一种骈散结合的独特风格。如“野芳发而幽香，佳木秀而繁阴”“朝而往，暮而归，四时之景不同，而乐亦无穷也”。(2)文章多用判断句，层次极其分明，抒情淋漓尽致，“也”“而”的反复运用，形
生物样品的扫描电镜制样干燥方法
生物样品的扫描电镜制样干燥方法一、本文概述扫描电子显微镜（SEM）是一种广泛应用于生物学、医学、材料科学等领域的高分辨率显微成像技术。
在生物学研究中，SEM被用于观察和分析各种生物样品的超微结构，如细胞、组织、微生物等。
然而，生物样品的电镜制样过程复杂且精细，其中干燥环节尤为关键，因为不当的干燥方法可能导致样品结构变形、失真，甚至破坏。
因此，本文旨在探讨和总结生物样品扫描电镜制样过程中的干燥方法，包括各种方法的原理、优缺点以及应用注意事项，以期为提高生物样品SEM分析的准确性和可靠性提供参考和指导。
二、生物样品扫描电镜制样概述扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope，SEM）是一种用于观察和研究材料表面微观形貌和组成元素分布的强大工具。
在生物学领域，SEM常被用于研究生物样品的微观结构和形态，如细胞、组织、微生物等。
然而，由于生物样品往往含有大量水分，且结构复杂、易变形，因此在SEM制样过程中，干燥方法的选择和应用至关重要。
生物样品的扫描电镜制样过程一般包括前处理、固定、脱水、干燥、镀金等步骤。
其中，干燥是制样过程中的关键步骤之一。
干燥不当可能导致样品变形、结构破坏、微生物活性丧失等问题，从而影响后续的观察和分析。
因此，选择适合的干燥方法对于保证生物样品SEM制样的质量至关重要。
目前，常见的生物样品干燥方法包括自然干燥、临界点干燥、冷冻干燥等。
自然干燥方法简单易行，但可能导致样品变形和微生物活性丧失；临界点干燥通过控制温度和压力，避免样品在干燥过程中发生收缩和变形，适用于一些对结构要求较高的样品；冷冻干燥则通过在低温下将样品中的水分升华，从而避免样品在干燥过程中发生变形和破坏，适用于一些对微生物活性要求较高的样品。
在实际操作中，应根据样品的性质和研究目的选择合适的干燥方法，并结合其他制样步骤，如固定、脱水、镀金等，以确保制样质量和后续观察的准确性。
随着技术的不断进步，新型的干燥方法和技术也在不断发展，为生物样品SEM制样提供了更多的选择和可能性。
透射电镜生物样品前处理步骤
透射电镜样品制备步骤取材醛类前固定缓冲液漂洗饿酸固定（后固定）缓冲液漂洗脱水剂梯度脱水丙酮/环氧丙烷臵换浸透（先于不同比例包埋剂-脱水剂再纯包埋剂长时间浸透）加热聚合修快超薄切片铀铅染色1、取材：4℃冰块上迅速取材，1mm3大小，立即放入2.5%戊二醛溶液中固定2-4h(4℃可保存1-2周，冷冻可保存2年)注：不可用自来水冲洗，被钳、镊夹取造成机械损伤的组织不可部分可取较大面积，但厚度必须小于1mm（戊二醛固定能力小于0.5mm）脑、胰等柔软组织先切成较大厚片于戊二醛固定数分钟增加硬度，再切成小块臵于新的戊二醛固定液小肠、周围神经、肌肉等方向性、易扭曲样本可绑在小波棒上固定，待硬化后纵行方向切成长方形固定2、漂洗：牙签取出样品至新的1.5ml离心管，用0.1M pH7.0磷酸缓冲液（PBS）漂洗样品三次（摇床），每次15min3、锇酸固定：1%锇酸溶液固定样品1-2h（临用前计算用量≤50ul/样，用0.1M PBS将2%锇酸稀释至1%，通风橱操作）注：饿酸固定时间过长会导致脂蛋白复合体溶解，使组织变脆，不利于切片3、再漂洗：吸出固定液，用0.1M pH7.0 PBS漂洗样品三次，每次15min注：漂洗以清除固定液，避免产生沉淀物干扰结构观察骨组织漂洗后需脱钙，EDTA-2Na脱钙液4、脱水剂梯度脱水：用梯度浓度（50%，70%，80%，90%和95%）乙醇溶液对样品进行脱水处理，每个浓度处理15min再用100%乙醇处理20min （乙醇细胞内抽提少，但与包埋剂相容性差）最后用纯丙酮处理20min（若包埋剂为Epon改用环氧乙烷臵换；Cell的固定脱水无需臵换）注：脱水以清除游离水以便包埋剂均匀渗透；脱水剂易吸收空气中水分，密封，臵换时应该迅速由低到高逐级脱水而不能急剧脱水，更换溶液时应迅速，以免组织内外产生气泡。
植物组织脱水时间延长，100%脱水剂中加入烤干的无水CuSO4、无水Na2SO45、包埋剂梯度渗透：①用包埋剂丙酮混合液（V/V=1/1）处理样品1h：计算用量80ul/样再配制(参考样品大小)②用包埋剂丙酮混合液（V/V=3/1）处理样品3h：计算用量80ul/样再配制(参考样品大小)③纯包埋剂渗透样品过夜：将样品移至干燥的新离心管中，常温过夜(所用器具均应干燥)注：样品周围不能有气泡6、加热聚合：牙签取出经渗透处理的样品至0.5ml干燥离心管（预先装入约300 ul包埋剂），加热聚合仪70℃加热过夜。
生物样本前处理技术
【讨论】生物样本前处理技术样本前处理技术在分析方法中占有极其重要的地位，很多分析问题都可以通过样本前处理解决，本文将对样本前处理过程中遇到的问题和样本前处理方法进行综述，以期形成一个系统。
本文将分为1.样本分类及采集2.初步处理3.游离药物分离4.萃取技术5.萃取后过程五个部分进行分别阐述。
其中有不少为个人观点，希望各位战友能不吝指正（纠正错字，纠正观点，进行讨论都欢迎），希望和园内战友共同学习。
-------------------------------------------------------------------------------- 楼主快点介绍吧。
-------------------------------------------------------------------------------- 1.1 生物样本分类生物样本多种多样，有血浆、血清、全血、淋巴、唾液、各种组织、毛发、尿液、胆汁、泪液、脊髓液、汗液、乳汁、羊水、粪便以及呼出的气体。
（以下文字主要摘自《体内药物分析》姚彤伟编著 2001年）生物样品可大致分为①均匀样品：血液、尿液、唾液、胆汁、脑脊液、淋巴液、乳汁和性腺分泌液等体液；②非均匀样品：心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、生殖器官、脑、体脂、胸腺肾上腺和骨骼肌等11种器官、组织。
Ruth Endacott[1]总结了临床样本采集时需要注意的问题以使采样够用和适用。
[1]:Endacott R, Botti M. Clinical research 3: sample selection. Intensive Crit Care Nurs. 2005 Feb;21(1):51-5.1.2 生物样品采集1.2.1 血样1.2.1.1 组成血样包括血浆、血清和全血，其中最常用的是血浆。
一般认为，药物在体内达到稳定状态时，血浆中药物浓度是与药物在作用点的浓度紧密相关的，即血浆中药物浓度可以反映药物在体内(靶器官)的状况，而且血浆中药物浓度的数据报道较多，可供借鉴。
体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证
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萃取小柱一次性使用，防止交叉污染！
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固相萃取操作一般有五步：
活化——甲醇/乙腈 润湿小柱，活化填料； 平衡——水或适当缓冲液冲洗平衡小柱； 上样——将样品转移上柱，抽去废液； 淋洗——水或缓冲液最大程度洗去干扰物； 洗脱——用小体积的溶剂将被测物质洗脱下来并收集。
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实际应用中，多是取50uL的血浆，加入500uL的有机溶 剂，涡旋离心后，取上清进样；
若沉淀后，信号相应不好，可尝试更换有机溶剂或者 在沉淀时，加入酸或碱，调节pH值，可能会对结果影 响很大；
常用的酸碱有：盐酸，甲酸，乙酸，氨水等。
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优点：操作简单，为方法开发中最先考虑使用的。
尿液中药物浓度较高，但尿液浓度受尿量的影响，通常变 化较大，应测定一定时间内排入尿中药物的总量。
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5 唾液
唾液中所含成分比较简单，且容 易获得，但是只有少数药物的唾 液浓度和血浆游离药物浓度具有 相关性，实际使用不多，当药物 血浆结合率高的时候，唾液中药 物的浓度极低，很难检测。
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HPLC中化学衍生化法，包括柱前衍生化和柱后衍生化两 种方法。
柱前衍生化分析前尽可能将药物进行提取分离后再衍生 化，防止其他含有相同的功能基团的杂质也被衍生化， 影响分离。柱后衍生化是药物经色谱柱分离之后进行的 ，所以可形成对检测器具有高灵敏度的衍生物。
HPLC法常用的衍生化试剂有邻苯二醛、丹磺酰氯、荧胺 等。
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1.沉淀蛋白
①有机溶剂沉淀法 加入水溶性的有机溶剂，可使蛋白质的分子内及分子间
样本前处理规范(人)
样本前处理规范(人)采集好的样本应尽快在采集处或者转移至处理中心进行前期处理。
不同类型、不同研究目的的样本前处理的方法不同，处理人员应严格按照标准操作规程进行。
1.血液样本血液样本采集完毕，需要尽快对样本进行前期处理。
样本处理前的冷藏最好不超过4h，以尽量降低凝血反应的影响。
不能在采集地点立刻进行前期处理的样本也应低温冷藏尽快转移至处理中心处理。
采集的全血经过分离后成为血清、血浆和血沉棕黄层等血液成份进行样本储存或继续进行提取DNA、蛋白质等样本制备。
1.1全血1.1.1采集的血液样本如不进行成分的分离，直接用于全血的储存，也需要稍作前期处理。
抗凝的血液应被快速地冷冻上。
如果需要完整的血细胞，则需要使用二甲基亚砜(DMSO)以确保在冷冻时细胞是存活的。
1.1.2血液按要求分装到统一规格的无菌冻存管中，加入DMSO混合均匀后将冻存管放入冷冻冰箱中。
在至少4小时候后，才能转移到-80℃或更低温条件下储存。
1.2血浆、血沉棕黄层和红细胞1.2.1用途用EDTA管和ACD管采集的血液，经离心后可以分为三层：上层的血浆，中层的血沉棕黄层，下层的红细胞。
血浆可以用于生物鉴定，DNA提取，蛋白质组学分析和生物标志物发现等研究。
血沉棕黄层是一层很薄的、灰白色的白细胞和血小板层，可以用于DNA的提取和细胞系的产生。
1.2.2处理方法1)4℃下离心真空采血管(大约5ml)，使血浆从血细胞中分离；2)用70%的酒精对采血管顶端和管盖进行清理消毒后，取出上层血浆(约3ml)，分至5-6个标记好的冻存管中，每管500ul(每管分装的体积可视具体情况而定)；3)取出中层的血沉棕黄层(约200ul)，平均分至2个标记好的冻存管中；4)将下层红细胞转移至标记好的冻存管中；5)将上述冻存管放入液氮中快速冷冻，对于白细胞层最好使用程序降温法进行冷冻；6)冷冻好的样本储存在-80℃或液氮环境中。
1.3血清、血凝块采集到没有抗凝血剂离心管中的血液室温下会在30分钟内自动分成两相，固相含有纤维蛋白和细胞，液相则含有血清。
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0
0.08 0.36 1.66 1.63 3.92 1.50 1.84
偶极矩越小，极性越小
固相提取法
◇HLB(Hydrophilic-Lipophilic Balance Copolymer)材料的优点
△水可浸润 △反相保留 △PH1-14范围内稳定 △没有裸露硅羟基
Tips
1、表面活性剂需确立一个浓度范围而不是单一浓度。 2、样本已经采集，考虑将待测物从容器中解离出来。
两相的分离需借助两相的密度差来实现 原理：相似相溶 分配系数：kA=yA/xA yA和xA分别表示在萃取相和萃余相中的质量比率 选择性系数（分离系数）：β=kA/kB= x / x 萃取剂的选择：
AHale Waihona Puke y A / yBB
1、选择性好：表现为选择性系数大。2、萃取容量大：表现为分配系数大。3、
萃取剂与原溶剂的互溶度。4、萃取剂和原溶剂有较大的密度差。5、化学稳定性
耐酸耐碱、抗氧化还原、耐热、无腐蚀。6、安全性好。7、经济性好。 Tips: PH和温度对萃取有一定影响。
常用液液提取溶剂
溶剂名称 二氯甲烷 乙酸乙酯 氯代正丁烷 分子量 84.9 88.1 92.6 沸点（℃） 40 77.1 77 密度（g/mL) 1.33 0.90 0.89 偶极矩（D) 1.60 1.78
固相提取法
固相提取法
固相提取法
改变化合物PH，酸性 保留，碱性洗脱
固相提取法
改变化合物PH，碱性 保留，酸性洗脱
固相提取法
改变吸附剂PH，碱性 保留，酸性洗脱
固相提取法
改变吸附剂PH，酸性 保留，碱性洗脱
LC-MS-MS方法需考虑的问题
◇基质效应
※样品中除被检测化合物外的成分，对化合物测定造成影响的效应。 ※两种方式检测基质效应：柱后灌流法（定性），样品处理比较法（定量）。 ※解决方案： 1、改变样品前处理方法。（液液提取和固相提取法可降低基质效应） 2、优化色谱条件。（将干扰物和待测物分离） 3、优化质谱条件。（更换离子源，APCI源优于ESI源） 4、同位素内标。（终极办法，最有效） 生物基质中的磷脂化合物易导致基质效应，大多数表现为基质抑制。 建议：LC-MS-MS方法时监测 m/z184 → m/z184离子对。
乙醚
戊烷
74.1
72.2
34.5
36.1
0.71
0.63
1.15
0
环己烷
正己烷 甲苯 异丙醇* 四氢呋喃* 乙腈* 正丁醇* 水*
注：“*”表示与水互溶
84.2
86.2 92.2 60.1 72.1 41.1 74.1 18.0
80.7
69 110.6 82.4 66 81.6 117 100
0.78
高，但选择性差，基质效应严重
4、液液提取法：基质效应降低，低成本，重复性好；但难以自动化，
不适用于水溶性化合物的提取，极性相差较大的化合物同时提取困难
5、固相萃取法：可实现自动化，基质效应降低，同时完成样品的富
集与净化；但成本较高
液液提取法
利用目标化合物在生物基质和与水不互溶的有机溶剂中溶解度或分配 系数的不同，使化合物从生物基质中转移至有机相中。
范亚新
简介
富集样品，提高检测方法灵敏度
最终进样提取物与流动相及色谱柱兼容
生物基质样品太“脏”：各类生物基质中存在大量蛋白、盐 分和磷脂类化合物等，可能干扰目标化合物的测定
前处理技术
1、直接稀释法：简单、回收率高、成本低，但选择性差，应用有限 2、超滤法：多用于测定游离药物浓度
3、蛋白沉淀法：几乎适用于所有小分子化合物，简单快速，回收率
LC-MS-MS方法需考虑的问题
◇非特异性吸附
※在低蛋白含量的生物基质（尿液，脑脊液，透析液等）中，化合物在存放/转移 过程中与容器材料发生特异性结合的现象。 ※在相应的生物基质中或水中测试，做转管实验。 ※通常更换储存材料，或者在基质中加入一定量表面活性剂可消除非特异性吸附现象。 常见表面活性剂：Triton-X-100，吐温等